膽汁淤積性肝損傷大鼠肝臟組織中水通道蛋白8/9表達的變化

葉蕾 張婷婷 曹婕露 陳曦 姚侃男 姚嘉明 陳芝蕓 嚴峻彬

膽汁淤積是一類由于肝細胞、膽管細胞分泌膽汁障礙或膽汁運行障礙導致的極具破壞性的肝臟疾?。?-2］，若未及時進行治療，膽汁淤積進一步惡化會造成肝損傷，最終導致肝硬化或肝功能衰竭［3-4］。水通道蛋白8（AQP8）和水通道蛋白9（AQP9）均屬水通道蛋白家族，廣泛分布于肝細胞膜和膽管膜，在調控膽汁分泌中發(fā)揮重要作用［5-6］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（PKB/AKT）分別是AQP8、AQP9的上游信號通路，PI3K和AKT的激活可以上調AQP8、AQP9的表達［7-8］。本研究以α-異硫氰酸萘酯（ANIT）誘導膽汁淤積性肝損傷大鼠模型，觀察AQP8/9及其上游信號通路PI3K/AKT在大鼠肝臟的動態(tài)變化，為膽汁淤積性肝損傷的防治提供新的治療靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠48只，體質量（140±10）g，SPF級，由上海西普爾-必凱實驗動物中心提供，動物許可證［SCXK（滬）2013-0016］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器 ANIT（Cat：249447）購自北京百靈威科技有限公司；總RNA提取試劑盒（Cat：9767）、逆轉錄試劑盒（Cat：RR036A）、熒光定量PCR試劑盒（Cat：RR820A）均購自寶生物工程（大連）有限公司；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（REF：14127070201）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒REF：14126070201）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（REF：141041702201）、總膽紅素（TBIL）試劑盒（REF：14108170201）、總膽汁酸（TBA）試劑盒（REF：13300102101）為德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司產品；總蛋白提取試劑盒（Cat：KGP2100）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒（Cat：PQ0011）、β-actin鼠單抗（Cat：ab008-040）、過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（Cat：GAM007）、過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（Cat：GAR0072）、Potent ECL Kit（Cat：P1425）為杭州聯科生物技術有限公司產品；AQP8鼠單抗（Cat：sc-81870）、AQP9鼠單抗（Cat：sc-74409）為美國Santa Cruz產品；AKT兔單抗（Cat：4960S）、P-AKT（Ser473）兔單抗（Cat：4060S）、PI3K p85兔單抗（Cat：4257S）為美國Cell Signaling Technology產品。日立7020全自動生化分析儀為日本高新技術株會會社產品；柏精核酸蛋白分析儀為英國Biochrom公司產品；AB17900熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品；小型垂直電泳電轉系統(tǒng)為美國Bio Rad司產品；FCE型ProteinSimple化學發(fā)光成像系統(tǒng)為美國ProteinSimple公司產品。免疫組化所用CK19抗體（Cat：PB9715）為博士德生物公司產品，通用型試劑盒（Cat：PV-6000）和DBA顯色試劑盒（Cat：ZLI-9019）為中杉金橋生物公司產品。

1.3 動物分組及處理 所有大鼠每籠4只分籠，于明暗處各12 h，溫度 （25±1）℃，相對濕度60%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng)，普通飼料，自由飲水。48只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為模型組和對照組，每組各24只。麻油配制成4%ANIT，模型組大鼠予以ANIT灌胃1次，100 mg/kg，灌胃體積為1 mL/kg；對照組予以等容量麻油灌胃。分別于灌胃后24 h、48 h、72 h三個時間點處理大鼠，每組各8只，處理前16 h禁食不禁水，空腹麻醉下腹腔靜脈取血分離血清待用，分離肝臟，部分組織以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋待用，其余肝組織放入液氮2 h后，凍存于-80 ℃冰箱中待用。

1.4 血清肝功能檢測 采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠的血清ALT、AST、ALP、TBIL 和TBA水平。

1.5 免疫組化檢測膽管上皮細胞標記物CK19表達 石蠟組織切片脫蠟至水，H2O2孵育15 min阻斷內源性過氧化物酶，加CK19一抗工作液4 ℃冰箱過夜，PBS代替一抗為陰性對照，加生物素標記的二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察CK19陽性顯色表現為胞漿呈黃棕色。

1.6 qRT-PCR檢測肝組織PI3K、AKT1、AKT2、AQP8和AQP9mRNA表達 以柱式總RNA試劑盒提取肝組織總RNA，核酸蛋白分析儀檢測A260/A280比值在1.8～2.0之間，計算總RNA濃度。采用逆轉錄試劑盒以500 ng總RNA為模板合成cDNA，以下列反應體系進行PCR反應：2×SYBR5 μL、10μM上下引物各0.4μL、10 ng/ μL的cDNA模板2μL、加dd H2O補充體積至10μL。PCR反應條件：95 ℃預性5 min，再95℃15 s，60 ℃45 s，循環(huán)擴增40次。溶解曲線分析：95 ℃×15 s，60 ℃×5 s，緩慢上升至95 ℃×15 s。以β-actin為內參，相對表達量（2-△△Ct）來表示目的基因PI3K、AKT1、AKT2、AQP8和AQP9的mRNA表達水平?；蛞镉缮ど锕こ蹋ㄉ虾＃┯邢薰驹O計并合成，見表1。

表1 PI3K、AKT1、AKT2、AQP8、AQP9引物

1.7 Western blot檢測肝組織PI3K、AKT1/2、AQP8、AQP9蛋白表達或磷酸化水平 以全蛋白提取試劑盒經precellys-24生物樣品均質器裂解成勻漿，離心取上清液采用BCA法進行蛋白定量，加上樣緩沖液95 ℃變性后-80 ℃保存。配置10% SDS-PAGE膠，以每孔50 μg上樣，180 V恒壓電泳40 min，濕轉轉膜60～90 min。使用5%BSA室溫封閉1 h后，加入相應一抗工作液PI3K（1∶800）、AKT1/2（1∶700）、P-AKT（1∶600）、AQP8（1∶600）、AQP9（1∶600）、β-Actin（1∶1000），4 ℃冰箱過夜；TBST洗膜后加入相應的抗兔或抗鼠二抗（1∶5000），室溫孵育1 h；TBST洗膜后，以ECL在FCE型ProteinSimple化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光顯影，并用AlphaView SA 3.3.0.0軟件分析灰度值，采用目的蛋白灰度值/β-Actin灰度值代表目的蛋白的相對表達量，P-AKT灰度值/ AKT灰度值代表AKT的磷酸化水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝內膽汁淤積大鼠血清肝功能的動態(tài)變化 對照組大鼠的血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平在灌胃后24 h、48 h、72 h三個時相點基本持平。模型組大鼠三個時相點的血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平均較對照組明顯升高（P<0.05）。模型組大鼠灌服ANIT后，血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平均在48 h達到最高值，72 h有所下降。見圖1。

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05圖1 兩組大鼠在灌胃后24 h、48 h、72 h三個時相點的血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平比較（±s）

2.2 肝內膽汁淤積大鼠肝組織CK19表達的動態(tài)變化 對照組大鼠肝組織中CK19表達較低，灌胃后24 h、48 h、72 h三個時相點的CK19陽性染色較對照組明顯增強，主要集中于匯管區(qū)。模型組大鼠灌胃后48 h、72 h的CK19陽性表達更為明顯。見圖2。

圖 2 兩組大鼠肝組織CK19表達結果（免疫組化×50）

2.3 肝內膽汁淤積大鼠肝組織PI3K、AKT1、AKT2、AQP8、AQP9各基因mRNA表達動態(tài)變化 對照組大鼠肝組織PI3K、AKT1、AKT2及下游靶基因AQP8、AQP9的mRNA表達水平在灌胃后24 h、48 h、72 h基本持平，模型組大鼠肝組織PI3K、AKT1、AKT2及下游靶基因AQP8、AQP9mRNA表達水平均不同程度低于對照組的同一時相點，除24 h時相點模型組大鼠AKT1、AKT2和AQP8 mRNA表達水平與對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其他均顯著下降（P<0.01）。模型組大鼠在灌服ANIT后PI3K、AKT1、AKT2及其下游靶基因AQP8、AQP9的mRNA表達水平在48 h達到最低值，72 h有所恢復，但明顯低于對照組（P<0.01）。見圖3。

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05圖3 兩組大鼠肝組織PI3K、AKT1、AKT2、AQP8、AQP9各基因mRNA表達水平比較（±s）

2.4 肝內膽汁淤積大鼠肝組織PI3K、AKT1/2、AQP8、AQP9蛋白或磷酸化水平動態(tài)變化 對照組大鼠肝組織PI3K、AKT1/2及下游靶蛋白AQP8、AQP9的蛋白表達水平和AKT磷酸化水平在灌胃后24 h、48 h、72 h基本持平，模型組大鼠3個時相點的肝組織PI3K、AKT1/2及下游靶蛋白AQP8、AQP9表達水平和AKT蛋白磷酸化水平均低于對照組，其中AKT磷酸化水平較對照組顯著降低（P<0.01）。模型組大鼠PI3K、AKT及下游靶蛋白AQP8、AQP9的蛋白表達水平在灌服ANIT后48 h達到最低值，72 h有所回升，但仍低于對照組。AKT磷酸化水平，在灌服ANIT后24 h、48 h、72 h持續(xù)降低。見圖4和圖5。

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05圖5 兩組大鼠肝組織AQP8、AQP9、AKT蛋白及AKT磷酸化水平比較

圖4 兩組不同時間AQP8、AQP9、PI3K、AKT、P-AKT、β-actin蛋白條帶

3 討論

膽汁淤積的具體機制尚未完全明確。有研究顯示，膽汁分泌可能與水通道蛋白的調控有關［9］。水通道蛋白（AQP）是一系列廣泛分布于哺乳動物、植物和低等生物的跨膜蛋白，充當著細胞水液進出的通道［10-11］。在膽汁分泌的過程中，肝細胞、膽管上皮細胞可以介導AQP的表達，改變水液在細胞內外的流動，建立細胞膜兩側濃度差，進而調控膽汁分泌。因此，膽汁淤積可能是AQP表達減少導致水滲透性降低，無法建立細胞內外濃度差，膽汁無法順利分泌所導致。AQP8、AQP9作為水通道蛋白家族中最重要的蛋白，在膽汁分泌、合成中發(fā)揮關鍵作用［12］。研究發(fā)現，靜止狀態(tài)下AQP8主要位于細胞內的囊泡中，只有少量AQP8位于細胞膜、膽管膜［13-14］，AQP9在細胞膜上的表達量明顯高于細胞質中［15］。在一定條件下，AQP8、AQP9會向細胞膜轉運，調控水液進出［14］，介導膽汁分泌［16］。AQP8、AQP9表達缺陷會引起膽汁分泌功能障礙，造成膽汁淤積［17-18］，進而引起肝損傷。已有實驗證明，肝損傷小鼠肝組織中的AQP9表達顯著降低［19］。PI3K/AKT作為AQP8、AQP9的上游通路，可以介導調控囊泡運輸和膽汁形成的信號通路［20］，磷酸化的PI3K會促進AQP8向細胞膜轉運，提高AQP9的表達［21］。PI3K/AKT通路不僅可以通過調控下游AQP8、AQP9的轉運造成肝損傷，也可以直接介導死亡受體，造成肝細胞凋亡及肝損傷［22］。研究證明，抑制PI3K/AKT的表達會增加肝臟損傷、炎癥及肝癌的發(fā)生風險［23］，成年小鼠肝臟中Akt1和Akt2的缺失會導致慢性肝損傷、炎癥和肝癌。

α-異硫氰酸萘酯（ANIT） 能造成大鼠膽汁淤積性肝損傷，其誘導的大鼠肝損傷病理改變與人類膽汁淤積性肝損傷相似，因此被廣泛用于建立膽汁淤積性肝損傷模型進行相關研究。本實驗模型組大鼠灌服ANTI后出現肝損傷，血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平均顯著高于對照組，提示建模成功。大鼠肝損傷程度在48 h最高，72 h后有所恢復，提示ANTI的肝毒性隨著作用時間的延長逐漸減弱，說明ANTI誘導的大鼠膽汁淤積性肝損傷模型具有局限性，造模時應選擇合適的藥物作用時長。模型組大鼠肝組織CK19染色陽性，提示膽管上皮細胞增生，出現膽汁淤積。在灌服ANIT后的24 h、48 h、72 h三個時相點，模型組大鼠肝組織PI3K、AKT和靶蛋白AQP8、AQP9的mRNA及蛋白表達水平、AKT磷酸化水平均低于對照組，提示ANTI誘導大鼠肝損傷會抑制PI3K、AKT、AQP8、AQP9的表達及AKT的活化。ANIT灌胃48 h后，上述基因表達抑制最顯著，72 h開始恢復，與大鼠肝損傷變化趨勢相符，提示PI3K、AKT、AQP8、AQP9的表達與ANTI誘導大鼠膽汁淤積性肝損傷的機制密切相關。但AKT的磷酸化水平在24 h、48 h、72 h三個時相點持續(xù)降低，72 h后未出現明顯回升，提示可能存在新的機制通過調控AKT的磷酸化造成大鼠肝損傷，有待進一步深入研究。

綜上所述，ANTI可以通過抑制PI3K/AKT信號通路的活化來下調AQP8、AQP9的表達，且與大鼠的肝損傷變化相一致，但具有時效性，或可能存在未知機制通過調控AKT的磷酸化造成大鼠肝損傷。