亞低溫通過(guò)抑制AIF核轉(zhuǎn)位改善大鼠顱腦損傷

丁華強(qiáng) 廖 帥 汪棋笙 全星運(yùn) 劉勝杰 廖落星 劉 亮

目前，顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是導(dǎo)致青壯年死亡和殘疾的主要原因，成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。TBI 后神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損的主要原因。細(xì)胞凋亡分子通路主要包括Caspase 依賴性通路和非Caspase 依賴性通路[2]。凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）在非Caspase 依賴性通路中發(fā)揮重要作用。研究表明，TBI 后神經(jīng)細(xì)胞凋亡與AIF 核轉(zhuǎn)位有關(guān)[3，4]。雖然亞低溫能通過(guò)降低顱內(nèi)壓、減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞興奮性毒性和抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡等機(jī)制阻止TBI繼發(fā)性損傷，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用[5～10]，但是臨床亞低溫治療TBI仍存在一定的爭(zhēng)議。以往有關(guān)亞低溫對(duì)TBI 后神經(jīng)細(xì)胞死亡的作用研究主要集中在對(duì)Caspase 依賴性通路[8，9，11]。本研究通過(guò)觀察亞低溫對(duì)大鼠TBI 后非Caspase 依賴性神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵蛋白AIF 定位表達(dá)的影響，為臨床亞低溫治療TBI提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 取36只清潔級(jí)成年雄性SD大鼠[體重300～350g，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（許可證號(hào)：SYXK-2018-065）]，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組：假手術(shù)（n=12）、TBI 組（n=12）和亞低溫組（n=12）。

1.2 TBI模型的制備 采用控制性皮質(zhì)撞擊法制作大鼠TBI 模型[12]。術(shù)前禁食12 h，腹腔注射3%水合氯醛（1 ml/100g）麻醉，俯臥位固定于立體定向頭架上。沿中線切開(kāi)頭皮，暴露右頂骨，顱骨矢狀縫中點(diǎn)旁約2 mm 處，牙鉆鉆直徑6 mm圓形骨窗，暴露硬腦膜。致傷參數(shù)：打擊速度4.0 m/s，打擊深度2.8 mm，停留時(shí)間50 ms，打擊頭直徑5.0 mm。假手術(shù)組大鼠只暴露硬腦膜不予以CCI打擊。

1.3 亞低溫的實(shí)施 亞低溫組參照J(rèn)iang等[6]報(bào)道的方法，采用冰浴加間斷使用冰袋的方法降溫，15 min內(nèi)使直腸溫度降至（33.0±1.0）℃，并維持6 h，治療結(jié)束后自然復(fù)溫至37 ℃。假手術(shù)組和模型組大鼠置于常溫環(huán)境，溫度維持在（37±0.5）℃。使用體溫監(jiān)測(cè)儀持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠直腸溫度。

1.4 腦組織取材TBI 后24 h，4%多聚甲醛灌注固定后取出完整腦組織，用4%多聚甲醛后固定24 h。冠狀切取腦組織塊，常規(guī)梯度酒精脫水、透明、浸蠟，然后石蠟包埋用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.5 HE染色 每組取6只大鼠腦組織標(biāo)本，石蠟切片（厚5 μm），脫蠟，梯度乙醇水化，HE 染色，脫水，封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 每組取6 只大鼠腦組織標(biāo)本，石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、檸檬酸鹽緩沖液行抗原熱修復(fù)，3%H2O2浸泡10 min，PBS洗5 min×3次，10%山羊血清室溫封閉10 min，甩掉血清，滴加一抗AIF（1:100；美國(guó)Abcam 公司），4 ℃孵育過(guò)夜；常溫復(fù)溫1 h，PBS洗5 min×3次，滴加二抗，常溫孵育30 min，PBS洗5 min×3次，滴加DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min，出現(xiàn)深棕色后，自來(lái)水沖洗終止染色，蘇木素復(fù)染；梯度乙醇脫水，干片后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 每組取6只大鼠，TBI后24 h 麻醉后立即斷頭處死，冰上取損傷側(cè)大腦組織，用RIPA裂解液提取總蛋白。按線粒體提取試劑盒和細(xì)胞核蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說(shuō)明書(shū)提取線粒體蛋白和細(xì)胞核蛋白。BCA法（上海碧云天生物技術(shù)研究所）進(jìn)行定量，SDSPAGE膠分離，PVDF轉(zhuǎn)膜。10%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，PBST 洗10 min×3 次，加一抗AIF（1:1 000；美國(guó)Abcam 公司）、Caspase-3（1:1 000；上海碧云天生物技術(shù)研究所），小鼠抗一抗β-actin（1:1 000；上海碧云天生物技術(shù)研究所）、Histone H3（1:1 000；上海碧云天生物技術(shù)研究所）、COXⅣ（1:1 000；美國(guó)Abbkine公司）4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗10 min×3次，加山羊抗兔IgG 二抗或山羊抗小鼠IgG 二抗室溫孵育1 h。PBST洗10 min×3次，ECL法顯影，使用ImageJ軟件測(cè)定灰度值。β-actin、Histone H3 和COXⅣ分別作為總蛋白、細(xì)胞核蛋白和線粒體蛋白內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件分析；正態(tài)分布計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 亞低溫對(duì)TBI 大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)挫傷及出血；TBI 組和亞低溫組可見(jiàn)沿灰白質(zhì)界面的挫傷和出血，但亞低溫組挫傷和出血灶明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 亞低溫對(duì)TBI大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（HE，×40）

2.2 亞低溫對(duì)TBI大鼠AIF核轉(zhuǎn)位的影響 免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，TBI 組和亞低溫組損傷腦組織caspase-3 蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.01），細(xì)胞核AIF蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.01），而線粒體AIF 表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。與TBI 組比較，亞低溫組損傷腦組織caspase-3蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.01），細(xì)胞核AIF蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.01），而線粒體AIF 表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 亞低溫對(duì)TBI大鼠損傷腦組織caspase-3和AIF表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組AIF 位于大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元細(xì)胞核外。與假手術(shù)組比較，TBI 組與亞低溫組大鼠損傷側(cè)大腦皮質(zhì)及同側(cè)海馬區(qū)AIF從線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P＜0.01）。與TBI 組比較，亞低溫組大鼠損傷側(cè)大腦皮質(zhì)及同側(cè)海馬區(qū)AIF發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 亞低溫對(duì)TBI大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)和海馬AIF表達(dá)的影響（免疫組化染色，×200；紅色↑為AIF陽(yáng)性細(xì)胞）

3 討論

亞低溫能減輕TBI 后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)亞低溫能減輕大鼠TBI后腦挫傷和出血，其機(jī)制可能與亞低溫抑制AIF 核轉(zhuǎn)位、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

研究證實(shí)TBI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡與caspase依賴性細(xì)胞凋亡機(jī)制相關(guān)[13～15]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)TBI 后大鼠傷側(cè)腦組織caspase-3 表達(dá)水平明顯升高。盡管如此，AIF 介導(dǎo)的非caspase 依賴性細(xì)胞凋亡通路同樣在TBI 繼發(fā)性損傷中起著十分重要的作用[16]。AIF是一種存在于線粒體內(nèi)膜、相對(duì)分子量為57 000 的核黃素蛋白。當(dāng)線粒體外膜通透性增加后，AIF 釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與染色質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚和大規(guī)模DNA 片段化，最終引發(fā)非caspase 依賴性細(xì)胞凋亡[17]。AIF 核轉(zhuǎn)位是非caspase-3依賴性細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[18]。Zhang等[3]研究發(fā)現(xiàn)大鼠TBI 后傷側(cè)皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元發(fā)生AIF 由線粒體向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，并伴隨有大量DNA片段化。Slammer 等[4]研究發(fā)現(xiàn)敲除AIF 基因明顯減輕TBI 小鼠繼發(fā)性損傷。本實(shí)驗(yàn)也表明大鼠TBI 后傷側(cè)皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生明顯的AIF核轉(zhuǎn)位。

TBI動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫通過(guò)降低TIMP-3、Bax、caspase-3、caspase-8及RIPK1等caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10，11，19]。我們的實(shí)驗(yàn)不僅證實(shí)亞低溫能夠下調(diào)TBI后caspase-3的表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)亞低溫能夠抑制線粒體內(nèi)AIF向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。其機(jī)制可能為亞低溫可以保護(hù)線粒體的完整性，降低線粒體通透性，從而減少AIF向細(xì)胞質(zhì)的釋放和核內(nèi)的轉(zhuǎn)移[20]。

總之，亞低溫可通過(guò)抑制AIF的核轉(zhuǎn)位減輕TBI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。