基于三甲基苯磺酰羥胺消除反應的氧連接氮乙酰葡萄糖胺修飾肽段的精準鑒定

郭志新, 李 航, 秦偉捷

(軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 國家蛋白質(zhì)科學中心(北京), 蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室, 北京 102206)

氧連接氮乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,它廣泛參與機體的眾多生命活動,而其穩(wěn)態(tài)的破壞與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等[1-7]。大規(guī)模富集鑒定O-GlcNAc修飾蛋白有助于深度挖掘其生物學功能及相關(guān)疾病機制。由于O-GlcNAc糖基化修飾豐度低、形成的糖苷鍵不穩(wěn)定等[8],O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集鑒定面臨一定挑戰(zhàn)。因此,發(fā)展高效的O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段富集鑒定新方法是對其深入研究的關(guān)鍵。

非天然糖代謝標記技術(shù)作為蛋白質(zhì)糖基化研究的通用技術(shù)被廣泛應用于O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集鑒定[9-12]。非天然糖通常攜帶一個生物正交化學報告基團(如疊氮),其親水性羥基常以疏水性的乙酰基包裹保護,從而增強非天然糖的細胞攝取。全乙酰化的非天然糖進入細胞后通過細胞內(nèi)糖代謝途徑轉(zhuǎn)化為相應底物尿苷二磷酸-氮乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAz),進而被O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(OGT)識別并整合在目標蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸羥基上，隨后可通過特異性的生物素探針捕捉目標蛋白質(zhì),實現(xiàn)O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集鑒定[13]。然而,最新研究表明,在細胞代謝標記過程中,全乙?；姆翘烊惶菚瑫r標記半胱氨酸的巰基而產(chǎn)生半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物[14-17],并且在蛋白質(zhì)或肽段層面的O-GlcNAc糖基化修飾鑒定結(jié)果中,難以排除副反應產(chǎn)物半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的干擾。因此,建立一種特異性去除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的方法具有十分重要的意義。

近年來,三甲基苯磺酰羥胺(MSH)被廣泛應用于蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基修飾物的氧化消除。MSH是一種氧化及胺化試劑,它可以提供游離的氨基以進攻硫醚中的親核性硫原子,在一定堿性條件下轉(zhuǎn)化為亞硫亞胺中間體,進而發(fā)生消除反應生成烯烴產(chǎn)物[18]。Davis課題組[19]在pH=8的溫和體系下,利用MSH氧化消除絲氨酸蛋白酶突變體S-乙基半胱氨酸中的硫醚鍵,成功將其轉(zhuǎn)化為脫氫丙氨酸。隨后,MSH氧化消除法又被成功應用于半胱氨酸巰基-微囊藻毒素修飾物中硫醚鍵的斷裂[20]。在此基礎(chǔ)上,本研究發(fā)展了MSH特異性消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的方法,實現(xiàn)了細胞中O-GlcNAc糖基化修飾肽段的精準鑒定,為非天然糖代謝標記技術(shù)在糖蛋白組學分析中的應用提供了新的研究策略。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultrafle Xtreme MALDI TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀(Bruker公司,德國), EASY Nlc 1 200 Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀、HERAcell VIOS 160i細胞培養(yǎng)箱、MSC-100 Thermo-Shaker恒溫振蕩金屬浴、Micro 21微量離心機、Nano Drop 2000C超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司,美國), Concentrator Plus真空離心濃縮儀(Eppendorf公司,德國), Sartorius BP211d分析天平(Sartorius公司,德國), LX-200型迷你離心機(海門市其林貝爾儀器制造有限公司,江蘇)。

細胞低糖培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。O-GlcNAc水解酶抑制劑(Thiamet G)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自美國Corning公司。二甲基亞砜(DMSO)購自北京百靈威科技有限公司。疊氮全乙?；肴樘前?Ac4GalNAz)、核質(zhì)蛋白提取試劑盒、三苯基磷-生物素探針、鏈霉親和素磁珠和表面活性劑去除柱均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。十二烷基磺酸鈉(SDS)購自美國USB公司。MSH購自上海易恩化學技術(shù)有限公司。鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl, 1 mol/L, pH=7.4)購自北京索萊寶科技有限公司。碳酸氫銨(NH4HCO3)、甲酸(FA)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)和乙基苯基聚乙二醇(NP-40)均購自德國Sigma Aldrich公司。磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鈉(NaCl)、碳酸鈉(Na2CO3)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。所有化學試劑均為分析級或HPLC級,不經(jīng)額外純化直接使用。

1.2 MSH氧化消除反應的建立

1.2.1半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的制備

首先取30 μg巰基標準肽段溶于23 μL碳酸鈉緩沖液(25 mmol/L, pH=10)中,然后加入終濃度2 mmol/L的Ac4GalNAz,于37 ℃恒溫箱孵育90 min,然后經(jīng)C18柱脫鹽熱干備用,待MALDI-TOF MS分析。

1.2.2MSH氧化消除

將上述制備的半胱氨酸巰基人為修飾物復溶于15 μL磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8),測定濃度后取出4 μg加入磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)至終體積40 μL,取出5 μL作為實驗對照組備用。

將1 μg疊氮標記的O-GlcNAc(N3-O-GlcNAc)標準肽段溶于磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)中,配至終體積40 μL,取出5 μL作為實驗對照組備用。

剩余樣品中分別加入終濃度15 mmol/L的MSH,于室溫快速渦旋1 min后,隨后置于95 ℃避光振蕩反應30 min,反應前后均采用MALDI-TOF MS進行分析。

1.3 Hela細胞中O-GlcNAc修飾肽段的富集

1.3.1Hela細胞代謝培養(yǎng)

待Hela細胞生長狀態(tài)良好時進行代謝培養(yǎng):在10 mL細胞低糖培養(yǎng)基中加入終濃度100 μmol/L的Ac4GalNAz,再加入終濃度10 μmol/L的Thiamet G備用。移去Hela細胞的原培養(yǎng)基,用PBS清洗細胞兩次,加入配制的低糖培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.3.2核質(zhì)蛋白提取及酶切

收集的細胞于4 ℃以2 000 g離心3 min后移去上清液,使用核質(zhì)蛋白提取試劑盒提取核質(zhì)蛋白。首先向細胞加入1 000 μL細胞質(zhì)蛋白提取試劑I,以2 500 r/min渦旋15 s懸浮沉淀,于冰上放置10 min后加入55 μL細胞質(zhì)蛋白提取試劑II,以2 500 r/min渦旋5 s,再于冰上放置1 min,以2 500 r/min渦旋5 s,隨后于4 ℃以16 000 g離心5 min,轉(zhuǎn)移上清胞質(zhì)提取物至離心管。在剩下的組分中加入500 μL細胞核蛋白提取試劑,以2 500 r/min渦旋15 s,冰上放置10 min,重復操作4次,于4 ℃以16 000 g離心10 min,轉(zhuǎn)移上清至離心管,合并兩次上清液,即為核質(zhì)蛋白。

將提取的核質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)移至10 kDa超濾管,以14 000 g離心15 min,用50 mmol/L NH4HCO3溶液清洗4次,檢測蛋白質(zhì)濃度。在核質(zhì)蛋白中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶50),于37 ℃恒溫箱酶切16 h,酶切后以14 000 g離心10 min,收集肽段,并用水清洗超濾管兩次。收集的肽段于45 ℃真空熱干后置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3酶切肽段的氧化消除

熱干的肽段用磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)復溶,并測定其濃度。隨后將肽段溶液稀釋至1 μg/μL,取400 μL加入終濃度15 mmol/L的MSH,室溫快速渦旋1 min后于95 ℃避光振蕩反應30 min。反應完成后用C18柱脫鹽,于45 ℃真空熱干備用。

1.3.4N3-O-GlcNAc修飾肽段的富集及洗脫

取鏈霉親和素磁珠50 μL,棄去保護液,用300 μL PBS清洗4次,備用。熱干的肽段用100 μL PBS復溶,加入終濃度200 μmol/L的三苯基磷-生物素探針于37 ℃恒溫箱孵育過夜,標記N3-O-GlcNAc修飾肽段。使用0.5 mL表面活性劑去除柱去除未反應的三苯基磷-生物素探針。生物素標記后的肽段補加PBS至終體積672 μL,并加入28 μL含100 g/L SDS的水溶液,然后將其全部轉(zhuǎn)移至磁珠中,室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h,孵育結(jié)束后,棄去上清液。

稱取146.2 mg NaCl和70.9 mg Na2HPO4,溶于25 mL水中,并加入25 mL Tris-HCl，配制為緩沖液A;依次使用300 μL含0.2% (v/v)NP-40的緩沖液A、300 μL緩沖液A及300 μL水分別清洗磁珠2次;然后加入80 μL含0.15% (v/v)TFA的水溶液,于95 ℃煮10 min,取洗脫液于離心管中;繼續(xù)用80 μL含0.15% (v/v) TFA的水溶液及80 μL洗脫液TFA-ACN-H2O(1∶50∶49, v/v/v)分別清洗磁珠1次;洗脫液合并過C8膜后于45 ℃真空熱干,熱干后置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分析條件

1.4.1MALDI-TOF MS

將DHB溶于H3PO4-ACN-H2O(1∶29∶70, v/v/v)溶液,配制成25 mg/mL的DHB基質(zhì)溶液。將1 μL樣品及1 μL DHB基質(zhì)溶液混合點于靶板上后室溫干燥,采用陽離子反射模式在20 kV加速電壓下進行譜圖采集。

1.4.2LC-MS/MS

流動相A和B分別為含0.1%(v/v) FA的水溶液和FA-H2O-ACN (1∶19∶80, v/v/v)。富集的肽段用流動相A復溶,以600 nL/min通過C18反相分析柱(150 mm×0.15 mm, 1.9 μm)實現(xiàn)樣品分離。洗脫程序為:0～8 min, 6%B～12%B; 8～58 min, 12%B～30%B; 58～70 min, 30%B～40%B; 70～71 min, 40%B～95%B; 71～78 min, 95%B。

噴霧電壓設(shè)定為2.3 kV,質(zhì)譜分析的一級掃描范圍設(shè)置為300～1 400 Da,分辨率為120 000;質(zhì)譜的二級譜圖以數(shù)據(jù)依賴型掃描模式(DDA)進行采集,二級碎裂方式為高能誘導解離(HCD),能量設(shè)置為35%,離子注入時間為50 ms。

1.5 數(shù)據(jù)檢索

LC-MS/MS數(shù)據(jù)(Raw文件)使用MaxQuant(版本1.6.17.0)以UniProt人類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(20207-2015.7.21)為參考進行檢索,檢索條件設(shè)置如下:蛋白水解酶設(shè)置為胰蛋白酶,最多允許兩個漏切位點。甲硫氨酸氧化(M),蛋白質(zhì)N-末端乙?；?生物素標簽(Biotin-N3-O-GlcNAc,m/z=994.391 1)以及半胱氨酸巰基人為修飾物消除(-H2S,m/z=-33.987 7)均設(shè)置為可變修飾。母離子的最大質(zhì)量容差設(shè)置為2.0×10-5mg/L,碎片離子的最大質(zhì)量容差設(shè)置為0.5 Da,蛋白質(zhì)和肽段譜圖匹配的假陽性率(FDR)水平均設(shè)置為1%。

2 結(jié)果與討論

2.1 半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的構(gòu)建

研究表明[14],在堿性條件下,全乙?；姆翘烊粏翁强苫谶~克爾加成原理與半胱氨酸的巰基發(fā)生反應,生成半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物?；诖?實驗采用碳酸鈉緩沖液(200 mmol/L, pH=10),利用Ac4GalNAz于37 ℃孵育巰基標準肽段90 min,構(gòu)建半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(見圖1a)。孵育產(chǎn)物的MALDI-TOF MS分析結(jié)果如圖1b所示,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)被成功檢測。通常,Ac4GalNAz體外孵育巰基標準肽段的產(chǎn)物多為二乙?；腚装彼釒€基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694),在堿性條件下乙?；l(fā)生部分水解,而產(chǎn)生單乙酰化的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 422.683)。以上結(jié)果表明半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的成功構(gòu)建。

圖 1 (a)Ac4GalNAz孵育巰基肽段的反應式和(b)反應產(chǎn)物的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 1 (a) Reaction diagram of thiol peptide incubated with tetraacetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) and (b) MALDI-TOF MS spectrum of reaction products

2.2 半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的氧化消除

MSH作為一種氧化及胺化試劑,可潛在用于半胱氨酸巰基修飾物的氧化消除。在此基礎(chǔ)上,實驗將上述構(gòu)建的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物作為底物,探究MSH氧化消除反應的最佳反應條件。如圖2所示,在適宜的反應條件下,MSH可進攻半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的親核性硫原子,引發(fā)氧化消除反應,生成目標消除產(chǎn)物(m/z=1 102.604)。為了避免強烈的堿性條件對O-GlcNAc糖基化修飾的破壞,實驗首先確定了溫和的磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)體系,并且MSH在該體系下具有較高的熱穩(wěn)定性[21]。由于升高反應溫度有利于反應物分子吸收能量、促進反應的快速進行,實驗考察了不同反應溫度對MSH氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的影響。實驗利用過量的MSH分別于4、20、50、80及95 ℃條件下處理半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物30 min(見表1)。MALDI-TOF MS分析結(jié)果(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com)顯示,在4、20和50 ℃反應30 min后,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)依舊有較高的信號強度,且未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物峰,說明反應未發(fā)生;在80 ℃反應30 min后,目標消除產(chǎn)物峰(m/z=1 102.604)部分生成,但半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)仍存在,表明氧化消除反應不完全;而在95 ℃反應30 min后,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物峰(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)完全消失,并且目標消除產(chǎn)物峰(m/z=1 102.604)顯示較高的信號強度,表明該半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)已被完全氧化消除。上述實驗結(jié)果表明,當溫度達95 ℃時,MSH可較完全氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。實驗進一步在95 ℃條件下評估了MSH氧化消除反應的反應時長(見表1)。MALDI-TOF MS分析結(jié)果顯示,在95 ℃條件下縮短反應時間,目標消除產(chǎn)物(m/z=1 102.604)部分生成,但半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)仍存在,消除不完全(見附表2)。綜上,實驗采用95 ℃反應30 min的條件實現(xiàn)MSH快速高效地氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。

圖 2 MSH氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物機理Fig. 2 Mechanism of oxidative elimination of cysteine thiol-azidosugar artificial modification with O-mesitylenesulfonylhydroxylamine (MSH)

表 1 MSH于不同條件下氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的反應結(jié)果

為了進一步驗證MSH氧化消除法的可行性,實驗制備了另一個半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 817.750) (見附圖1),并利用MSH于95 ℃避光處理該半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物30 min,理論反應式如圖3a所示;反應后的譜圖如圖3b所示,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 817.750)完全消失,并生成目標消除產(chǎn)物(m/z=1 455.661)。除此之外,圖3b顯示有未知峰(m/z=1 625.267)的生成,該物質(zhì)與推測的實驗潛在副產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量均不匹配(見附圖2)。由于反應體系復雜,未知峰(m/z=1 625.267)的化學分子式難以確定,猜測其是由消除產(chǎn)物衍生形成的副產(chǎn)物。但是,由于未知物(m/z=1 625.267)的相對分子質(zhì)量與半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物及相關(guān)乙?；夥宓南鄬Ψ肿淤|(zhì)量均不相同(見附圖3),該未知物的存在并不會干擾O-GlcNAc糖基化修飾的質(zhì)譜鑒定。綜上,MSH氧化消除法簡單可行,可高效去除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。

圖 3 (a)MSH氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的反應式和(b)反應產(chǎn)物的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 3 (a) Reaction diagram of oxidative elimination of cysteine thiol-azidosugar artificial modification with MSH and (b) MALDI-TOF MS spectrum of reaction products

2.3 N3-O-GlcNAc修飾肽段的穩(wěn)定性考察

為了考察MSH氧化消除反應是否會同時破壞O-GlcNAc糖基化修飾,實驗選用了兩條含N3-O-GlcNAc修飾的標準肽段(m/z=1 333.758和m/z=1 354.707) (見附圖4)進行測試。兩條N3-O-GlcNAc標準肽段分別經(jīng)MSH在95 ℃條件下避光處理30 min,并采用MALDI-TOF MS分析。對比反應前、后的質(zhì)譜圖(見圖4),兩條N3-O-GlcNAc標準肽段峰經(jīng)MSH處理后仍穩(wěn)定存在,表明MSH氧化消除反應不會破壞N3-O-GlcNAc糖基化修飾。在后續(xù)復雜的生物代謝樣本中,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物與O-GlcNAc糖基化修飾肽段同時存在,該策略可在消除巰基-疊氮糖人為修飾物的同時,進一步保證內(nèi)源O-GlcNAc糖基化修飾肽段在MSH氧化消除反應中的穩(wěn)定性。因此,MSH氧化消除法可以應用于細胞中O-GlcNAc糖基化修飾肽段的富集鑒定。

圖 4 兩條N3-O-GlcNAc肽段在MSH處理前、后的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 4 MALDI-TOF MS spectra of two N3-O-GlcNAc peptides before and after treated with MSH

2.4 O-GlcNAc修飾肽段的精準鑒定

O-GlcNAc糖基化修飾是一種動態(tài)可逆的翻譯后修飾,它參與許多重要的生物信號通路。研究表明,細胞質(zhì)和細胞核中的多種蛋白質(zhì)會發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾[22,23]。為了深入了解O-GlcNAc糖基化修飾蛋白的生物學功能,實驗選取Ac4GalNAz代謝Hela細胞后的核質(zhì)蛋白作為研究對象?；诤唵坞亩螌用?MSH特異性氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物方法的成功構(gòu)建,實驗利用MSH氧化消除核質(zhì)蛋白中的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物,并鑒定到51條半胱氨酸巰基人為修飾消除產(chǎn)物肽段。該鑒定結(jié)果證明,在細胞代謝樣本中,MSH氧化消除法可以去除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的假陽性干擾,從而實現(xiàn)O-GlcNAc糖基化肽段的精準鑒定。最終,實驗利用生物素探針以及鏈霉親和素磁珠富集鑒定核質(zhì)蛋白中的N3-O-GlcNAc糖基化修飾肽段。通過質(zhì)譜鑒定分析,在3次重復實驗中成功富集鑒定到157條O-GlcNAc修飾肽段,歸屬于130個蛋白質(zhì)。進一步的基因本體分析顯示(見圖5),富集的O-GlcNAc糖基化修飾蛋白主要分布于突觸后密度、細胞質(zhì)以及核染色體,主要參與細胞分裂、興奮性突觸后電位及微管運動等通路。其中,與轉(zhuǎn)移酶活性、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性以及微管結(jié)合等功能相關(guān)的O-GlcNAc糖基化修飾蛋白被顯著富集,與文獻[8,24,25]相符。以上結(jié)果表明,O-GlcNAc糖基化修飾蛋白廣泛分布于細胞不同區(qū)室,在機體的多項生命活動中發(fā)揮著重要作用。

圖 5 O-GlcNAc糖基化修飾蛋白的基因本體分析Fig. 5 Gene ontology analysis of O-GlcNAcylation proteinsP-value: significance level of enrichment.

3 結(jié)論

本研究發(fā)展了MSH特異性氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的方法,在保護O-GlcNAc糖基化修飾肽段的同時,特異性消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。MSH氧化消除法操作簡單,反應高效。該方法被成功應用于消除Ac4GalNAz代謝Hela細胞中產(chǎn)生的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物,最終在Hela細胞核質(zhì)蛋白中成功富集鑒定到157條O-GlcNAc修飾肽段,歸屬于130個蛋白質(zhì),并通過基因本體分析獲取了O-GlcNAc糖基化修飾蛋白潛在的生物學功能。本研究成功消除了全乙酰化非天然單糖細胞代謝產(chǎn)物中的副產(chǎn)物,去除了其對O-GlcNAc糖基化修飾肽段富集鑒定的干擾,實現(xiàn)了細胞中O-GlcNAc糖基化修飾肽段的精準富集鑒定,為非天然糖代謝標記技術(shù)在糖蛋白組學分析中的應用提供了新的研究策略。