穿王消炎膠囊HPLC指紋圖譜的研究

夏淑英，康興東，康愛華，肖紹川，曠春蘭，張小梅，賈天亮，劉厚權(quán)

（江西普正制藥股份有限公司，江西 吉安343100）

穿王消炎膠囊處方由穿心蓮和了哥王二味中藥組成。穿心蓮藥材為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮[Andrographis paniculata(Burm．f．)Nees]的干燥地上部分，收載于《中國藥典》2020年版[1]，其化學(xué)成分主要為二萜內(nèi)酯類化合物和黃酮類化合物，脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯及14-去氧穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類化合物是主要的活性成分[2]，有較好的抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗心血管疾病等作用[3，4]。了哥王為瑞香科蕘花屬植物南嶺蕘花（Wikstro-emia indica C.A.Mey.）的干燥根或根皮，具有消炎解毒的功效，主要成分為香豆素類和總黃酮類，其有效成分西瑞香素具有抗炎等多種藥理作用[5,6]。穿王消炎膠囊具有消炎解毒的功效，臨床常用于治療痰熱咳喘、腹痛以及急慢性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎、急性腸胃炎和急性菌痢等疾病。本研究擬選擇穿王消炎膠囊處方藥材穿心蓮和了哥王的特征性成分進(jìn)行定性分析，建立穿王消炎膠囊HPLC指紋圖譜方法[7]，保障穿王消炎膠囊產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定均一。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設(shè)備

美國安捷倫1260型高效液相色譜儀（含G1311C四元泵、G1314F檢測器及G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器）；BSA224S-CW萬分之一電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；9960D型超聲波清洗儀（CBL科貝爾）。

1.2 試劑與試藥

穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（110797-201108）和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（110854-201710）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈購自西隴化工股份有限公司為色譜純；甲醇購自天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；磷酸購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；水為自制超純水。10批穿王消炎膠囊（批號(hào)：190101、190401、190701、190702、190901、191101、191102、200201、200301和200401，規(guī)格為0.44g/粒）均為江西普正制藥有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

選擇依利特ODSC18色譜柱（4.6mm 250mm，5m），以乙腈為流動(dòng)相A，以0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相B[8]，梯度洗脫：0~20 min，10%~20%乙腈；20~55 min，20%~35%乙腈；55~70min，35%~44%乙腈；流速為1.0mL/min，檢測波長為270 nm；進(jìn)樣量10L；理論塔板數(shù)按脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取脫水穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑配制成1.0 mg/mL的脫水穿心蓮內(nèi)酯溶液和0.2 mg/mL的穿心蓮內(nèi)酯溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取穿王消炎膠囊內(nèi)容物0.4 g，置于具塞錐形瓶中，加入40mL甲醇，超聲20min，放冷后濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性試驗(yàn) 分別精密量取濃度為1.048 mg/mL的脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液和0.2062mg/mL的穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液，用甲醇配成濃度分別為209.6g/mL、157.2g/mL、104.8g/mL、52.4g/mL、31.44g/mL、20.96g/mL和10.48g/mL的脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液和41.24g/mL、30.93g/mL、20.62g/mL、10.31g/mL、6.186g/mL、4.124g/mL和2.0628g/mL的穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照溶液得線性回歸方程y=1.135 3x+0.084 1，R2=0.999 9，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照溶液得線性回歸方程y=0.619 3x-0.023 6，R2=0.999 9。結(jié)果表明，脫水穿心蓮內(nèi)酯濃度在209.6~10.48g/mL間時(shí)，與峰面積呈良好線性關(guān)系，穿心蓮內(nèi)酯濃度在41.24~2.062g/mL間時(shí)，與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 按“2.3”下供試品溶液制備方法制備1份穿王消炎膠囊供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定，獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》相似度軟件2012年版進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，其脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD值為0.13%，指紋圖譜相似度均值超過99%，表明該方法精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備穿王消炎膠囊供試品溶液平行樣6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定，獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》相似度軟件2012年版進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，其脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD值為2.08%，指紋圖譜相似度超過99%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備穿王消炎膠囊供試品溶液1份，并在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h和24 h后進(jìn)樣，測定，獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》相似度軟件2012年版進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，其脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD值為1.12%，指紋圖譜相似度超過99%，表明該產(chǎn)品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5 峰歸屬

2.5.1 了哥王藥材溶液制備取了哥王藥材適量，加水煎煮2次，每次5 h，合并煎煮液，濾過，濃縮后減壓干燥成浸膏狀，取膏狀了哥王1 g，加甲醇100 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.2 穿心蓮藥材溶液制備取穿心蓮藥材適量，置于具塞的錐形瓶中，加40%甲醇25 mL浸泡60 min，再超聲30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 共有峰的確定結(jié)果見圖1。由實(shí)驗(yàn)可知，峰1、2、3、4、7、9、11為穿心蓮藥材專屬峰，峰5為了哥王藥材專屬峰，峰6、8為穿心蓮藥材、了哥王藥材的共有峰。

圖1 穿王消炎膠囊峰歸屬Fig.1 The peak attributions of the Chuanwang xiaoyan capsules

2.6 穿王消炎膠囊HPLC指紋圖譜的建立

按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備10批不同批次穿王消炎膠囊樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定，獲得的穿王消炎膠囊指紋圖譜數(shù)據(jù)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》相似度軟件2012年版分析，選取峰面積較大且分離度較好的11個(gè)色譜峰作為穿王消炎膠囊指紋圖譜共有特征峰，再通過多點(diǎn)校正，中位法生成10批穿王消炎膠囊指紋圖譜共有模式圖（圖2），并建立穿王消炎膠囊的對(duì)照指紋圖譜（圖3），相似度結(jié)果見表1。10批穿王消炎膠囊HPLC指紋圖譜相似度均超過95%，說明10批穿王消炎膠囊產(chǎn)品的批間質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

表1 穿王消炎膠囊HPLC指紋圖譜相似度Table 1 The HPLC fingerprint similarity of Chuanwang xiaoyan capsules

圖2 10批穿王消炎膠囊HPLC指紋圖譜共有模式Fig.2 The common pattern of fingerprints for 10 batches Chuanwang xiaoyan capsules

圖3 穿王消炎膠囊對(duì)照指紋圖譜Fig.3 The Fingerprint of Chuanwang xiaoyan capsules

3 討論

3.1本研究對(duì)不同供試品制備方法進(jìn)行了對(duì)比考察，分別采用超聲20 min、超聲30 min、超聲40 min、加熱回流1 h、浸漬超聲20 min等5種不同的提取方式進(jìn)行提取，結(jié)果表明超聲提取、加熱回流提取和浸漬超聲提取效果差異不大，故選擇最為簡便的超聲提取，最佳超聲提取時(shí)間20 min。

3.2穿王消炎膠囊中了哥王藥材高效液相特征成分未知，為確保色譜條件中270 nm的檢測波長適用性，本研究對(duì)了哥王藥材專屬峰進(jìn)行紫外光譜掃描，該特征峰峰值在266.5 nm，采用270 nm比較適宜。

3.3本研究采用HPLC法建立穿王消炎膠囊的指紋圖譜，并對(duì)共有峰與藥材的相關(guān)性進(jìn)行了研究，能簡便地鑒別處方中的穿心蓮和了哥王藥材，使穿王消炎膠囊生產(chǎn)質(zhì)控具有較好的可追溯性，有利于保障產(chǎn)品臨床療效。

3.4本研究建立的穿王消炎膠囊HPLC指紋圖譜方法進(jìn)行了線性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)等方法學(xué)驗(yàn)證，確認(rèn)了方法的可行性；10批不同批次的穿王消炎膠囊樣品指紋圖譜的相似度均超過95%，說明穿王消炎膠囊產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性較好。

3.5本研究未對(duì)了哥王藥材的特征峰未進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，具有一定局限性，了哥王藥材中含有香豆素類等成分，其中西瑞香素具有較好的抗炎活性，后續(xù)可結(jié)合藥效實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步研究穿王消炎膠囊指紋圖譜與抗炎活性的譜效關(guān)聯(lián)關(guān)系。