石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取及抗氧化研究*

張麗君，李 敏，王 靜，魯強(qiáng)國(guó)，馬潘潘

（西安文理學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安710065）

石榴素以色澤艷麗，果大皮薄，汁多味甜，核軟鮮美，籽肥渣少，品質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)而著稱(chēng)。石榴皮、花、葉、根部都可入藥,它性味甘、酸、溫、澀而無(wú)毒，并含有多種生物堿、鞣質(zhì)等?，F(xiàn)代藥理研究也表明，石榴皮中含有多種生理活性物質(zhì)，具有抗癌、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗氧化、提高免疫能力等藥用保健功能,還有降壓、降血脂、增加冠脈流量、強(qiáng)心、抗心律不齊等藥理作用[1]。石榴皮主要成分有鞣質(zhì)酸類(lèi)化合物、沒(méi)食子酸類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、有機(jī)酸類(lèi)化合物、生物堿類(lèi)化合物。石榴皮中含量較高的黃酮類(lèi)化合物，能夠降低不同類(lèi)型自由基的活性，具有一定的藥用價(jià)值。作為天然抗氧化劑可以從天然食材中提取得到，相比合成抗氧化劑具有其他生物學(xué)功能，日益被國(guó)內(nèi)外關(guān)注[2]。

江飛鳳[3]等以柚子皮為原料，采用超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)提取柚子皮多糖，優(yōu)化最佳提取工藝，對(duì)其進(jìn)行脫色、脫蛋白處理，對(duì)其單糖組成、結(jié)構(gòu)和抗氧化活性進(jìn)行分析。本文采取乙醇浸提法、纖維素酶輔助法、超聲波法及微波法從石榴皮中提取黃酮。采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定石榴皮提取液中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量,并進(jìn)行體外抗氧化研究，研究對(duì)種自由基的清除作用，為石榴作為天然抗氧化劑和功能性食品的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

石榴皮（西安老百姓大藥房）；蘆?。ˋR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；NaNO2（AR西安化學(xué)試劑廠）；Al（NO3）3（AR西安富力化學(xué)廠）；NaOH（AR西安化學(xué)試劑廠）；VC（AR天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（AR天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；FeSO4·7H2O（AR汕頭市西隴化工廠有限公司）；水楊酸（AR天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（AR阿拉丁）；鄰苯三酚（AR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；DPPH試劑（AR阿拉?。?。

FW80型微型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司）；722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；YP202N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SB-5200DT型超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LWMC-205型微波反應(yīng)器（南京陵江科技開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.2 方法與步驟

1.2.1 黃酮類(lèi)化合物的提取

1.2.1.1 樣品與處理 稱(chēng)取石榴皮200g，在烘箱中60℃烘干24h，取出后用粉碎機(jī)粉碎備用。

1.2.1.2 各種提取方法的最佳工藝條件（見(jiàn)表1）

表1 各提取方法的最佳工藝條件Tab.1 Optimum conditions for each extraction method

1.2.1.3 乙醇索氏提取 稱(chēng)取3g石榴皮樣品，裝入濾紙桶中，量取60mL 65%的乙醇，倒入250mL的圓底燒瓶，安裝好索氏提取器，開(kāi)始反應(yīng)，虹吸5次左右，離心后得到石榴皮提取液，最后用65%乙醇定容到100mL容量瓶中。

1.2.1.4 纖維素酶輔助法 稱(chēng)取3g石榴皮樣品裝入100mL燒杯中，加入30mL蒸餾水和7.5mg纖維素酶，調(diào)節(jié)pH值為6~7，在45℃水浴中酶解30min，倒入250mL圓底燒瓶中，加入30mL 95%乙醇，保持溫度90℃，回流1.5h，離心后得到石榴皮提取液，最后用95%乙醇定容到100mL容量瓶中[4]。

1.2.1.5 超聲波法 稱(chēng)取3g石榴皮樣品裝入250mL燒杯中，加入60mL 60%乙醇，在50℃條件下超聲25min，離心，取上清液，合并濾液，用60%乙醇定容到100mL容量瓶中[5]。

1.2.1.6 微波法 稱(chēng)取3g石榴皮樣品裝入250mL燒杯中，加入75mL 70%乙醇，在功率為600W條件下微波3次,每次2min，離心，取上清液，合并濾液，用70%乙醇定容到100mL容量瓶中[6,7]。

1.2.2 石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)利用NaNO2-Al（NO3）3比色法，即在中性或弱堿性及NaNO2存在下，黃酮與鋁鹽生成螯合物，加入NaOH顯紅橙色。準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg于小燒杯中，用30%乙醇溶解，定容于50mL的容量瓶，搖勻。得到濃度為0.2mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL于25mL容量瓶中，編號(hào)為1~6。加入5%的NaNO2溶液0.4mL，搖勻，放置6min后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL，搖勻，放置6min后加入4%的NaOH溶液4mL，再用30%乙醇定容，搖勻。以試劑空白為參比，15min后于490~530nm內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。在最大吸收波長(zhǎng)處，測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，得到吸光度A與蘆丁含量C（mg·mL-1）之間的回歸方程。

將4種方法提取所得的4組粗提液，分別吸取1.0mL于25mL的容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.4mL，搖勻，放置6min后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL，搖勻，放置6min后加入4%的NaOH溶液4mL，再用30%乙醇定容，搖勻，以試劑空白為參比，15min后，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入回歸方程中即可求得石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量（質(zhì)量濃度），從而來(lái)計(jì)算石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率。石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率=[（提取液濃度×體積×稀釋倍數(shù)）/原料質(zhì)量]×100%

1.2.3 抗氧化性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 清除DPPH·自由基能力的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取DPPH·0.0079g于小燒杯中，用無(wú)水乙醇溶解，定容于100mL的容量瓶，搖勻后得到濃度為0.2mmol·mL-1的DPPH·溶液。在25mL比色管中加入2mL 0.2mmol·mL-1DPPH·溶液再加入2mL無(wú)水乙醇，搖勻后溫室避光靜置30min，在517nm處測(cè)量吸光度，平行測(cè)定3次，取其平均值得到A0；同樣的方法，再加入5份不同濃度的石榴皮提取液、VC和提取液+VC，測(cè)得Ai；最后在25mL比色管中加入2mL無(wú)水乙醇再加入5份不同濃度的石榴皮提取液、VC和提取液+VC，測(cè)得Aj。

式中A0：不含提取物液的吸光度；Ai：加入石榴皮提取物液的吸光度；Aj：不含DPPH·的吸光度。

1.2.3.2 清除·OH能力的測(cè)定 配制5份不同濃度的石榴皮提取液，取出2mL于試管中，依次加入6mmol·L-1FeSO4溶液2mL，6mmol·L-1H2O22mL，加入6mmol·L-1水楊酸2mL，搖勻，37℃反應(yīng)30min，在510nm下測(cè)吸光度A0；同樣的方法，再加入5份不同濃度的石榴皮提取液、VC、提取液+VC，測(cè)得Ai；最后在25mL比色管中加入6mmol·L-1FeSO4溶液2mL，6mmol·L-1H2O22mL，5份不同濃度的石榴皮提取液、VC、提取液+VC，測(cè)得Aj。

式中A0：不含提取物液的吸光度；Ai：加入石榴皮提取液的吸光度；Aj：不含水楊酸的吸光度。

計(jì)算清除率=[（ΔA0-ΔA）/ΔA0]×100%

式中 ΔA0：鄰苯三酚自氧化速率；ΔA：加入石榴皮提取液后鄰苯三酚自氧化速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按1.2.2的方法以試劑空白為參比，在510nm下測(cè)得不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1,得到線性回歸方程：Y=10.659X+0.0818，R2=0.999,有良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 4種方法提取石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率

圖2 為4種方法提取石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率。

圖2 4種方法提取石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率Fig.2 Extraction rate of pomegranate flavonoids by four methods

由圖2可知，在比較了4種不同方法提取石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)，4種方法提取物濃度分別為1.87，2.96，4.37，4.73mg·mL-1。結(jié)果表明，其提取率由高到低的順序?yàn)椋何⒉ǚǎ境暡ǚǎ久篙o助法＞乙醇提取法。

2.3 抗氧化性測(cè)定

2.3.1 石榴皮中黃酮類(lèi)化合物對(duì)DPPH·的清除作用

由圖3可知，石榴皮提取液、VC、提取液+VC清除DPPH·自由基，相同濃度下，清除能力大小為：石榴皮提取液+VC＞石榴皮提取物＞VC。各溶液的清除能力都隨濃度的增大而增大，而且VC有協(xié)同作用。

圖3 石榴皮提取物對(duì)DPPH·的清除能力Fig.3 Clearing ability of pomegranate extract to the DPPH·

2.3.2 石榴皮中黃酮類(lèi)化合物對(duì)·OH的清除作用

圖4 為石榴皮提取物對(duì)·OH的消除能力。

圖4 石榴皮提取物對(duì)·OH的清除能力Fig.4 Clearing ability of extract to the·OH

由圖4可知，石榴皮提取液、VC、提取液+VC清除·OH，在相同濃度下，清除能力大小為：石榴皮提取液+VC＞石榴皮提取液＞VC。各溶液的清除能力都隨濃度的增大而增大，而且VC有協(xié)同作用。

圖5 石榴皮提取物對(duì)·的清除能力Fig.5 Clearing ability of pomegranate extract to the·

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別采用乙醇提取法、酶輔助法、超聲波法和微波法4種方法提取石榴皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，微波法提取效率最高，達(dá)4.73%，最佳提取條件為料液比1∶25（g∶mL），提取次數(shù)為3次，每次2min，提取功率600W，乙醇濃度70%；超聲法提取效率次之，達(dá)4.37%，最佳提取條件為：料液比1∶20（g∶mL），提取時(shí)間25min，提取溫度50℃，乙醇濃度60%。

抗氧化劑在藥品、化妝品及保健品中具有廣闊的市場(chǎng)前景。近年來(lái),在黃酮類(lèi)化合物抗衰老作用的研究方面,許多科研工作者發(fā)現(xiàn)這類(lèi)活性成分能夠延緩神經(jīng)系統(tǒng)、免疫器官、生殖系統(tǒng)、肝臟和皮膚等組織的衰老[8]。期望為石榴皮作為天然抗氧化劑和功能性食品得到開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。