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    GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合線性探針檢測技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究

    2021-10-13 09:19:54李靜郁晨蕾張陽奕王莉莉沈旭輝陳煒江淵
    中國防癆雜志 2021年10期
    關(guān)鍵詞:利福平涂片耐藥性

    李靜 郁晨蕾 張陽奕 王莉莉 沈旭輝 陳煒 江淵

    《中國結(jié)核病預(yù)防控制工作技術(shù)規(guī)范(2020年版)》中對于肺結(jié)核患者耐藥篩查要求為,對具備分子生物學(xué)核酸耐藥檢測技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室,優(yōu)先采用分子生物學(xué)耐藥檢測;對初治患者首次分子生物學(xué)檢測為利福平耐藥,需取另一份痰標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,若仍為利福平耐藥,則判定為利福平耐藥,否則按利福平敏感處理。對肺結(jié)核的治療方式要求根據(jù)肺結(jié)核病情及利福平耐藥與否制定不同的治療方案,由此可見,應(yīng)用分子生物學(xué)檢測利福平的耐藥性對于臨床診斷和后續(xù)化療方案的制定可以起到關(guān)鍵性的作用。

    上海市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室在2016年根據(jù)國家結(jié)核病分級診療和綜合防治服務(wù)模式試點(diǎn)工作的要求逐步配備了GeneXpert MTB/RIF(簡稱GeneXpert)設(shè)備,并開展臨床檢測。本研究收集2017年12月至2018年12月上海市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院臨床診斷為肺結(jié)核患者的培養(yǎng)陽性菌株,在上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室采用線性探針檢測技術(shù)(LPA)進(jìn)行利福平耐藥性檢測,評估從患者痰樣本中采用GeneXpert檢測利福平耐藥性與從患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得的陽性菌株采用LPA檢測利福平耐藥結(jié)果的一致性,探討分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)在臨床工作中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

    材料和方法

    一、標(biāo)本來源和研究內(nèi)容

    選擇上海市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院作為研究現(xiàn)場,納入2017年12月至2018年12月初診的可疑肺結(jié)核患者。肺結(jié)核可疑癥狀者的標(biāo)準(zhǔn)為咳嗽、咯痰時(shí)間超過2周,因呼吸道癥狀接受檢查。19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室對初診肺結(jié)核可疑癥狀者的同一份合格痰樣本開展痰涂片、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“液體培養(yǎng)”)、GeneXpert共3種方法檢測,合格的痰樣本為黏液樣或干酪樣性狀的痰液,避免使用口水痰,痰量1~3 ml為宜。

    上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對收集到的4827例患者的檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,去除858份重復(fù)樣本、26份培養(yǎng)污染樣本、40份GeneXpert檢測失敗樣本,最終對3903份有效樣本進(jìn)行GeneXpert檢測。

    上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對2017年12月至2018年12月19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院臨床診斷的772例(包含于在4827例患者中)肺結(jié)核患者的培養(yǎng)陽性菌株,采用16S rRNA測序方法進(jìn)行菌種鑒定,65例(8.42%)為非結(jié)核分枝桿菌,707例(91.58%)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,對707株結(jié)核分枝桿菌臨床菌株采用LPA進(jìn)行利福平耐藥性檢測,對于LPA法得到的利福平耐藥性檢測結(jié)果,與使用患者痰樣本進(jìn)行GeneXpert檢測結(jié)果不一致者,采用其培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行GeneXpert復(fù)測,并同時(shí)采用最低抑菌濃度法(minimum inhibitory concentration,MIC)進(jìn)行復(fù)核,評估LPA和GeneXpert兩種分子生物學(xué)檢測技術(shù)檢測利福平耐藥性的情況。

    二、檢測方法

    1. 痰涂片檢查:按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[1]中的操作程序執(zhí)行。

    2. 分離培養(yǎng)和鑒定:分離培養(yǎng)采用N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH法進(jìn)行標(biāo)本處理,按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]進(jìn)行操作。 對于培養(yǎng)陽性菌株,19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室采用免疫色譜法(膠體金法)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌鑒定。上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室采用16S rRNA測序[T-100 PCR儀(Bio-Rad公司)、GelDocTMXR+紫外凝膠成像儀(Bio-Rad公司)]方法進(jìn)行菌種鑒定。

    3. 藥物敏感性(簡稱“藥敏”)試驗(yàn):采用結(jié)核分枝桿菌最低抑菌濃度法,使用TREK Sensititre MYCOTBI藥敏板(美國賽默飛世爾科技公司)按照說明書進(jìn)行操作。參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI M24-A2標(biāo)準(zhǔn),利福平臨界濃度為1.0 μg/ml,耐藥判定標(biāo)準(zhǔn):菌株的MIC值>臨界濃度值,則為耐藥;MIC值≤臨界濃度值,則為敏感。

    4. GeneXpert檢測:按照GeneXpert MTB/RIF(美國Cepheid公司)操作說明書上的步驟進(jìn)行,結(jié)果通過專用軟件判讀。

    5. LPA檢測:采用GenoType MTBDRplus耐藥檢測試劑盒(德國Hain MTBDRplus公司),按操作說明書進(jìn)行操作。

    三、質(zhì)量控制

    室內(nèi)質(zhì)控:MIC法采用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)作為質(zhì)控菌株;LPA采用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和耐藥基因位點(diǎn)的質(zhì)控菌株,無菌蒸餾水為空白對照;室間質(zhì)控:上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測實(shí)驗(yàn)室通過國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的藥敏熟練度測試;上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測實(shí)驗(yàn)室及各結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院均通過國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的分子生物學(xué)質(zhì)控,結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)污染率均小于8%。

    四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。三種不同檢測方法陽性檢出率的比較采用配對χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)顯著性水平定為0.05;以液體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算痰涂片和GeneXpert檢測結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、符合率和一致性(Kappa檢驗(yàn)),符合率95%CI值的計(jì)算采用Wilson估計(jì)法;LPA和GeneXpert兩種分子檢測技術(shù)檢測利福平耐藥性的一致性采用Kappa檢驗(yàn),Kappa≥0.75說明一致性較好,Kappa<0.4說明一致性較差,0.75>Kappa≥0.4說明一致性一般。

    結(jié) 果

    一、GeneXpert檢測結(jié)核分枝桿菌的效能

    3903例痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行痰涂片、液體培養(yǎng)(培養(yǎng)陽性菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌)和GeneXpert檢測,陽性檢出率分別為19.63%(766/3903)、25.93%(1012/3903)、25.16%(982/3903)。GeneXpert陽性檢出率高于痰涂片,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.390,P<0.001);略低于液體培養(yǎng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.610,P=0.436)。以液體培養(yǎng)(培養(yǎng)陽性鑒定為結(jié)核分枝桿菌)為標(biāo)準(zhǔn),GeneXpert檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為81.23%(822/1012)、94.47%(2731/2891)、83.71%(822/982)、93.50%(2731/2921),兩種方法檢測結(jié)果符合率為91.03%,Kappa值為0.764,兩者一致性較好;痰涂片檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為64.92%、96.23%、85.77%、88.68%,兩種方法檢測結(jié)果符合率為88.11%,Kappa值為0.664,兩者一致性一般。見表1。

    表1 以液體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)比較痰涂片和GeneXpert檢測痰樣本的效能(3903份)

    二、LPA和GeneXpert檢測利福平耐藥性的效能分析

    (一)兩種方法檢測利福平耐藥情況和一致性分析

    707株結(jié)核分枝桿菌中,采用LPA檢測利福平耐藥有39例(5.52%),采用GeneXpert檢測痰樣本的利福平耐藥有41例(5.80%),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.050,P=0.818)。兩種方法從同一例患者初診痰樣本與初診痰培養(yǎng)陽性菌株中檢測利福平結(jié)果符合率為98.30%(695/707),95%CI值為97.06%~99.03%;Kappa(95%CI)值為0.841(0.753~0.929),說明兩種方法檢測利福平耐藥性的一致性很好。

    (二)檢測結(jié)果不一致復(fù)核情況

    兩種方法檢測不一致共計(jì)12例。其中,5例LPA檢測為利福平耐藥但GeneXpert檢測為利福平敏感,7例LPA檢測為利福平敏感但GeneXpert檢測為利福平耐藥。見表2。

    表2 12株LPA和GeneXpert檢測利福平耐藥性不一致結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果及復(fù)核結(jié)果

    1. GeneXpert復(fù)測情況:12例采用菌株復(fù)測,5例利福平前后結(jié)果一致,均為耐藥(41.67%);7例利福平耐藥性前后結(jié)果不一致。

    2. 復(fù)核情況:1例患者的菌株為混合生長無法進(jìn)行藥敏檢測,11例患者的菌株采用MIC法進(jìn)行利福平耐藥性復(fù)核。LPA、MIC和GeneXpert 3種方法檢測利福平的耐藥性,7例結(jié)果均一致(63.64%),4例結(jié)果不一致。不一致結(jié)果中,2例 LPA和MIC法檢測為利福平敏感而GeneXpert檢測為利福平耐藥,2例LPA檢測為利福平敏感而GeneXpert和MIC法檢測為利福平耐藥。

    討 論

    WHO于2010年推薦GeneXpert檢測技術(shù)用于肺結(jié)核的診斷[3],該項(xiàng)技術(shù)已在多個國家和地區(qū)進(jìn)行了驗(yàn)證評估,顯示其高敏感度和高特異度[4-7]。本研究結(jié)果顯示,以液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),GeneXpert檢測的敏感度和一致性均高于痰涂片,特異度低于痰涂片,與國內(nèi)報(bào)道略有不同[7-8]。同時(shí)比較從患者痰樣本中采用GeneXpert與從患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得的陽性菌株,采用LPA檢測利福平的耐藥性,結(jié)果顯示兩種檢測技術(shù)對同一例患者初診痰樣本與初診痰培養(yǎng)陽性菌株中檢測利福平結(jié)果符合率達(dá)98.30%。對12例兩種方法檢測結(jié)果不一致者使用陽性菌株分別采用GeneXpert 和MIC法檢測,結(jié)果顯示3種方法檢測利福平耐藥性7例結(jié)果(63.64%)一致;GeneXpert復(fù)測5例(41.67%)前后結(jié)果一致。

    本研究采用不同方法檢測結(jié)核分枝桿菌,GeneXpert陽性檢出率(25.16%)高于痰涂片法(19.63%),略低于液體培養(yǎng)法(25.93%)。相比液體培養(yǎng),GeneXpert除標(biāo)本前處理外檢測均在封閉的反應(yīng)盒內(nèi)自動完成,具有操作簡單、快速、交叉污染低、安全等特點(diǎn)。GeneXpert從檢測到報(bào)告僅需2.5 h,比液體培養(yǎng)(陽性時(shí)間11~22 d)[9]大大縮短了檢測時(shí)間。GeneXpert檢測結(jié)核分枝桿菌的效能顯示其檢測敏感度、陰性預(yù)測值為81.23%和93.50%,高于痰涂片法(64.92%和88.68%),其特異度和陽性預(yù)測值(94.47%和83.71%)略低于痰涂片法(96.23%和85.77%)。此結(jié)果與陳蕾和吳桂輝[8]研究得出的GeneXpert檢測特異度和敏感度結(jié)果略有不同,分析一種原因可能是由于不同的檢測方法使用前處理方法各不相同,因此雖然使用同一份痰樣本,但是由于痰樣本性狀黏稠,不能保證樣本能平均分配,特別是對于低陽性級別的痰樣本;還有一種原因可能是不同檢測方法檢出限的不同而影響其檢測效能。多項(xiàng)研究顯示,當(dāng)結(jié)核分枝桿菌含量達(dá)到5×103~5×104CFU/ml時(shí)痰涂片法才能得到陽性結(jié)果,液體培養(yǎng)法檢測限為10~100 CFU/ml,而GeneXpert技術(shù)最低檢出限為131 CFU/ml[8, 10-12]。本研究也顯示,GeneXpert與液體培養(yǎng)法兩種方法檢測結(jié)果符合率高,一致性較好。

    本研究采用LPA檢測707株結(jié)核分枝桿菌菌株,利福平耐藥有39株(5.52%)。采用GeneXpert檢測痰樣本結(jié)果顯示,利福平耐藥有41株(5.80%)。LPA和GeneXpert兩種方法從同一例患者初診痰樣本與初診痰培養(yǎng)陽性菌株中檢測利福平耐藥性結(jié)果符合率為98.30%,Kappa值為0.841,說明兩種方法檢測利福平耐藥一致性較好。對于12例 LPA檢測利福平與GeneXpert檢測痰樣本不一致的結(jié)果,本研究對其培養(yǎng)陽性菌株采用GeneXpert進(jìn)行復(fù)測,除1株為混合生長,其余11株進(jìn)行MIC法藥敏檢測。結(jié)果顯示,利福平檢測結(jié)果3種方法一致7株,4株不一致結(jié)果中,LPA檢測結(jié)果利福平均為敏感;GeneXpert檢測結(jié)果為利福平耐藥,均表現(xiàn)為probe E(529~533)探針突變;MIC法2例表現(xiàn)為利福平敏感,1例為低水平耐藥,1例為高水平耐藥。2例LPA和MIC檢測為利福平敏感而GeneXpert結(jié)果為耐藥,可能是在rpoB基因上發(fā)生了沉默突變而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。有研究報(bào)道,在rpoB基因上發(fā)生沉默基因突變,這類基因不表達(dá)或低表達(dá)[13],與利福平耐藥無關(guān)。2例LPA檢測利福平敏感而GeneXpert和MIC結(jié)果為耐藥,是否為LPA檢測利福平耐藥性敏感度不高,將在今后的工作中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。對于復(fù)測的12例GeneXpert出現(xiàn)7例前后結(jié)果不一致的結(jié)果,筆者認(rèn)為有可能是由于兩類樣本的優(yōu)勢菌群不同而產(chǎn)生利福平耐藥性檢測結(jié)果的差異。趙冰等[14]研究表明,標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌含量會影響GeneXpert檢測利福平耐藥的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示,5例GeneXpert檢測痰標(biāo)本中利福平敏感者菌株復(fù)測5例均為耐藥,這5例患者中3例患者痰涂片結(jié)果僅為1~2條。本研究未對全部入選的患者菌株進(jìn)行復(fù)測,現(xiàn)有的數(shù)據(jù)還不足以證明以上結(jié)論,我們將在今后的工作中進(jìn)行進(jìn)一步探討。

    綜上所述,GeneXpert和LPA兩種分子檢測方法檢測利福平耐藥性總體符合率較高,但也可能存在漏檢或過診情況。因此,有條件的實(shí)驗(yàn)室可考慮引入其他分子檢測方法以彌補(bǔ)上述方法的不足,為臨床精準(zhǔn)診斷和治療提供準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

    志謝感謝上海市疾病預(yù)防控制中心郭俊濤副主任醫(yī)師對本文統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和結(jié)果的指導(dǎo)和審核。

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