肉松中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測及分析

◎ 韓珍珍

（運(yùn)城市綜合檢驗(yàn)檢測中心，山西 運(yùn)城 044000）

單核細(xì)胞增生李斯特菌簡稱單增李斯特菌，革蘭氏陽性細(xì)菌，是引起肉類食物中毒的重要病原菌。單核細(xì)胞增生李斯特菌能在低氧、4 ℃冷藏、-18 ℃冷凍下長時間存活[1-2]，是冷藏食品中一種嚴(yán)重的食源性致病菌。其廣泛存在于自然界中。單增李斯特菌中毒通常與食物污染有很大關(guān)系，尤其是預(yù)包裝即食食品被污染。晏許超等[3]指出即食食品較易被單增李斯特菌感染，需要加強(qiáng)對即食食品進(jìn)行檢測監(jiān)管。因此本文針對肉松類即食食品進(jìn)行此菌的檢測分析，希望為其他實(shí)驗(yàn)室及政府制定食品安全制度提供支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

從各縣市超市、農(nóng)貿(mào)市場抽取零售散裝的豬肉松、雞肉松、牛肉松共167份，所有樣品均用無菌采樣袋密封包裝，在接近原儲存溫度下盡快送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要儀器

BM-20AY落射熒光顯微鏡帶照相系統(tǒng)（上海光學(xué)儀器），BHC-1300Ⅱ生物安全柜（蘇凈集團(tuán)），生化培養(yǎng)箱（上海博迅），VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司），濁度儀（法國生物梅里埃公司），均質(zhì)器（浙江泰林）等。

1.3 菌株與試劑

菌株：陽性菌株為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC19114）；對照菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、馬紅球菌（ATCC6939）、英諾克李斯特氏菌（ATCC33090）、伊氏利斯特氏菌（ATCC19119）和斯氏李斯特氏菌（ATCC35967）。

試劑：李氏增菌肉湯LB（1907134）、PALCAM瓊脂（190412）、5%～8%羊血瓊脂（190525）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒（190706）、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基（190525）均為北京陸橋；GP鑒定卡。

1.4 檢測方法

本試驗(yàn)根據(jù)GB 4789.30—2016標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢驗(yàn)。共取樣品n=5進(jìn)行檢驗(yàn)，依次編號為01～05，共5組，每組做2個平行，步驟依次為增菌、分離、鑒定（生化鑒定和全自動生化鑒定儀）、計數(shù)。此次檢測前對實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境及關(guān)鍵培養(yǎng)基及菌種進(jìn)行驗(yàn)證，確保試驗(yàn)準(zhǔn)確。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉松中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出情況

167份散裝肉松食品檢測中，共檢出2批豬肉松中有單核增生李斯特菌，其中農(nóng)貿(mào)市場檢出1份，檢出率為3.45%；網(wǎng)購產(chǎn)品檢出1份，檢出率為4.00%。雞肉松和牛肉松中均未檢出該菌。不同肉松食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出率結(jié)果，如表1所示。

表1 不同肉松食品種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出率表

2.2 生化鑒定過程

2.2.1 可疑菌落選取及鑒定

挑取PALCAM平板上有黑色暈圈的黑色菌落及顯色平板上有白色暈圈的小圓形藍(lán)綠色菌落，分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，做純培養(yǎng)再進(jìn)行確證試驗(yàn)。由圖1可知，經(jīng)革蘭氏染色，該菌為革蘭氏陽性菌，短桿菌；有動力，呈傘狀生長；過氧化氫酶呈陽性反應(yīng)。

圖1 革蘭氏染色、動力試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)圖

2.2.2 溶血試驗(yàn)及協(xié)同溶血試驗(yàn)（cAMP）

由圖2可知，溶血試驗(yàn)中，D、S、y菌種在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生溶血環(huán)；陰性菌無溶血環(huán)。其中從營養(yǎng)瓊脂平板中選取的5個可疑菌落（每個菌落兩個平行）做溶血試驗(yàn)，菌落分別為1a1b；2a2b；3a3b；4a4b；5a5b，5個菌落都出現(xiàn)透亮的溶血現(xiàn)象。協(xié)同溶血試驗(yàn)（cAMP）中，可疑菌落在靠近金黃色葡萄球菌的接種端溶血增強(qiáng)，斯氏李斯特氏菌的溶血也增強(qiáng)，這兩種菌均出現(xiàn)協(xié)同溶血現(xiàn)象，而伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌的接種端溶血增強(qiáng)。自此可以初步確定可疑菌落有溶血和協(xié)同溶血現(xiàn)象，此現(xiàn)象與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌相同。

圖2 溶血試驗(yàn)和協(xié)同溶血試驗(yàn)圖

2.2.3 生化試劑盒及全自動生化鑒定儀鑒定

從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取目標(biāo)菌落，先利用濁度儀制成0.5 McF濃度的菌懸液，再用GP鑒定卡參照操作說明進(jìn)行操作，采用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀鑒定，結(jié)果為單增李斯特氏菌（98%）。

3 結(jié)論與討論

單核細(xì)胞增生李斯特菌按照GB 4789.30—2016檢驗(yàn)，檢驗(yàn)過程中的分離培養(yǎng)和菌種鑒定至關(guān)重要。①觀察菌落形態(tài)挑取關(guān)鍵可疑菌株，選取獨(dú)立區(qū)域的單個菌落，避免挑取多個菌落。②總結(jié)菌落形態(tài)特征也很重要，如在選取李斯特氏菌顯色平板上可疑菌落時，可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)排除部分藍(lán)綠色菌落，比如周圍無暈圈的藍(lán)綠色小菌落（英諾克李斯特氏菌）[4-5]。③在生化鑒定中，為了防止假陽性，要選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的典型菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)后再鑒定。本試驗(yàn)用兩種方法對目標(biāo)菌株進(jìn)行生化鑒定，即溶血及協(xié)同溶血試驗(yàn)與生化試劑盒及全自動生化鑒定儀。普通生化鑒定試驗(yàn)操作比較煩瑣，費(fèi)時費(fèi)力，不能快速滿足檢測需求，溶血試驗(yàn)、協(xié)同溶血試驗(yàn)對檢驗(yàn)人員要求比較高，不易操作。但全自動生化鑒定儀比較簡便快捷，準(zhǔn)確率也比較高，對人員要求不高，在操作和快捷方面表現(xiàn)優(yōu)異，在實(shí)際監(jiān)測中，為了結(jié)果準(zhǔn)確可靠，避免假陰性出現(xiàn)，可同時應(yīng)用兩種鑒定方法。

本文通過對散裝肉松食品進(jìn)行檢測，分析發(fā)現(xiàn)比較典型的是農(nóng)貿(mào)市場的豬肉松單增李斯特菌檢出率為3.45%。研究還發(fā)現(xiàn)采樣地點(diǎn)對此菌檢出有影響，超市產(chǎn)品無單增李斯特菌檢出，但農(nóng)藥市場及網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)品中均有此菌檢出，說明農(nóng)貿(mào)市場和網(wǎng)站相對于超市有污染的潛在風(fēng)險，此經(jīng)營場所環(huán)境比較復(fù)雜且人流動性比較大，因是散裝食品，在加工、儲存、運(yùn)輸、銷售、再加工及二次分裝過程中都有交叉污染及二次污染的可能性[6]。此次采集肉松發(fā)現(xiàn)農(nóng)貿(mào)市場的一些攤位食品安全存在隱患，主要是來源不明且商販無銷售資質(zhì)，儲存的容器比較簡陋，生熟不分，通風(fēng)，保存、消毒環(huán)節(jié)不完善。筆者建議農(nóng)貿(mào)市場散裝肉松儲存由政府加強(qiáng)監(jiān)管，規(guī)定統(tǒng)一盛放的容器，使用光滑不易附著細(xì)菌的容器[7]，有利于降低產(chǎn)品的風(fēng)險。對于網(wǎng)站食品則主要是監(jiān)管存在漏洞，主要依賴于網(wǎng)絡(luò)，食品交易存在虛擬性和不可考證性，一些網(wǎng)絡(luò)不良商家以次充好，出售保質(zhì)期將近到期的產(chǎn)品；一些小作坊加工的食品衛(wèi)生條件也無保證，更無食品標(biāo)示，這樣給消費(fèi)者的售后和維權(quán)帶來極大不便。針對這些問題，政府應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)對食品來源、流通、加工、銷售、儲存、處理等主要環(huán)節(jié)的監(jiān)管及規(guī)范管理，尤其是農(nóng)貿(mào)市場和網(wǎng)站食品的監(jiān)管，警戒食源性疾病的發(fā)生和流行[8]，改善人們的食品安全，提高生活質(zhì)量。