豬圓環(huán)病毒2型/3型雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法

王林青，樊 霖，趙 宇，田潤(rùn)博，崔建濤，韓昊瑩，趙 麗，陳紅英,3*

(1. 鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)鄭州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450044；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002；3. 鄭州市豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450002；4. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院， 鄭州 450008)

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是一種呈球形、無(wú)囊膜且單股閉合環(huán)狀DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為目前已知的最小的動(dòng)物病毒[1]。在全球范圍的豬群中，迄今發(fā)現(xiàn)PCV有3個(gè)血清型：豬圓環(huán)病毒1型、2型和3型（PCV1、PCV2和PCV3）。PCV1于1974年首次被發(fā)現(xiàn)存在于豬腎細(xì)胞PK-15中，但不產(chǎn)生細(xì)胞病變[2]，且對(duì)豬無(wú)致病性[3]。而PCV2于1997年首次被報(bào)道，能夠引起豬發(fā)生包括仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）和繁殖障礙等豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD）[4-6]，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2016年，美國(guó)Palinski等[7]和Phan等[8]分別從患有PDNS、繁殖障礙的母豬和關(guān)節(jié)腫脹和消瘦等疾病的母豬或仔豬檢測(cè)到PCV3。PCV3基因組為2 000個(gè)堿基，與PCV2相似，含有2個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框（ORF1和ORF2），分別編碼rep和cap蛋白。PCV2和PCV3臨床表現(xiàn)相似且難以區(qū)分，并且常以單獨(dú)或混合感染的方式感染豬[9]，使我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)面臨巨大的挑戰(zhàn)。因此，建立一種能同時(shí)檢測(cè)和鑒別PCV2和PCV3的方法，為提供有價(jià)值的流行病學(xué)信息以及啟動(dòng)適當(dāng)?shù)念A(yù)防和控制策略至關(guān)重要。

熒光定量PCR作為一種新技術(shù)，因其與普通PCR相比，具有更加快速、敏感、特異性強(qiáng)和自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)而不斷發(fā)展，并廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。因此，本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PCV2和PCV3基因組核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，在同一個(gè)PCR反應(yīng)管中進(jìn)行兩種病原的熒光定量檢測(cè)，旨在為同時(shí)檢測(cè)和鑒別兩種病原提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株及臨床樣品

PCV3陽(yáng)性病料由鄭州市豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)疑似PCV3感染的病料樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序而獲得，作為PCV3的陽(yáng)性對(duì)照。pMD18-PCV2陽(yáng)性全基因組質(zhì)粒、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）以及豬細(xì)小病毒（PPV）均由鄭州市豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司。

66份臨床樣品（包括血清、淋巴結(jié)和脾臟等）為2017—2019年，采自河南省鄭州、原陽(yáng)和許昌等7個(gè)地市豬場(chǎng)。臨床樣品中一部分來(lái)源于河南各地健康豬群組織，另一部分為患有腹瀉、流產(chǎn)死胎及圓環(huán)病毒感染相關(guān)疾病的病死豬組織。取適量組織進(jìn)行研磨，于–80 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r·min-1離心6 min。取上清液，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq MasterMix（中國(guó)北京）購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、SanPrep柱式DNA和RNA小量抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；ChamQ TM Universal SYBR qPCR Master Mix、Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

利用DNAstar（version5.0）軟件MegAlign程序?qū)enBank中已發(fā)表的PCV2全基因組序列（ KT719404.1、DI434116.1和MH169117.1）進(jìn)行同源性分析，應(yīng)用Primer6.0引物設(shè)計(jì)軟件，基于PCV2基因組上393～665 bp高度保守區(qū)域，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物PCV2-F/R（表1），針對(duì)PCV3基因組上168～305 bp保守區(qū)域并參考Xu等設(shè)計(jì)的引物[10]，兩對(duì)引物均由奧科鼎盛（武漢）生物科技有限公司合成。

表1 PCV2和PCV3檢測(cè)引物Table 1 Primers for the detection of PCV2 and PCV3

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備

根據(jù)SanPrep柱式DNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取PCV3、PRV和PPV的 DNA，根據(jù)Trizol說(shuō)明書提取PEDV、PRRSV和CSFV總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，并于–80 ℃保存?zhèn)溆?。利用PCV2和PCV3特異引物PCV2-F/R和PCV3-F/R，以pMD18-PCV2全基因組質(zhì)粒以及提取的PCV3 DNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃ 20 s , 60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將膠回收試劑盒回收純化的PCR產(chǎn)物，克隆至pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒（pMD18-PCV2和pMD18-PCV3）并測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD18-PCV2和pMD18-PCV3作為PCV2和PCV3的標(biāo)準(zhǔn)品, 經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，并根據(jù)公式：質(zhì)粒濃度（ng·μL-1）× 6.022 × 1023/質(zhì)粒長(zhǎng)度× 660 × 109，換算為拷貝數(shù)/μL。

1.5 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為了尋求最合適的雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對(duì)退火溫度（55～65℃）、引物量以及延伸時(shí)間進(jìn)行摸索。將標(biāo)準(zhǔn)品分別用去離子水作10倍系列稀釋，選取6個(gè)稀釋度（10-3～10-8）為模板，每個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)立3個(gè)重復(fù)，用CFX96TM型熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。用熒光定量PCR儀的分析軟件對(duì)熒光定量擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性和敏感性試驗(yàn)

采用優(yōu)化的雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，以PCV2、PCV3、PPV、PRV、CSFV、PEDV和PRRSV的核酸為模板，同時(shí)以去離子水為陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。選取標(biāo)準(zhǔn)品的8個(gè)稀釋度（10-10～10-3）為模板，同時(shí)以去離子水為陰性對(duì)照, 進(jìn)行熒光定量PCR（每個(gè)稀釋度作3個(gè)平行試驗(yàn)），確定PCV2和PCV3的最低檢測(cè)線，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，比較其敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

將1.5中所用樣品保存至4 ℃，每隔2周，同等條件下取3個(gè)稀釋度（如10-3、10-5和10-8）標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行批內(nèi)試驗(yàn)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行試驗(yàn)；另對(duì)不同批次樣品按前述方法稀釋后定期進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，重復(fù)進(jìn)行3次檢測(cè)，分別計(jì)算其變異系數(shù)。

1.8 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)2017—2019年河南省鄭州、原陽(yáng)和許昌等地豬場(chǎng)的66份臨床樣品采用已建立的PCV2和PCV3雙重SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，比較這兩種檢測(cè)方法的檢出率，評(píng)價(jià)其臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備結(jié)果

利用PCV2和PCV3的特異引物，以pMD18-PCV2全基因組質(zhì)粒和PCV3的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增和電泳，分別擴(kuò)增出約251 bp和138 bp的特異性條帶（圖1），與預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相一致。將回收純化的PCR產(chǎn)物克隆至載體pMD18-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒（pMD18-PCV2和pMD18-PCV3），作為標(biāo)準(zhǔn)品模板。經(jīng)測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示所克隆的PCV2和PCV3 基因序列分別為251 bp和138 bp，分別與參考序列KT719404和KX898030相應(yīng)的區(qū)域同源性為100%，表明PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物是特異的。

圖1 PCV2/3單一及雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCV2/3 single and double PCR amplification results

2.2 雙重?zé)晒舛縋CR的優(yōu)化與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

經(jīng)優(yōu)化雙重SYBR GreenⅠ熒光PCR的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，確定PCV2和PCV3雙重SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為：SYBR GreenⅠPremix Ex Taq酶 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒1 μL，補(bǔ)充 ddH2O至20 μL；擴(kuò)增條件為：95℃5 min；95℃15 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，共35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

按照雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，分別以PCV2和PCV3標(biāo)準(zhǔn)品的6個(gè)稀釋度（10-8～10-3）作模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，PCV2獲得擴(kuò)增曲線，見(jiàn)圖2（a），PCV3獲得擴(kuò)增曲線，見(jiàn)圖2（b）。根據(jù)PCV2，PCV3擴(kuò)增曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct為縱坐標(biāo)分別繪制PCV2和PCV3標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），PCV2直線方程為y=–3.5731x+42.456，R2=0.999，截距為42.456；PCV3直線方程為y= –3.373 4x+ 40.513，R2= 0.999 3，截距為40.513。二者相關(guān)系數(shù)均為0.999，具有良好的線性相關(guān)。

圖2 PCV2/PCV3熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 PCV2/PCV3 real-time PCR amplification results

圖3 雙重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PCV2/3的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of PCV2/3 detection by dual SYBR Green I real-time PCR

2.3 特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)結(jié)果

采用建立的PCV2，PCV3 雙重SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)PRV、PRRSV、PPV、CSFV和PEDV核酸進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，均無(wú)特異性吸收峰值和擴(kuò)增曲線，而PCV2和PCV3有擴(kuò)增曲線（圖4），表明該方法具有良好特異性。

圖4 熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Figure 4 Fluorescence quantitative PCR specific test results

圖5 臨床樣本雙重PCR檢測(cè)結(jié)果Figure 5 PCR results of clinical samples

選取8個(gè)稀釋度（10-10～10-3）的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行雙重SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR。結(jié)果顯示，PCV2和PCV3的檢測(cè)下限分別為41.1 copies·μL-1和27 copies·μL-1；而常規(guī)PCR檢測(cè)時(shí)，PCV2和PCV3的檢測(cè)下限分別為4.11×102copies·μL-1和2.7×102copies·μL-1，說(shuō)明所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法靈敏度優(yōu)于普通PCR檢測(cè)方法。

2.4 重復(fù)性檢測(cè)

選取3個(gè)稀釋度（10-3、10-5和10-8）的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品模板的批內(nèi)變異系數(shù)為0.320%～0.727%；而批間的變異系數(shù)為0.725%～0.886%，且批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于1%。表明本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法具有重復(fù)性高且穩(wěn)定性良好的特性。

2.5 臨床樣品PCV2和PCV3的檢測(cè)

采用建立的PCV2/PCV3雙重?zé)晒舛縋CR，對(duì)2017—2019年采集的66份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，PCV2陽(yáng)性41份，陽(yáng)性率62.12%（41/66）；PCV3陽(yáng)性32份，陽(yáng)性率48.48%（32/66）；混合感染31份，陽(yáng)性率46.96%（31/66）。普通PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性的病料，熒光定量PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，且熒光定量PCR檢出的陽(yáng)性率高于普通PCR陽(yáng)性率，表明本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法更為靈敏。

3 討論與結(jié)論

自2016年P(guān)alinski等[7]報(bào)道美國(guó)豬場(chǎng)中檢測(cè)到PCV3以來(lái)，中國(guó)、波蘭和意大利等國(guó)家也相繼報(bào)道PCV3的存在[9-12]，這些研究結(jié)果證明，PCV3已在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的威脅。由于PCV3與PCV2臨床表現(xiàn)相似，且對(duì)PCV2和PCV3混合感染的檢測(cè)與鑒定仍存在困難[9]，因此，建立一種敏感且特異地同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分PCV2和PCV3的方法十分必要。目前，季程遠(yuǎn)等[13]、賀會(huì)利等[14]以及徐朋麗等[15]分別建立了能夠同時(shí)檢測(cè)PCV2和PCV3的雙重PCR檢測(cè)方法，該方法具有快速、準(zhǔn)確和方便等方面的優(yōu)勢(shì)，但普通的PCR方法在感染早期病毒量含量較少時(shí)，往往不能做出準(zhǔn)確的檢測(cè)，而熒光定量PCR具備普通PCR的特點(diǎn)，并且能夠更加靈敏地對(duì)健康的或有疑似癥狀的豬進(jìn)行早期的診斷，以便提前采取預(yù)防或治療等有效措施，并且方法省去了電泳環(huán)節(jié)，避免了核酸染料對(duì)環(huán)境的污染以及操作人健康的危害，因此，本研究針對(duì)PCV2基因組上393～665 bp保守區(qū)域和PCV3基因組上168～305 bp保守區(qū)域，建立了PCV2/PCV3雙重SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法。

結(jié)果表明，該方法能特異地檢測(cè)PCV2和PCV3，對(duì)PRV、PRRSV、PPV、CSFV和PEDV等5種其他豬病原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該方法具有良好的特異性；PCV2和PCV3檢測(cè)下限分別為41.1 copies·μL-1和27 copies·μL-1，其中PCV2的檢測(cè)下線明顯低于季程遠(yuǎn)等[13]和徐朋麗等[15]所建立的常規(guī)PCR檢測(cè)方法，而PCV3的檢測(cè)下線明顯低于季程遠(yuǎn)等[13]所建立的常規(guī)PCR檢測(cè)方法，并與徐朋麗等[15]所建立的常規(guī)PCR檢測(cè)方法，李卓昕等[16]所建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法以及張志等[17]所建立的Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法相當(dāng)，表明該方法具有良好的敏感性；運(yùn)用所建立的PCV2/PCV3 雙重SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對(duì)2017—2019年采自河南地區(qū)的66份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的臨床實(shí)用性，結(jié)果顯示，PCV2陽(yáng)性率為62.12%（41/66），PCV3的陽(yáng)性率為48.48%（32/66），PCV2和PCV3的混合感染率為46.96%（31/66），并且熒光定量PCR方法的陽(yáng)性率高于普通PCR方法的陽(yáng)性率，表明熒光定量PCR更適合少量病毒的檢測(cè)且PCV2和PCV3的混合感染情況在河南省已經(jīng)普遍存在。

本研究成功地建立了一種能同時(shí)檢測(cè)和鑒別PCV2和PCV3的雙重SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法。該方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)具有敏感、特異和可靠等特點(diǎn)，適合于PCV2和PCV3單獨(dú)或混合感染的早期診斷、定量檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查，以便采取及時(shí)地防控和治療，為我國(guó)控制PCV2和PCV3感染提供有效的技術(shù)支持。