lncRNA SNHG5對(duì)人類下咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響及意義

周 煥， 唐 穎， 杜翠萍， 楊 揚(yáng)， 馮會(huì)杰， 邱淼欣， 閆佩毅， 蔡驍垚， 金 姝

（1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科，上海 200060；3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200060；4.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200060）

下咽癌，又稱喉咽癌，是發(fā)生在梨狀窩、環(huán)狀軟骨后區(qū)、喉咽后壁區(qū)的惡性腫瘤，病理學(xué)類型以鱗狀細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，約占95%[1]，5年總生存率僅為30%～45%[2-3]，被認(rèn)為是頭頸部預(yù)后較差的惡性腫瘤之一。小核仁RNA宿主基因5（small nucleolar RNA host gene 5，SNHG5）是長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的一員，其在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)現(xiàn)象。DAMAS等[4]的研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者SNHG5表達(dá)上調(diào)，抑制SNHG5過(guò)表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ZHAO等[5]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中SNHG5表達(dá)降低。他們還發(fā)現(xiàn)SNHG5具有關(guān)鍵且強(qiáng)大的調(diào)節(jié)基因活動(dòng)的能力，通過(guò)捕獲細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2參與抑制胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。關(guān)于SNHG5在下咽癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用和機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探討SNHG5對(duì)人類下咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響，為下咽癌的分子診療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株來(lái)源

下咽癌細(xì)胞株FaDu購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（目錄號(hào)：TCHu132）。

1.2 慢病毒制備

通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）定位SNHG5為NR_003038.2，委托武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司合成human SNHG5，構(gòu)建pLVX-hSNHG5-ZsGreen-Puro質(zhì)粒，并完成rLV-hSNHG5-ZsGreen-Puro慢病毒和rLVZsGreen-Puro對(duì)照慢病毒的包裝。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及感染

將FaDu細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）中，在37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，鋪至6孔板中，2 mL/孔，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。在37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右時(shí)，每孔加入100 μL滴度為1×108TU/mL的慢病毒進(jìn)行感染。將感染rLV-hSNHG5-ZsGreen-Puro慢病毒的FaDu細(xì)胞作為rLV-SNHG5組，將感染rLV-ZsGreen-Puro對(duì)照慢病毒的FaDu細(xì)胞作為rLV組。

1.4 穩(wěn)定細(xì)胞系篩選

感染了慢病毒的2組FaDu細(xì)胞在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h后，更換含10%FBS的DMEM，2 mL/孔，并在每孔中加入0.2 μL嘌呤霉素（10 mg/mL）進(jìn)行篩選。每過(guò)48 h更換1次培養(yǎng)基，持續(xù)篩選1周后獲得2組穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。

1.5 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）

將2組穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基，加入1 mL Trizol裂解液（美國(guó)Invitrogen公司），提取總RNA，測(cè)定總RNA濃度。根據(jù)FastKing RT Kit（With gDNase）試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄體系（1 μL 總RNA、2 μL 5×gDNA Buffer、2 μL 10×King RT Buffer、1 μL FastKing RT Enzyme Mix、2 μL FQ-RT Primer Mix，加RNase-Free ddH2O至20 μL），合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min，4℃保存。采用MyCycler PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）和FastFire qPCR PreMix（SYBR Green）試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，反應(yīng)體系：總體積為20 μL，2×FastFire qPCR PreMix 10 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA 2 μL、RNase-Free ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，12 ℃ 10 s，4 ℃保存。SNHG5正向引物：5'-CACAGTGGAGCAGCTCTGAA-3'，反向引物：5'-CTCGTGGCACTAGCCAGAAA-3'；以β-actin為內(nèi)參，正向引物：5'-CTCGCCTTTGCCGATCC-3'，反向引物：5'-TCTCCATGTCGTCCCAGTTG-3'。

1.6 RNA鑒定及測(cè)序

采用2100生物分析儀（美國(guó)Agilent公司）檢測(cè)RNA完整性。RNA樣本送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.7 軟件分析

采用Subread軟件[6]中的featureCounts工具進(jìn)行基因定量分析。采用DESeq2軟件[7]進(jìn)行基因差異分析。采用ClusterProfile軟件[8]對(duì)差異基因集進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）（包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)部分）、京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路、Reactome通路和疾病本體（Disease Ontology，DO）的富集分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取質(zhì)量

rLV-SNHG5組和rLV組提取的RNA均有28S、18S、5S條帶，RNA均完整。見(jiàn)圖1。

圖1 提取的RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 rLV-SNHG5組與rLV組SNHG5相對(duì)表達(dá)量的比較

rLV-SNHG5組中SNHG5相對(duì)表達(dá)量顯著高于rLV組（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 rLV-SNHG5組與rLV組中SNHG5相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3 SNHG5對(duì)FaDu細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄能力的影響

對(duì)2個(gè)組的RNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，基因差異分析共篩選出1 070個(gè)差異表達(dá)的基因，其中表達(dá)上調(diào)537個(gè)、表達(dá)下調(diào)533個(gè)，見(jiàn)圖3。表達(dá)上調(diào)居前10位的基因分別為L(zhǎng)CP1、NT5E、CTGF、AXL、AKAP12、PXDN、THBS1、4-Mar、TMEM200A和RIPOR3，見(jiàn)圖4。表達(dá)下調(diào)居前10位的基因分別為PKP1、SERPINB13、KLK10、AC011473.4、NOTCH3、CA2、EGLN3、SLC6A8、KRT4和VAV3，見(jiàn)圖5。

圖3 基因差異分析

圖4 rLV-SNHG5組與rLV組上調(diào)基因表達(dá)量的比較

圖5 rLV-SNHG5組與rLV組下調(diào)基因表達(dá)量的比較

2.4 差異表達(dá)基因的功能分析

2.4.1 GO富集分析 與rLV組比較，rLVSNHG5組中表達(dá)上調(diào)的基因涉及的生物過(guò)程主要包括血管生成、血壓調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)負(fù)調(diào)節(jié)、前列腺形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞分泌負(fù)調(diào)節(jié)等，表達(dá)下調(diào)的基因涉及的生物過(guò)程主要包括酸分泌、離子轉(zhuǎn)運(yùn)的正調(diào)控、表皮發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)攝取和二十醛分泌等；表達(dá)上調(diào)的基因涉及的細(xì)胞組分主要包括中間絲、蛋白細(xì)胞外基質(zhì)、角蛋白絲、細(xì)胞外基質(zhì)和中間絲細(xì)胞骨架等，表達(dá)下調(diào)的基因涉及的細(xì)胞組分主要包括角質(zhì)化包膜和基底外側(cè)質(zhì)膜；表達(dá)上調(diào)的基因涉及的分子功能主要包括糖胺聚糖結(jié)合、受體調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞因子活性、受體配體活性，表達(dá)下調(diào)的基因涉及的分子功能主要包括表皮結(jié)構(gòu)成分和SH3結(jié)構(gòu)域綁定。見(jiàn)圖6。

圖6 GO富集散點(diǎn)圖

2.4.2 KEGG通路富集分析 與rLV組比較，rLV-SNHG5組中表達(dá)上調(diào)的基因涉及的KEGG通路包括細(xì)胞黏附分子、造血細(xì)胞系、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路和甘露糖型O-聚糖生物合成等，表達(dá)下調(diào)的基因涉及的信號(hào)通路主要包括吞噬體、光傳導(dǎo)、集合管酸分泌、Fcε受體Ⅰ信號(hào)通路和基底細(xì)胞癌等，其中重要的通路主要為細(xì)胞黏附分子和造血細(xì)胞系。見(jiàn)圖7。

圖7 KEGG富集分析

2.4.3 Reactome通路富集分析 與rLV組比較，rLV-SNHG5組中表達(dá)上調(diào)的基因涉及的Reactome通路主要包括Gα（i）信號(hào)事件、角質(zhì)化、受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體配體結(jié)合和細(xì)胞外基質(zhì)組織等，表達(dá)下調(diào)的基因涉及的Reactome通路主要包括O-連接糖基化、O-聚糖生物合成終止、磷脂酰甘油的?；溨貥?gòu)以及維甲酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)等。見(jiàn)圖8。

圖8 Reactome通路分析

2.4.4 DO富集分析 與rLV組相比，rLVSNHG5組中表達(dá)上調(diào)的基因涉及的DO主要包括高血壓、偏頭痛、纖維肉瘤、心臟病和不孕等；表達(dá)下調(diào)的基因涉及的DO主要包括呼吸系統(tǒng)疾病、哮喘、巴雷特食管、溶血性尿毒癥綜合征和腎炎等。見(jiàn)圖9。

圖9 DO功能分析

3 討論

lncRNA是一類不具備蛋白質(zhì)編碼能力、長(zhǎng)度＞200 nt的RNA，約占全部非編碼RNA的80%。起初，學(xué)者們認(rèn)為lncRNA是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能[9]。但近年來(lái)的研究表明，lncRNA在細(xì)胞的發(fā)育和疾病的發(fā)生、發(fā)展中都發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，如參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA甲基化和去甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾、mRNA降解和翻譯調(diào)控等[10-11]。本研究結(jié)果顯示，SNHG5可顯著影響人下咽癌細(xì)胞株FaDu的轉(zhuǎn)錄組學(xué)。

本研究結(jié)果顯示，SNHG5顯著改變了FaDu細(xì)胞中一些基因的轉(zhuǎn)錄能力，如上調(diào)LCP1、NT5E、CTGF、AXL和AKAP12等基因，下調(diào)PKP1、SERPINB13、KLK10、AC011473.4和NOTCH3等基因。JEONG等[12]的研究結(jié)果顯示，NT5E甲基化與乳腺癌的發(fā)生和不良預(yù)后相關(guān)。由此推測(cè)在下咽癌中，SNHGT5可能通過(guò)抑制NT5E的甲基化，導(dǎo)致NT5E表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)揮抑癌作用。MARTIN-PADRON等[13]的研究結(jié)果顯示，PKP1可通過(guò)增強(qiáng)MYC基因翻譯來(lái)促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，SNHG5可下調(diào)PKP1基因。由此推測(cè)在下咽癌中，SNHG5或能通過(guò)抑制PKP1對(duì)MYC基因翻譯來(lái)發(fā)揮抑癌作用。以上這些推測(cè)尚需進(jìn)行相關(guān)研究來(lái)進(jìn)一步證明。

本研究結(jié)果顯示，SNHG5影響了FaDu細(xì)胞的GO功能，主要參與了血管生成、血壓調(diào)節(jié)、酸分泌、離子轉(zhuǎn)運(yùn)正調(diào)控、細(xì)胞外基質(zhì)、糖胺聚糖結(jié)合、細(xì)胞因子活性、SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合等。WALKER等[14]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)力學(xué)的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致癌癥等疾病的發(fā)展，推測(cè)SNHG5通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)力學(xué)而發(fā)揮抑癌的作用，但有待進(jìn)一步研究證明。

本研究結(jié)果顯示，SNHG5可對(duì)FaDu細(xì)胞的信號(hào)通路，如細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路、甘露糖型O-聚糖生物合成等產(chǎn)生影響。MENDONSA等[15]的研究結(jié)果顯示，鈣黏蛋白作為一種鈣依賴性的細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)的缺失可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。根據(jù)本研究KEGG通路富集分析結(jié)果，推測(cè)在下咽癌中，SNHG5可能通過(guò)增加細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生來(lái)抑制了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究Reactome通路富集分析結(jié)果顯示，SNHG5主要影響Gα（i）信號(hào)事件、G蛋白偶聯(lián)受體配體結(jié)合、O-連接糖基化以及維甲酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)等。BURCHELL等[16]的研究結(jié)果顯示，O-連接糖基化與乳腺癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展密切相關(guān)。因此，SNHG5可能通過(guò)抑制O-連接糖基化來(lái)發(fā)揮抑癌作用。

本研究結(jié)果還顯示，SNHG5涉及的DO功能包括高血壓、偏頭痛、纖維肉瘤、巴雷特食管等。有研究結(jié)果顯示，巴雷特食管是食管腺癌的主要危險(xiǎn)因素[17]，由此推測(cè)SNHG5可能通過(guò)抑制巴雷特食管的形成來(lái)發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，SNHG5可影響FaDu細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，包括基因轉(zhuǎn)錄能力、GO功能、KEGG信號(hào)通路、Reactome通路和DO功能，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果可為下咽癌的分子診斷及治療研究提供參考。