• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合線性探針檢測技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究

    2021-10-13 09:19:54李靜郁晨蕾張陽奕王莉莉沈旭輝陳煒江淵
    中國防癆雜志 2021年10期
    關(guān)鍵詞:利福平涂片耐藥性

    李靜 郁晨蕾 張陽奕 王莉莉 沈旭輝 陳煒 江淵

    《中國結(jié)核病預(yù)防控制工作技術(shù)規(guī)范(2020年版)》中對于肺結(jié)核患者耐藥篩查要求為,對具備分子生物學(xué)核酸耐藥檢測技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室,優(yōu)先采用分子生物學(xué)耐藥檢測;對初治患者首次分子生物學(xué)檢測為利福平耐藥,需取另一份痰標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,若仍為利福平耐藥,則判定為利福平耐藥,否則按利福平敏感處理。對肺結(jié)核的治療方式要求根據(jù)肺結(jié)核病情及利福平耐藥與否制定不同的治療方案,由此可見,應(yīng)用分子生物學(xué)檢測利福平的耐藥性對于臨床診斷和后續(xù)化療方案的制定可以起到關(guān)鍵性的作用。

    上海市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室在2016年根據(jù)國家結(jié)核病分級診療和綜合防治服務(wù)模式試點(diǎn)工作的要求逐步配備了GeneXpert MTB/RIF(簡稱GeneXpert)設(shè)備,并開展臨床檢測。本研究收集2017年12月至2018年12月上海市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院臨床診斷為肺結(jié)核患者的培養(yǎng)陽性菌株,在上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室采用線性探針檢測技術(shù)(LPA)進(jìn)行利福平耐藥性檢測,評估從患者痰樣本中采用GeneXpert檢測利福平耐藥性與從患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得的陽性菌株采用LPA檢測利福平耐藥結(jié)果的一致性,探討分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)在臨床工作中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

    材料和方法

    一、標(biāo)本來源和研究內(nèi)容

    選擇上海市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院作為研究現(xiàn)場,納入2017年12月至2018年12月初診的可疑肺結(jié)核患者。肺結(jié)核可疑癥狀者的標(biāo)準(zhǔn)為咳嗽、咯痰時(shí)間超過2周,因呼吸道癥狀接受檢查。19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室對初診肺結(jié)核可疑癥狀者的同一份合格痰樣本開展痰涂片、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“液體培養(yǎng)”)、GeneXpert共3種方法檢測,合格的痰樣本為黏液樣或干酪樣性狀的痰液,避免使用口水痰,痰量1~3 ml為宜。

    上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對收集到的4827例患者的檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,去除858份重復(fù)樣本、26份培養(yǎng)污染樣本、40份GeneXpert檢測失敗樣本,最終對3903份有效樣本進(jìn)行GeneXpert檢測。

    上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對2017年12月至2018年12月19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院臨床診斷的772例(包含于在4827例患者中)肺結(jié)核患者的培養(yǎng)陽性菌株,采用16S rRNA測序方法進(jìn)行菌種鑒定,65例(8.42%)為非結(jié)核分枝桿菌,707例(91.58%)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,對707株結(jié)核分枝桿菌臨床菌株采用LPA進(jìn)行利福平耐藥性檢測,對于LPA法得到的利福平耐藥性檢測結(jié)果,與使用患者痰樣本進(jìn)行GeneXpert檢測結(jié)果不一致者,采用其培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行GeneXpert復(fù)測,并同時(shí)采用最低抑菌濃度法(minimum inhibitory concentration,MIC)進(jìn)行復(fù)核,評估LPA和GeneXpert兩種分子生物學(xué)檢測技術(shù)檢測利福平耐藥性的情況。

    二、檢測方法

    1. 痰涂片檢查:按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[1]中的操作程序執(zhí)行。

    2. 分離培養(yǎng)和鑒定:分離培養(yǎng)采用N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH法進(jìn)行標(biāo)本處理,按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]進(jìn)行操作。 對于培養(yǎng)陽性菌株,19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室采用免疫色譜法(膠體金法)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌鑒定。上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室采用16S rRNA測序[T-100 PCR儀(Bio-Rad公司)、GelDocTMXR+紫外凝膠成像儀(Bio-Rad公司)]方法進(jìn)行菌種鑒定。

    3. 藥物敏感性(簡稱“藥敏”)試驗(yàn):采用結(jié)核分枝桿菌最低抑菌濃度法,使用TREK Sensititre MYCOTBI藥敏板(美國賽默飛世爾科技公司)按照說明書進(jìn)行操作。參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI M24-A2標(biāo)準(zhǔn),利福平臨界濃度為1.0 μg/ml,耐藥判定標(biāo)準(zhǔn):菌株的MIC值>臨界濃度值,則為耐藥;MIC值≤臨界濃度值,則為敏感。

    4. GeneXpert檢測:按照GeneXpert MTB/RIF(美國Cepheid公司)操作說明書上的步驟進(jìn)行,結(jié)果通過專用軟件判讀。

    5. LPA檢測:采用GenoType MTBDRplus耐藥檢測試劑盒(德國Hain MTBDRplus公司),按操作說明書進(jìn)行操作。

    三、質(zhì)量控制

    室內(nèi)質(zhì)控:MIC法采用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)作為質(zhì)控菌株;LPA采用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和耐藥基因位點(diǎn)的質(zhì)控菌株,無菌蒸餾水為空白對照;室間質(zhì)控:上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測實(shí)驗(yàn)室通過國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的藥敏熟練度測試;上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測實(shí)驗(yàn)室及各結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院均通過國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的分子生物學(xué)質(zhì)控,結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)污染率均小于8%。

    四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。三種不同檢測方法陽性檢出率的比較采用配對χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)顯著性水平定為0.05;以液體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算痰涂片和GeneXpert檢測結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、符合率和一致性(Kappa檢驗(yàn)),符合率95%CI值的計(jì)算采用Wilson估計(jì)法;LPA和GeneXpert兩種分子檢測技術(shù)檢測利福平耐藥性的一致性采用Kappa檢驗(yàn),Kappa≥0.75說明一致性較好,Kappa<0.4說明一致性較差,0.75>Kappa≥0.4說明一致性一般。

    結(jié) 果

    一、GeneXpert檢測結(jié)核分枝桿菌的效能

    3903例痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行痰涂片、液體培養(yǎng)(培養(yǎng)陽性菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌)和GeneXpert檢測,陽性檢出率分別為19.63%(766/3903)、25.93%(1012/3903)、25.16%(982/3903)。GeneXpert陽性檢出率高于痰涂片,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.390,P<0.001);略低于液體培養(yǎng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.610,P=0.436)。以液體培養(yǎng)(培養(yǎng)陽性鑒定為結(jié)核分枝桿菌)為標(biāo)準(zhǔn),GeneXpert檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為81.23%(822/1012)、94.47%(2731/2891)、83.71%(822/982)、93.50%(2731/2921),兩種方法檢測結(jié)果符合率為91.03%,Kappa值為0.764,兩者一致性較好;痰涂片檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為64.92%、96.23%、85.77%、88.68%,兩種方法檢測結(jié)果符合率為88.11%,Kappa值為0.664,兩者一致性一般。見表1。

    表1 以液體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)比較痰涂片和GeneXpert檢測痰樣本的效能(3903份)

    二、LPA和GeneXpert檢測利福平耐藥性的效能分析

    (一)兩種方法檢測利福平耐藥情況和一致性分析

    707株結(jié)核分枝桿菌中,采用LPA檢測利福平耐藥有39例(5.52%),采用GeneXpert檢測痰樣本的利福平耐藥有41例(5.80%),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.050,P=0.818)。兩種方法從同一例患者初診痰樣本與初診痰培養(yǎng)陽性菌株中檢測利福平結(jié)果符合率為98.30%(695/707),95%CI值為97.06%~99.03%;Kappa(95%CI)值為0.841(0.753~0.929),說明兩種方法檢測利福平耐藥性的一致性很好。

    (二)檢測結(jié)果不一致復(fù)核情況

    兩種方法檢測不一致共計(jì)12例。其中,5例LPA檢測為利福平耐藥但GeneXpert檢測為利福平敏感,7例LPA檢測為利福平敏感但GeneXpert檢測為利福平耐藥。見表2。

    表2 12株LPA和GeneXpert檢測利福平耐藥性不一致結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果及復(fù)核結(jié)果

    1. GeneXpert復(fù)測情況:12例采用菌株復(fù)測,5例利福平前后結(jié)果一致,均為耐藥(41.67%);7例利福平耐藥性前后結(jié)果不一致。

    2. 復(fù)核情況:1例患者的菌株為混合生長無法進(jìn)行藥敏檢測,11例患者的菌株采用MIC法進(jìn)行利福平耐藥性復(fù)核。LPA、MIC和GeneXpert 3種方法檢測利福平的耐藥性,7例結(jié)果均一致(63.64%),4例結(jié)果不一致。不一致結(jié)果中,2例 LPA和MIC法檢測為利福平敏感而GeneXpert檢測為利福平耐藥,2例LPA檢測為利福平敏感而GeneXpert和MIC法檢測為利福平耐藥。

    討 論

    WHO于2010年推薦GeneXpert檢測技術(shù)用于肺結(jié)核的診斷[3],該項(xiàng)技術(shù)已在多個國家和地區(qū)進(jìn)行了驗(yàn)證評估,顯示其高敏感度和高特異度[4-7]。本研究結(jié)果顯示,以液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),GeneXpert檢測的敏感度和一致性均高于痰涂片,特異度低于痰涂片,與國內(nèi)報(bào)道略有不同[7-8]。同時(shí)比較從患者痰樣本中采用GeneXpert與從患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得的陽性菌株,采用LPA檢測利福平的耐藥性,結(jié)果顯示兩種檢測技術(shù)對同一例患者初診痰樣本與初診痰培養(yǎng)陽性菌株中檢測利福平結(jié)果符合率達(dá)98.30%。對12例兩種方法檢測結(jié)果不一致者使用陽性菌株分別采用GeneXpert 和MIC法檢測,結(jié)果顯示3種方法檢測利福平耐藥性7例結(jié)果(63.64%)一致;GeneXpert復(fù)測5例(41.67%)前后結(jié)果一致。

    本研究采用不同方法檢測結(jié)核分枝桿菌,GeneXpert陽性檢出率(25.16%)高于痰涂片法(19.63%),略低于液體培養(yǎng)法(25.93%)。相比液體培養(yǎng),GeneXpert除標(biāo)本前處理外檢測均在封閉的反應(yīng)盒內(nèi)自動完成,具有操作簡單、快速、交叉污染低、安全等特點(diǎn)。GeneXpert從檢測到報(bào)告僅需2.5 h,比液體培養(yǎng)(陽性時(shí)間11~22 d)[9]大大縮短了檢測時(shí)間。GeneXpert檢測結(jié)核分枝桿菌的效能顯示其檢測敏感度、陰性預(yù)測值為81.23%和93.50%,高于痰涂片法(64.92%和88.68%),其特異度和陽性預(yù)測值(94.47%和83.71%)略低于痰涂片法(96.23%和85.77%)。此結(jié)果與陳蕾和吳桂輝[8]研究得出的GeneXpert檢測特異度和敏感度結(jié)果略有不同,分析一種原因可能是由于不同的檢測方法使用前處理方法各不相同,因此雖然使用同一份痰樣本,但是由于痰樣本性狀黏稠,不能保證樣本能平均分配,特別是對于低陽性級別的痰樣本;還有一種原因可能是不同檢測方法檢出限的不同而影響其檢測效能。多項(xiàng)研究顯示,當(dāng)結(jié)核分枝桿菌含量達(dá)到5×103~5×104CFU/ml時(shí)痰涂片法才能得到陽性結(jié)果,液體培養(yǎng)法檢測限為10~100 CFU/ml,而GeneXpert技術(shù)最低檢出限為131 CFU/ml[8, 10-12]。本研究也顯示,GeneXpert與液體培養(yǎng)法兩種方法檢測結(jié)果符合率高,一致性較好。

    本研究采用LPA檢測707株結(jié)核分枝桿菌菌株,利福平耐藥有39株(5.52%)。采用GeneXpert檢測痰樣本結(jié)果顯示,利福平耐藥有41株(5.80%)。LPA和GeneXpert兩種方法從同一例患者初診痰樣本與初診痰培養(yǎng)陽性菌株中檢測利福平耐藥性結(jié)果符合率為98.30%,Kappa值為0.841,說明兩種方法檢測利福平耐藥一致性較好。對于12例 LPA檢測利福平與GeneXpert檢測痰樣本不一致的結(jié)果,本研究對其培養(yǎng)陽性菌株采用GeneXpert進(jìn)行復(fù)測,除1株為混合生長,其余11株進(jìn)行MIC法藥敏檢測。結(jié)果顯示,利福平檢測結(jié)果3種方法一致7株,4株不一致結(jié)果中,LPA檢測結(jié)果利福平均為敏感;GeneXpert檢測結(jié)果為利福平耐藥,均表現(xiàn)為probe E(529~533)探針突變;MIC法2例表現(xiàn)為利福平敏感,1例為低水平耐藥,1例為高水平耐藥。2例LPA和MIC檢測為利福平敏感而GeneXpert結(jié)果為耐藥,可能是在rpoB基因上發(fā)生了沉默突變而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。有研究報(bào)道,在rpoB基因上發(fā)生沉默基因突變,這類基因不表達(dá)或低表達(dá)[13],與利福平耐藥無關(guān)。2例LPA檢測利福平敏感而GeneXpert和MIC結(jié)果為耐藥,是否為LPA檢測利福平耐藥性敏感度不高,將在今后的工作中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。對于復(fù)測的12例GeneXpert出現(xiàn)7例前后結(jié)果不一致的結(jié)果,筆者認(rèn)為有可能是由于兩類樣本的優(yōu)勢菌群不同而產(chǎn)生利福平耐藥性檢測結(jié)果的差異。趙冰等[14]研究表明,標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌含量會影響GeneXpert檢測利福平耐藥的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示,5例GeneXpert檢測痰標(biāo)本中利福平敏感者菌株復(fù)測5例均為耐藥,這5例患者中3例患者痰涂片結(jié)果僅為1~2條。本研究未對全部入選的患者菌株進(jìn)行復(fù)測,現(xiàn)有的數(shù)據(jù)還不足以證明以上結(jié)論,我們將在今后的工作中進(jìn)行進(jìn)一步探討。

    綜上所述,GeneXpert和LPA兩種分子檢測方法檢測利福平耐藥性總體符合率較高,但也可能存在漏檢或過診情況。因此,有條件的實(shí)驗(yàn)室可考慮引入其他分子檢測方法以彌補(bǔ)上述方法的不足,為臨床精準(zhǔn)診斷和治療提供準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

    志謝感謝上海市疾病預(yù)防控制中心郭俊濤副主任醫(yī)師對本文統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和結(jié)果的指導(dǎo)和審核。

    猜你喜歡
    利福平涂片耐藥性
    痰涂片與痰培養(yǎng)在下呼吸道感染診斷中的比較
    直腸FH檢測剩余液涂片用于評估標(biāo)本取材質(zhì)量的探討
    長絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    嬰幼兒感染中的耐藥菌分布及耐藥性分析
    WHO:HIV耐藥性危機(jī)升級,普及耐藥性檢測意義重大
    低溫高速離心沉淀集菌涂片法查分枝桿菌與直接涂片法查分枝桿菌的比較研究
    2013~2015年陜西地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥性及rpoB基因突變的相關(guān)研究
    注射用利福平治療68例復(fù)治菌陽糖尿病合并肺結(jié)核療效觀察
    利福平致藥源性血小板減少癥一例
    氨苯砜、利福平、氯苯吩嗪聯(lián)合治療多菌型麻風(fēng)病的臨床分析
    一级a爱片免费观看的视频| 免费看日本二区| 九九在线视频观看精品| 亚洲性久久影院| 欧美日韩国产亚洲二区| 不卡一级毛片| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美日韩黄片免| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品亚洲美女久久久| 91在线观看av| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 观看免费一级毛片| 成人美女网站在线观看视频| 国产探花在线观看一区二区| 看黄色毛片网站| 成人高潮视频无遮挡免费网站| av在线观看视频网站免费| 精品久久久久久久久av| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美区成人在线视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日本a在线网址| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜福利高清视频| 亚洲无线在线观看| 国产视频内射| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 午夜激情欧美在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 中出人妻视频一区二区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 午夜福利在线在线| 国产伦人伦偷精品视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲色图av天堂| 午夜a级毛片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲久久久久久中文字幕| 看免费成人av毛片| 嫩草影视91久久| 国产精品三级大全| 熟女人妻精品中文字幕| 18+在线观看网站| 国产爱豆传媒在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 一本一本综合久久| 国产精品野战在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 久久人人爽人人爽人人片va| 美女 人体艺术 gogo| av专区在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美3d第一页| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲自拍偷在线| 嫩草影院新地址| 国产精品久久久久久久久免| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产v大片淫在线免费观看| 成人亚洲精品av一区二区| 免费看光身美女| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 最近在线观看免费完整版| 嫁个100分男人电影在线观看| 极品教师在线免费播放| 嫩草影院入口| 精品久久久久久久久av| 久久6这里有精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 麻豆国产av国片精品| 国产亚洲欧美98| 国产v大片淫在线免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 久久99热6这里只有精品| 能在线免费观看的黄片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| bbb黄色大片| 午夜激情福利司机影院| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲国产色片| 国产麻豆成人av免费视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲美女搞黄在线观看 | 99久久九九国产精品国产免费| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产亚洲精品av在线| 看免费成人av毛片| 亚洲无线观看免费| 亚洲,欧美,日韩| 日本黄色视频三级网站网址| 久久精品91蜜桃| 男人舔奶头视频| 久久热精品热| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 大型黄色视频在线免费观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品1区2区在线观看.| 少妇的逼水好多| 日韩一区二区视频免费看| 人人妻人人看人人澡| 国产探花极品一区二区| 欧美+日韩+精品| 99久久精品一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久久久久久久久久丰满 | 日日夜夜操网爽| 国产精品一区二区免费欧美| 成年女人毛片免费观看观看9| 很黄的视频免费| 成人鲁丝片一二三区免费| 韩国av在线不卡| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久久色成人| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲欧美清纯卡通| 男人的好看免费观看在线视频| 能在线免费观看的黄片| 麻豆国产av国片精品| 一本一本综合久久| 精品久久久久久久末码| 毛片一级片免费看久久久久 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久精品国产亚洲网站| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品伦人一区二区| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| x7x7x7水蜜桃| 夜夜夜夜夜久久久久| 能在线免费观看的黄片| 一级黄片播放器| 在现免费观看毛片| 麻豆国产av国片精品| 麻豆av噜噜一区二区三区| 高清在线国产一区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久久精品大字幕| 99热精品在线国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩一区二区视频免费看| 日日夜夜操网爽| 看免费成人av毛片| 午夜福利高清视频| 免费av不卡在线播放| 成人国产综合亚洲| 久久草成人影院| 国产av一区在线观看免费| 亚洲国产精品久久男人天堂| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲电影在线观看av| 亚洲成人久久性| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品在线观看二区| 午夜福利高清视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久香蕉精品热| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲专区中文字幕在线| 一级a爱片免费观看的视频| 国产真实伦视频高清在线观看 | 成人午夜高清在线视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲欧美清纯卡通| 最近在线观看免费完整版| 日韩 亚洲 欧美在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产成人aa在线观看| 国产真实乱freesex| 简卡轻食公司| 欧美中文日本在线观看视频| 99久国产av精品| 国产久久久一区二区三区| 成人综合一区亚洲| 看片在线看免费视频| 中文字幕av在线有码专区| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产激情偷乱视频一区二区| 麻豆一二三区av精品| 亚洲午夜理论影院| 国产在线男女| 在线观看舔阴道视频| 白带黄色成豆腐渣| 999久久久精品免费观看国产| 精品人妻视频免费看| 日韩欧美三级三区| 日韩欧美免费精品| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 国产毛片a区久久久久| 波多野结衣高清无吗| 国产精品一及| 一个人免费在线观看电影| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲国产色片| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久久久久中文| 在线a可以看的网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产色片| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 午夜福利在线在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产免费av片在线观看野外av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 久久99热6这里只有精品| 亚洲人成网站在线播| 欧美+日韩+精品| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲av一区综合| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久国产成人精品二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费电影在线观看免费观看| 国产精品女同一区二区软件 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品一区二区三区人妻视频| 最新中文字幕久久久久| 露出奶头的视频| 桃红色精品国产亚洲av| 又爽又黄无遮挡网站| 国产在线男女| 精品一区二区三区人妻视频| 99热网站在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲人与动物交配视频| 国产亚洲精品av在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 性色avwww在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 日本三级黄在线观看| 99久久精品一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 亚洲美女黄片视频| 床上黄色一级片| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美一区二区亚洲| 亚洲人成网站在线播| netflix在线观看网站| 国内精品美女久久久久久| 婷婷色综合大香蕉| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲黑人精品在线| 1024手机看黄色片| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美日韩黄片免| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲电影在线观看av| 欧美bdsm另类| 麻豆国产97在线/欧美| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品亚洲一级av第二区| 一区福利在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 国内精品宾馆在线| 精品日产1卡2卡| 国产精品人妻久久久久久| 国产老妇女一区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 床上黄色一级片| 亚洲黑人精品在线| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲午夜理论影院| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 精品久久久久久,| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品99久久久久久久久| 国产爱豆传媒在线观看| 97超视频在线观看视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产日本99.免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 女同久久另类99精品国产91| 在线观看一区二区三区| 欧美激情在线99| 老司机福利观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美又色又爽又黄视频| 国产一区二区在线av高清观看| 在线观看午夜福利视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 成人永久免费在线观看视频| 欧美又色又爽又黄视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 热99re8久久精品国产| 免费人成在线观看视频色| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 综合色av麻豆| 午夜精品久久久久久毛片777| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 午夜福利欧美成人| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产日本99.免费观看| 国产精品99久久久久久久久| 精品久久久久久,| 99九九线精品视频在线观看视频| 熟女人妻精品中文字幕| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美区成人在线视频| 国产主播在线观看一区二区| 成人午夜高清在线视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产免费男女视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产黄片美女视频| 少妇丰满av| 成人午夜高清在线视频| 国产精品伦人一区二区| 国产成人一区二区在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩欧美免费精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产探花在线观看一区二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 88av欧美| 成年人黄色毛片网站| 亚洲av成人精品一区久久| av天堂中文字幕网| 国内揄拍国产精品人妻在线| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产熟女欧美一区二区| 日日撸夜夜添| 久久午夜亚洲精品久久| 级片在线观看| 悠悠久久av| 床上黄色一级片| av女优亚洲男人天堂| 日本熟妇午夜| 久久国产乱子免费精品| 观看美女的网站| 国产视频内射| 亚洲午夜理论影院| 久久久午夜欧美精品| 色综合站精品国产| 在线免费十八禁| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品亚洲一级av第二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 夜夜爽天天搞| 国内精品久久久久精免费| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 超碰av人人做人人爽久久| 成人亚洲精品av一区二区| 久久精品人妻少妇| 日本免费a在线| 欧美3d第一页| 天天一区二区日本电影三级| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久6这里有精品| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 免费观看的影片在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 少妇高潮的动态图| 久久欧美精品欧美久久欧美| 噜噜噜噜噜久久久久久91| bbb黄色大片| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 久久精品国产清高在天天线| videossex国产| 国产色爽女视频免费观看| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产视频一区二区在线看| 热99在线观看视频| 欧美在线一区亚洲| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人av在线播放网站| 窝窝影院91人妻| 神马国产精品三级电影在线观看| 露出奶头的视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| av在线亚洲专区| 午夜福利欧美成人| 69av精品久久久久久| 精品日产1卡2卡| .国产精品久久| 亚洲18禁久久av| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 少妇的逼水好多| 深夜a级毛片| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美中文日本在线观看视频| 黄色一级大片看看| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成人aa在线观看| 麻豆成人av视频| 又大又黄又爽视频免费| 成人无遮挡网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 永久网站在线| 我要看日韩黄色一级片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久久久国产网址| 中国三级夫妇交换| 男人爽女人下面视频在线观看| 人人妻人人看人人澡| 婷婷色麻豆天堂久久| 天美传媒精品一区二区| 国产69精品久久久久777片| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩中字成人| 插阴视频在线观看视频| 精品视频人人做人人爽| 日日啪夜夜撸| 久久久久久久精品精品| 成年av动漫网址| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美国产精品一级二级三级 | 亚洲高清免费不卡视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久午夜欧美精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产深夜福利视频在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 欧美一区二区亚洲| 高清在线视频一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 综合色丁香网| 国产成人午夜福利电影在线观看| 成人国产av品久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av国产免费在线观看| 一本一本综合久久| 国产精品不卡视频一区二区| 美女国产视频在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日本wwww免费看| 最近的中文字幕免费完整| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产大屁股一区二区在线视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲成人手机| 成人一区二区视频在线观看| 少妇丰满av| 黄色视频在线播放观看不卡| 伦理电影大哥的女人| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产男人的电影天堂91| 国产 一区 欧美 日韩| 女性被躁到高潮视频| av.在线天堂| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人影院久久| 亚洲欧美成人精品一区二区| 伊人久久国产一区二区| 黄色欧美视频在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| tube8黄色片| 一区二区av电影网| 久久精品久久久久久久性| 三级国产精品欧美在线观看| 精品国产三级普通话版| 在线 av 中文字幕| 亚洲中文av在线| 搡老乐熟女国产| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 老司机影院毛片| 亚洲国产精品一区三区| 一个人免费看片子| 国产一区二区在线观看日韩| 成年人午夜在线观看视频| h日本视频在线播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲真实伦在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 免费看av在线观看网站| 欧美xxⅹ黑人| 嫩草影院新地址| 午夜免费观看性视频| 欧美日韩视频精品一区| 免费观看性生交大片5| 亚洲国产精品国产精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 最近最新中文字幕免费大全7| 99热这里只有精品一区| 日本黄大片高清| 亚洲,一卡二卡三卡| 18+在线观看网站| 黑人高潮一二区| 成人特级av手机在线观看| 国产乱人偷精品视频| 日本与韩国留学比较| 男人爽女人下面视频在线观看| 麻豆成人av视频| 国国产精品蜜臀av免费| 少妇精品久久久久久久| 最黄视频免费看| 三级国产精品片| 午夜福利网站1000一区二区三区| av卡一久久| 高清视频免费观看一区二区| 男女边吃奶边做爰视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲综合精品二区| 黄色日韩在线| 精品少妇久久久久久888优播| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品乱久久久久久| 伊人久久国产一区二区| 久久精品国产自在天天线| 麻豆乱淫一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲成色77777| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 高清视频免费观看一区二区| 日韩强制内射视频| h视频一区二区三区| 国产成人精品婷婷| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久久久久伊人网av| 亚洲图色成人| 又大又黄又爽视频免费| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲天堂av无毛| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产老妇伦熟女老妇高清| 九九在线视频观看精品| 亚洲国产最新在线播放| 大香蕉久久网| 午夜免费鲁丝| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 天美传媒精品一区二区| 午夜视频国产福利| 日韩强制内射视频| 少妇的逼水好多| 夫妻午夜视频| 久久这里有精品视频免费| 九色成人免费人妻av| 久久这里有精品视频免费| 亚洲欧洲日产国产| 久久婷婷青草| 色哟哟·www| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲第一av免费看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美极品一区二区三区四区| 少妇丰满av| 国产在线一区二区三区精| 一区二区av电影网| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久久久伊人网av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲国产av新网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 视频区图区小说| 又爽又黄a免费视频|