32份茶樹(shù)地方群體種資源的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析

李長(zhǎng)樂(lè)，葛悅，閆美琳，李慧，林青青，王璞，趙華，王明樂(lè)，王郁，郭飛，倪德江

32份茶樹(shù)地方群體種資源的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析

李長(zhǎng)樂(lè)，葛悅，閆美琳，李慧，林青青，王璞，趙華，王明樂(lè)，王郁，郭飛*，倪德江

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070

選取均勻分布于茶樹(shù)15個(gè)連鎖群上的30對(duì)SSR引物，對(duì)來(lái)自12個(gè)省份的32份茶樹(shù)群體種資源進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，以期為茶樹(shù)雜交育種親本選擇和演化路線推斷提供參考。研究共獲得149個(gè)等位基因，平均每個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)到5.96個(gè)等位基因，引物多態(tài)性信息含量均值為0.660。32個(gè)茶樹(shù)群體Shannon’s多樣性指數(shù)范圍為0.691～1.089，平均數(shù)為0.954；觀測(cè)雜合度的范圍為0.253～0.633，平均數(shù)為0.510；期望雜合度范圍為0.430～0.653，平均數(shù)為0.590。供試茶樹(shù)群體遺傳分化系數(shù)（）均值為0.205，遺傳分化水平較高?；贜ei’s遺傳距離的聚類和群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致，供試種質(zhì)可劃分為四大類型，具有明顯的地域分布規(guī)律。

群體品種；SSR分子標(biāo)記；群體結(jié)構(gòu)；遺傳多樣性；演化路線

茶樹(shù)在我國(guó)分布廣泛，經(jīng)歷了長(zhǎng)期的自然選擇及人工馴化和栽培過(guò)程，形成了豐富多樣的種質(zhì)資源?，F(xiàn)有的茶樹(shù)品種基本分為有性系品種和無(wú)性系品種兩大類，有性系品種用種子繁殖，又稱“群體品種”，群體品種包含的個(gè)體類型豐富，是天然的種質(zhì)資源庫(kù)。

近年來(lái)，隨著茶產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，發(fā)掘和保護(hù)優(yōu)異茶樹(shù)種質(zhì)資源的重要性日益凸顯，關(guān)于茶樹(shù)種質(zhì)資源方面的文獻(xiàn)越來(lái)越多，從表型性狀、內(nèi)含成分、適制茶類到細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因序列的研究均有報(bào)道[1-4]。分子標(biāo)記揭示的是基因組層面上DNA序列的差異，相對(duì)于形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記等，受外界環(huán)境因素影響小。1980年至今，越來(lái)越多的分子標(biāo)記技術(shù)成功用于茶樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定和分類研究[5-7]。在茶樹(shù)中廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（RFLP）、擴(kuò)展片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）等[8-10]。SSR是第二代分子標(biāo)記，技術(shù)成熟，穩(wěn)定可靠，獲取途徑便捷，且具有共顯性、單個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、數(shù)量豐富等特點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于茶樹(shù)種質(zhì)的遺傳多樣性評(píng)估、親緣關(guān)系鑒定、群體結(jié)構(gòu)劃分、指紋圖譜構(gòu)建等[11-12]。黃丹娟[13]對(duì)我國(guó)茶樹(shù)品種的遺傳多樣性水平進(jìn)行分析，從128個(gè)SSR標(biāo)記中篩選出2套核心引物，認(rèn)為分析254個(gè)茶樹(shù)品種遺傳多樣性至少需要用30對(duì)SSR引物。姜曉輝等[14]利用毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)廣東茶樹(shù)群體種質(zhì)進(jìn)行研究、聚類，綜合分析了其遺傳結(jié)構(gòu)并推測(cè)了其可能的基因交流情況。楊軍等[15]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)福建茶樹(shù)種質(zhì)資源展開(kāi)研究，將供試樣品劃分類群并鑒定了親緣關(guān)系。姚明哲等[16]對(duì)四川和重慶茶樹(shù)群體種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)川、渝茶樹(shù)群體種在群體結(jié)構(gòu)上有較明顯的差異，推測(cè)出這兩地種質(zhì)可能具有不同的演化和傳播途徑。Zhao等[17]利用14個(gè)SSR分子標(biāo)記分析了大理茶中25個(gè)居群內(nèi)587個(gè)茶樹(shù)個(gè)體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)各居群內(nèi)部水平上野生居群遺傳多樣性的減少和遺傳漂變的發(fā)生高于馴化居群。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)茶樹(shù)群體種資源的各方面做了大量研究，但對(duì)于全國(guó)范圍內(nèi)多省份茶樹(shù)種質(zhì)資源的綜合研究相對(duì)較少，難以從整體范圍去考量、發(fā)掘不同地區(qū)群體種資源的關(guān)聯(lián)與差異性。茶樹(shù)地方群體品種是茶樹(shù)種質(zhì)資源的重要組成部分，也是優(yōu)質(zhì)茶樹(shù)選育的重要材料。本研究基于SSR分子標(biāo)記對(duì)來(lái)自12個(gè)省份的32份茶樹(shù)地方群體品種進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究，以期揭示不同地區(qū)茶樹(shù)種質(zhì)親緣關(guān)系和地域分布規(guī)律，為優(yōu)異茶樹(shù)種質(zhì)資源的發(fā)掘和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為來(lái)自全國(guó)12個(gè)省份（包含32個(gè)地區(qū)）的茶樹(shù)地方群體品種，課題組前期從各個(gè)產(chǎn)區(qū)實(shí)地考察、收集茶籽，統(tǒng)一播種、定植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)試驗(yàn)基地。分子標(biāo)記樣品為單株取樣，以前期整理的供試地方群體品種典型形態(tài)學(xué)特征為參照，每個(gè)群體種選擇6株代表性植株，共計(jì)192株單株，分別采集各單株幼嫩組織并儲(chǔ)藏于–80℃冰箱備用。供試群體名稱、來(lái)源、編號(hào)等信息見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及SSR引物信息

茶樹(shù)基因組DNA的提取使用CTAB法；提取所得DNA樣品的濃度和質(zhì)量使用超微量分光光度計(jì)和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；試驗(yàn)所用的30對(duì)引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列參照文獻(xiàn)[13]。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系（10?μL）：10?μmol·L-1的正反向引物各0.5?μL，2×Taq PCR MasterMix（Taq DNA Polymerase、MgCl2、dNTPs）5?μL，300?ng·μL-1的DNA模板1?μL，滅菌超純水3?μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3?min；94℃變性30?s，各引物退火溫度退火30?s，72℃延伸30?s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min，擴(kuò)增完畢于4℃冰箱保存。

表1 供試材料的名稱及原產(chǎn)地

1.2.3 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳系統(tǒng)為QIAxcel Advanced全自動(dòng)核酸分析儀，預(yù)制膠卡夾為QIAxcel DNA High Resolution Kit（1200），運(yùn)行方法為OM800，吸取時(shí)間選擇10?s。運(yùn)行結(jié)束后，保存電泳結(jié)果的峰圖和膠圖進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用人工讀帶方法根據(jù)擴(kuò)增條帶分子量大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有清晰目標(biāo)條帶記為“1”，無(wú)清晰目標(biāo)條帶的記為“0”，生成“0、1”數(shù)據(jù)矩陣。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

不同軟件分析所需要數(shù)據(jù)格式的轉(zhuǎn)換通過(guò)DataFormate實(shí)現(xiàn)；使用Popgen 32軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、中性檢驗(yàn)、各項(xiàng)遺傳參數(shù)估算、遺傳距離和遺傳一致度計(jì)算；遺傳多樣性指數(shù)（值）計(jì)算公式為12，式中表示第個(gè)等位基因位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率[18]；根據(jù)Nei’s遺傳距離和鄰接法（Neighbor-joining method），利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

應(yīng)用Structure 2.3對(duì)供試茶樹(shù)材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，假定群體數(shù)目（K值）為1～15，各位點(diǎn)相互獨(dú)立，將蒙特卡羅算法開(kāi)始時(shí)的不作數(shù)迭代次數(shù)（Length of burn-in period）設(shè)為50?000，將不作數(shù)迭代數(shù)的MCMC設(shè)為50?000，每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行10次。以似然值最大原則，根據(jù)在線軟件Structure Harvester計(jì)算結(jié)果確定最佳分組K值，進(jìn)而得到最優(yōu)群體結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的多態(tài)性信息量

用30對(duì)引物對(duì)供試的茶樹(shù)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，其中有25對(duì)均勻分布于15條染色體上的SSR引物擴(kuò)增效果較好，能夠擴(kuò)增出清晰的條帶，且擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)后能產(chǎn)生較好的多態(tài)性。引物TM209的部分毛細(xì)管電泳圖譜如圖1所示。

使用Popgene 32軟件對(duì)供試茶樹(shù)群體的25對(duì)SSR位點(diǎn)進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)和中性測(cè)試分析（設(shè)置1?000次重復(fù)）。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)可以評(píng)估供試群體與遺傳平衡群體之間的偏離程度，是評(píng)估群體其他計(jì)算數(shù)據(jù)是否可靠的一種手段[19]。對(duì)茶樹(shù)群體毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(yàn)，800組數(shù)據(jù)中僅有136組顯著偏Hardy-Weinberg平衡，且散落分布在不同群體的不同位點(diǎn)上，意味群體評(píng)估數(shù)據(jù)相對(duì)可靠。中性測(cè)試分析結(jié)果顯示，25對(duì)SSR位點(diǎn)中有6對(duì)位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)量觀測(cè)值（）略偏離95%置信區(qū)間，其余19對(duì)SSR位點(diǎn)觀測(cè)值均在95%置信區(qū)間范圍內(nèi)，表明這些基因座大多為中性基因，不受自然選擇和其他因素的影響，可用于茶樹(shù)群體遺傳多樣性分析（表2）。

利用25對(duì)SSR高多態(tài)性引物擴(kuò)增結(jié)果對(duì)來(lái)自32份茶樹(shù)群體的192個(gè)單株進(jìn)行遺傳多樣性分析，共獲得149個(gè)等位基因，其中最多為10個(gè)，最少為4個(gè)，平均為5.96個(gè)；有效等位基因數(shù)在1.786～5.532，平均為3.424個(gè)（表3）。值通常反映引物的多態(tài)性程度，當(dāng)值＞0.5時(shí)，為高度多態(tài)性；當(dāng)0.25＜值＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)性；當(dāng)值＜0.25時(shí)，表現(xiàn)為低度多態(tài)性[20]。供試樣品的值變化范圍較大（0.440～0.819），平均值為0.660，說(shuō)明本研究中所選出的25對(duì)引物總體上存在較高的多態(tài)性，適用于茶樹(shù)種質(zhì)資源的鑒定。觀察雜合度（）和期望雜合度（）的范圍在0～1（0表示無(wú)多態(tài)性；1表示無(wú)限多個(gè)等位基因具有相同頻率），供試群體的位于0.214～0.750，平均值為0.510；位于0.441～0.821，平均值為0.681。表明在整體水平上，供試茶樹(shù)群體具有較高的遺傳多樣性。

2.2 茶樹(shù)群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 不同地區(qū)茶樹(shù)群體遺傳多樣性分析

如表4所示，32個(gè)茶樹(shù)群體的觀測(cè)等位基因數(shù)（）范圍為2.760～3.760，平均觀測(cè)等位基因數(shù)為3.318；有效等位基因數(shù)（）的范圍為1.813～2.794，平均有效等位基因數(shù)為2.445；Shannon’s多樣性指數(shù)（）范圍為0.691～1.089，平均數(shù)為0.954；觀測(cè)雜合度（）的范圍為0.253～0.633，平均數(shù)為0.510；期望雜合度（）范圍為0.430～0.653，平均數(shù)為0.590。32個(gè)茶樹(shù)群體中有30個(gè)群體的觀測(cè)雜合度小于期望雜合度，說(shuō)明茶樹(shù)群體內(nèi)存有一定程度的近交現(xiàn)象，導(dǎo)致純合子過(guò)量。多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為23～25個(gè)，說(shuō)明各群體的遺傳多樣性水平較高。

圖1 引物TM209的部分毛細(xì)管電泳圖譜

表2 25個(gè)位點(diǎn)中性檢測(cè)信息

2.2.2 茶樹(shù)群體遺傳分化分析

對(duì)茶樹(shù)群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析，結(jié)果如表5所示。25個(gè)SSR位點(diǎn)的基因流均值為0.969，約等于1，其中14個(gè)位點(diǎn)的基因流小于1，11個(gè)位點(diǎn)基因流大于1，說(shuō)明茶樹(shù)各群體內(nèi)和群體間都存在一定程度的遺傳分化，這可能與茶樹(shù)作為經(jīng)濟(jì)作物受到人為干預(yù)較多以及茶樹(shù)異花授粉、自交不親和的特性有關(guān)。其總?cè)后w固定指數(shù)（）的范圍在0.022～0.660，平均值為0.250。群體內(nèi)固定系數(shù)（）平均值為0.056，接近于0，表明群體可能是Hardy-Weinberg隨機(jī)交配群體[21]。群體間遺傳分化系數(shù)（）為0～＜0.05時(shí)，群體間具有低水平遺傳分化；位于0.05～＜0.15時(shí)，群體間具有中等水平遺傳分化；位于0.15～＜0.25時(shí)，群體間具有較高水平遺傳分化[22]。本研究供試茶樹(shù)群體遺傳分化系數(shù)（）均值為0.205，說(shuō)明群體間遺傳分化水平較高。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析及群體結(jié)構(gòu)劃分

基于供試樣品兩兩之間的Nei’s遺傳距離矩陣，應(yīng)用鄰接法對(duì)32份資源進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）。其中來(lái)自同一省市不同地區(qū)的茶樹(shù)地方群體品種顯示出了較近的親緣關(guān)系（簇a）：黎家坪群體種和馮家臺(tái)群體種（同屬湖北省恩施市），龍井種和鳩坑種（同屬于浙江省杭州市），黃山種和祁門種（同屬安徽省黃山市）。整體分析結(jié)果表明，32個(gè)供試樣品被劃分為3個(gè)簇，簇a主要包括13份種質(zhì)資源，分別為湖北（3份）、江西（2份）、浙江（2份）、貴州（1份）、安徽（2份）、福建（1份）、河南（1份）、陜西（1份）的種質(zhì)資源；簇b包含12份種質(zhì)資源，分別為江西（5份）、湖北（1份）、湖南（2份）、廣西（1份）、貴州（2份）、云南（1份）的種質(zhì)資源；簇c包括廣西（2份）、廣東（1份）、湖南（2份）、云南（2份）的種質(zhì)資源。

應(yīng)用Structure 2.3對(duì)供試材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，當(dāng)K=2時(shí)，ΔK的數(shù)值最大（圖3）。按照似然值最大的要求分析來(lái)自32個(gè)地區(qū)的茶樹(shù)群體種，可以將其分成2個(gè)遺傳群體，紅色表示亞群A，綠色表示亞群B（圖4-A）。為了進(jìn)一步研究茶樹(shù)群體結(jié)構(gòu)，本研究對(duì)K=4時(shí)的茶樹(shù)群體結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了分析（圖4-B）?；赟tructure 2.3軟件分析得到的茶樹(shù)群體分類結(jié)構(gòu)與根據(jù)Nei’s遺傳距離得到的鄰接聚類分析結(jié)果一致。當(dāng)K=2時(shí)，群體A包括整個(gè)簇c；群體B包含簇a和簇b。當(dāng)K=4時(shí)，整體分類結(jié)構(gòu)也和鄰接聚類分析結(jié)果相符，在K=2時(shí)的分類結(jié)果上進(jìn)一步細(xì)化，增加了亞群C（藍(lán)色）和亞群D（黃色）。

表3 25個(gè)位點(diǎn)多樣性信息

表4 群體遺傳多樣性信息表

綜合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果，供試群體可以劃分為四大類。從原產(chǎn)地來(lái)看，這四大類茶樹(shù)種質(zhì)在地理分布上表現(xiàn)出一定規(guī)律：位于云南的群體種（鳳慶大葉茶、勐庫(kù)大葉茶）單獨(dú)聚為一類；第二類在湖南南部和廣西、廣東區(qū)域集中分布；第三類主要分布在云南、貴州、廣西、湖南、湖北、江西等地，這些地區(qū)位于供試茶區(qū)的中部；第四類主要分布在湖北、江西、福建、陜西、河南、安徽、浙江等地，這些地區(qū)位于供試茶區(qū)的東部和北部末端。

圖3 ΔK隨K值的變化趨勢(shì)

表5 F統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

注：1：石阡苔茶；2：宜春群體種；3：鳩坑種；4：都勻毛尖；5：竹山大黑葉；6：江華苦茶；7：城步峒茶；8：坦洋菜茶；9：上猶群體種；10：龍井種；11：婺源種；12：南山白毛茶；13：修水群體種；14：永修群體種；15：遂川群體種；16：黎家坪群體種；17：浮梁種；18：馮家臺(tái)群體種；19：宜昌大葉茶；20：汝城白毛茶；21：云臺(tái)山種；22：牙己茶；23：信陽(yáng)種；24：黃山種；25：十里香；26：鳥(niǎo)王茶；27：祁門種；28：紫陽(yáng)種；29：勐庫(kù)大葉茶；30：羅坑群體種；31：六堡茶；32：鳳慶大葉茶。下同

注：圖A為K=2，紅色表示群體A，綠色表示群體B。圖B為K=4，紅色表示群體A，綠色表示群體B，藍(lán)色表示群體C，黃色表示群體D。圖C為K=3時(shí)，Structure軟件劃分的A（紅色）、B（綠色）兩個(gè)亞群在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的分布情況。圖D為K=4時(shí)，Structure軟件劃分的A（紅色）、B（綠色）、C（藍(lán)色）、D（黃色）4個(gè)亞群在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的分布情況

3 討論

3.1 引物的多態(tài)性信息量

物種的遺傳多樣性分析是其種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，遺傳多樣性評(píng)價(jià)指標(biāo)易受到供試材料及標(biāo)記方法的影響。本研究利用25對(duì)SSR引物對(duì)來(lái)自不同省份的192個(gè)單株進(jìn)行遺傳多樣性分析，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)和中性測(cè)試結(jié)果表明，所選的位點(diǎn)多為中性位點(diǎn)，各群體供試材料在遺傳水平相對(duì)穩(wěn)定、可靠，有利于茶樹(shù)群體種質(zhì)遺傳多樣性的研究。分析共獲得149個(gè)等位基因，平均每個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)到5.96個(gè)等位基因，引物多態(tài)性信息含量均值為0.660，表現(xiàn)為高多態(tài)性引物，有利于不同遺傳背景供試材料的區(qū)分。與其他研究相比，本研究檢測(cè)到的等位位點(diǎn)數(shù)偏高，這可能是由于本研究中研究材料涵蓋面積廣、類型豐富，且采用的毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法，數(shù)據(jù)較傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)更為靈敏、精確，能區(qū)分3～5?bp的差異，故能檢測(cè)到更多的等位位點(diǎn)。

3.2 供試樣品的遺傳多樣性

喬婷婷[23]對(duì)不同省份茶樹(shù)資源多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)廣西、廣東和云南的資源多樣性偏高，湖南、江蘇、安徽和河南的多樣性偏低。本研究中各省份的遺傳多樣性并沒(méi)有明顯的地域規(guī)律，這可能與所選取的供試材料及樣本量不同有關(guān)。根據(jù)雜合度的概念，當(dāng)雜合度大于0.5時(shí)，群體具有比較豐富的遺傳多樣性；且觀測(cè)雜合度值和期望雜合度值越接近，群體的遺傳多樣性程度越高[24-25]。本研究供試茶樹(shù)群體Shannon’s多樣性指數(shù)為0.691～1.089，觀測(cè)雜合度平均值為0.51，期望雜合度平均值為0.59，各群體的觀測(cè)雜合度值和期望雜合度值非常接近，說(shuō)明供試的32個(gè)群體都具有較高的遺傳多樣性，其中城步峒茶群體的觀測(cè)雜合度及期望雜合度與劉振等[26]研究結(jié)果相似。遺傳分化系數(shù)（）平均值為0.205，表明供試茶樹(shù)群體間遺傳分化水平較高，側(cè)面反映了研究選用的SSR位點(diǎn)對(duì)供試樣品具有較好的區(qū)分效果。

3.3 供試樣品的群體結(jié)構(gòu)

黃丹娟[13]和喬婷婷[23]基于分子標(biāo)記分別對(duì)不同省份優(yōu)良茶樹(shù)品種進(jìn)行聚類分析，都發(fā)現(xiàn)福建、浙江、安徽和河南的種質(zhì)資源聚在同一類群，與本研究分析得到的茶樹(shù)群體聚類結(jié)果一致。本研究中，來(lái)自云南的鳳慶大葉茶和勐庫(kù)大葉茶并沒(méi)有與十里香聚在一起，而是單獨(dú)聚為一類，推測(cè)這可能與橫斷山脈獨(dú)特的地貌有關(guān)。研究表明，山脈和河流可以改變植物的生境并影響物種的群體結(jié)構(gòu)，橫斷山脈是中國(guó)最長(zhǎng)、最寬和最典型的南北走向山系，也是植物區(qū)系東西、南北多樣性融合和選擇演化的關(guān)鍵地帶[27-29]，在地理分布上，鳳慶大葉茶和勐庫(kù)大葉茶原產(chǎn)地位于橫斷山脈西側(cè)區(qū)域，而十里香原產(chǎn)地位于橫斷山脈東側(cè)區(qū)域。

本研究中第二大類包含城步峒茶、江華苦茶、汝城白毛茶、六堡茶、南山白毛茶和羅坑群體種6份種質(zhì)資源，聚集分布在3個(gè)彼此相鄰的省份中，與鳳慶大葉茶和勐庫(kù)大葉茶親緣關(guān)系較近；在K=2時(shí)，第四大類與第三大類聚為一類，第四大類主要分布于前人所推測(cè)茶樹(shù)傳播路線的末端區(qū)域，而第三大類在供試茶區(qū)西南到東北方向皆有分布，且從云南經(jīng)貴州、湖南呈放射狀在廣西、江西、湖北等地分布。結(jié)合本研究系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，推測(cè)遺傳背景不同的供試茶樹(shù)分別通過(guò)以下2條途徑傳播：（1）一部分種質(zhì)（第一大類和第二大類）從云南經(jīng)廣西向湖南、廣東傳播；（2）其他種質(zhì)（第三大類和第四大類）從云南經(jīng)貴州、湖南向湖北、江西傳播，最終傳播到福建、安徽、浙江、陜西、河南等地。

3.4 茶樹(shù)地方群體品種的收集與保護(hù)

32份茶樹(shù)地方群體種遺傳多樣性研究結(jié)果顯示，每份茶樹(shù)地方群體種內(nèi)包含著豐富的種質(zhì)資源，且不同群體種間遺傳分化水平較高。系統(tǒng)發(fā)育及群體結(jié)構(gòu)分析表明，供試茶區(qū)中，西南地區(qū)較東北地區(qū)種質(zhì)遺傳分化水平高，且傳播中間地帶（湖南、湖北、江西）包含茶樹(shù)資源類型較為豐富，供試茶區(qū)東部末端及北部末端類型單一、遺傳背景較為狹窄，與姚明哲等[30]的研究結(jié)果相似；對(duì)江南茶區(qū)茶樹(shù)地方品種遺傳多樣性進(jìn)行分析，湖南、湖北、江西的種質(zhì)表現(xiàn)出了豐富的多樣性[31]；對(duì)來(lái)自安徽省內(nèi)10個(gè)地區(qū)的茶樹(shù)群體種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明它們遺傳相似性極高，遺傳相似系數(shù)為0.946～0.987[32]?；蚍中屯c表型性狀相關(guān)聯(lián)，余書(shū)平等[33]基于分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)開(kāi)化縣茶樹(shù)群體種進(jìn)行親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)基于分子標(biāo)記的基因分型結(jié)果一致、表型性狀表現(xiàn)相似的特異種質(zhì)?？梢赃m當(dāng)結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展各地方種質(zhì)遺傳多樣性研究，挖掘親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的核心種質(zhì)，因地制宜的開(kāi)展茶樹(shù)地方群體種質(zhì)的收集與保護(hù)工作。

感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所陳亮研究員課題組為本研究提供引物。

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Analysis of Genetic Diversity and Population Structure of 32 Tea Landraces in China

LI Changle, GE Yue, YAN Meilin, LI Hui, LIN Qingqing, WANG Pu, ZHAO Hua, WANG Mingle, WANG Yu, GUO Fei*, NI Dejiang

Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Tea plant populations are natural populations of tea plants. They are cultivated in specific production areas and contain individuals with different economic and biological traits. There are great differences among individuals and there are many types. They are important materials for studying the evolutionary relationship and breeding of tea plants. In this study, 30 pairs of SSR primers distributed on 15 linkage groups were selected to analyze the genetic diversity and population structure of 32 tea plant populations from 12 provinces, in order to provide a reference for the selection of tea breeding parents and the inference of evolution route. In this study, a total of 149 alleles were obtained with an average of 5.96 for each SSR marker. The average polymorphism information content of primers was 0.660. Shannon's diversity index of 32 tea populations ranged from 0.691 to 1.089, with an average of 0.954. The observed heterozygosity ranged from 0.253 to 0.633, with an average of 0.510. The expected heterozygosity ranged from 0.430 to 0.653, with an average of 0.590. The average genetic differentiation coefficient () of tea plant population was 0.205, indicating a high level of genetic differentiation. The results of clustering based on Nei's genetic distance and population structure analysis were consistent. The germplasm to be tested was divided into 4 major types, with obvious regional distribution.

tea landraces, SSR molecular marker, population structure, genetic diversity, evolutionary route

S571.1；S324

A

1000-369X(2021)05-619-12

2021-03-02

2021-03-24

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFD1001601）、園藝作物種質(zhì)資源平臺(tái)（2020DFE017）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2662020YLPY023）

李長(zhǎng)樂(lè)，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)遺傳育種研究。*通信作者：guofei@mail.hzau.edu.cn

（責(zé)任編輯：黃晨）