甘蔗NBS-LRR類抗梢腐病基因的篩選及定量表達分析

王澤平 宋修鵬 顏梅新 李毅杰 李翔 張小秋 唐紅琴 龍盛風

摘要 本文旨在探討核苷酸結合位點和富含亮氨酸重復（NBS-LRR）類基因參與甘蔗抗梢腐病菌侵染應答機制，為后續(xù)克隆關鍵抗病基因以及研究抗病機理提供理論依據。試驗利用Illumina高通量轉錄組測序技術檢測高抗梢腐病品種‘粵糖94-128和高感梢腐病品種‘桂糖37號接種前后NBS-LRR類抗梢腐病基因的表達情況，然后設計引物對顯著差異表達基因進行不同接種時期下的熒光定量PCR驗證。結果表明，16個NBS-LRR類基因在甘蔗葉片受到梢腐病菌侵染后持續(xù)上調表達，但表達趨勢存在兩種情況，13個基因在誘導后7 d顯著或極顯著上調表達，3個基因在誘導7 d后上調表達不顯著，在誘導14 d后才顯著上調表達。據此可將其分為瞬時基礎防御基因（0～7 d）和滯后特異性防御基因（14～21 d），確定NBS-LRR類基因參與甘蔗防御梢腐病菌的侵染。

關鍵詞 甘蔗; 梢腐病; 轉錄組; NBS-LRR

中圖分類號： S 556.1， S 435.661

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2020301

Screening and quantitative analysis of NBS-LRR gene against pokkah boeng disease in sugarcane

WANG Zeping1， SONG Xiupeng1， YAN Meixin1， LI Yijie1， LI Xiang1，ZHANG Xiaoqiu1， TANG Hongqin2*， LONG Shengfeng3*

（1. Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Sugarcane Research Center，

Chinese Academy of Agricultural Science， Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic

Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning 530007， China;

2. Institute of Agricultural Resources and Environment， Guangxi Academy of Agricultural Sciences，

Nanning 530007， China; 3. Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China）

Abstract

The molecular mechanism of nucleotide binding sites and leucine-rich replication （NBS-LRR） genes resistant to pokkah boeng disease （PBD） in sugarcane was explored to provide a theoretical basis for cloning resistant genes. This study firstly used Illumina high-throughput transcriptome sequencing technology to detect NBS-LRR genes against PBD with typical resistant and susceptive sugarcane materials， and then designed primers to verify the expression characteristics of significant differentially expressed NBS-LRR genes under different inoculation periods using real-time quantitative PCR （qRT-PCR）. The results showed that 16 NBS-LRR-like genes steadily increased expression when sugarcane leaves were infected with the PBD pathogen， including two trends in expression： 13 genes significantly or extremely significantly increased expression at 7 d post-inoculation， but three genes did not significantly increased expression at 7 d post-inoculation， but significantly increased expression at 14 d post-inoculation. Therefore， these genes could be divided into instantaneous basic defense genes （0 d to 7 d） and specific lagging defense genes （14 d to 21 d）， suggesting that NBS-LRR genes are actively involved in resistance against the PBD pathogen.

Key words

sugarcane; pokkah boeng disease; transcriptome; NBS-LRR

甘蔗梢腐?。╬okkah boeng disease）作為一種真菌性氣傳病害，其發(fā)生幾乎遍及所有的甘蔗生產國家和地區(qū)，在我國主產蔗區(qū)廣西已上升為僅次于黑穗病的主要病害[1]。生產上主要是通過噴施多菌靈進行防治，而挖掘抗病基因進而利用其進行雜交聚合育種是解決當前主栽甘蔗品種抗病性有限的重要途徑。隨著克隆技術的發(fā)展，目前對植物抗病基因的結構有了全面的認識，在許多植物中已克隆出抗病基因，且多種植物的核苷酸結合位點和富含亮氨酸重復（nucleotide binding sites and leucine-rich replication，NBS-LRR）類抗病基因的數目已確定[2]。在甘蔗抗病基因同源序列研究方面，Rossi等[3]采用與典型病原菌抗性基因同源比對的方法，從甘蔗EST數據庫中獲得88個抗病基因同源片段（resistance gene analogs， RGAs），并研究了它們在甘蔗基因組中的分布;McIntyre等[4]從54個RGAs中確定了3個與甘蔗抗銹病相關的RGAs;Wanderley-Nogueira等[5]通過基因芯片研究表明，甘蔗抗病基因在非誘導條件下能在根莖葉中表達;闕友雄等[6]從高抗甘蔗黑穗病品種‘NCo 376的基因組中克隆了一個NBS-LRR類基因的cDNA全長片段并推測其可能為抗病相關基因;賀爾奇等[7]根據已克隆的植物抗病基因保守結構域設計簡并引物，采用RT-PCR方法對抗病果蔗品種‘黔糖5號的RNA進行擴增，共獲得7條果蔗NBS-LRR類抗病同源基因，這些抗病基因同源序列與基因 RPM1 和RPS2的親緣關系較近[8]。本課題組在前期進行甘蔗防御梢腐病菌侵染生理生化機制相關研究過程中，發(fā)現不同遺傳背景的甘蔗品種抗性存在顯著差異[9-11]。而對于大部分NBS類抗病基因來說，其只具有?；剐裕S著病原菌的變異，植物抗病性很容易喪失。此外，利用Illumina RNA-Seq高通量測序技術可以對生物個體在特定時刻、特定組織的基因表達情況進行整體水平研究，在發(fā)掘甘蔗目標基因方面已得到充分應用[12-13]。因此，本試驗擬通過對高抗梢腐病品種‘粵糖94-128和高感梢腐病品種‘桂糖37號進行轉錄組測序，分析其接種梢腐病菌前后的差異基因表達譜，驗證NBS-LRR 類抗病基因表達規(guī)律，為最終克隆獲得甘蔗抗梢腐病基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗設計

試驗以多次篩選鑒定的高抗甘蔗梢腐病品種‘粵糖94-128（‘YT 94-128）和高感甘蔗梢腐病品種‘桂糖37號（‘GT 37）作為轉錄組測序材料，以農業(yè)農村部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室保存的輪枝鐮刀菌Fusarium verticillioides孢子懸浮液為接種液（孢子濃度為1×106個/mL）。在甘蔗5～6葉期采用針刺法[10]進行接種，并遮陰保濕，保持大棚溫度20～35℃，濕度80%～85%。于病情指數最嚴重階段即接種后第14天采集甘蔗+1葉（接種病原菌和清水的2個甘蔗品種，各含3次生物學重復，共計12個樣品，每個樣品各1.000 0 g）經液氮速凍，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 葉片總RNA提取、cDNA文庫構建及Illumina測序

利用TRIzol法提取樣品總RNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入fragmentation buffer使其打斷成為短片段，再以打斷后的mRNA為模板，用6堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經過QiaQuick PCR試劑盒純化并加入EB緩沖液洗脫后經末端修復、加堿基A，加測序接頭，再經瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，并進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作，構建好的文庫用Illumina HiSeqTM 2000進行測序。

1.3 引物設計

本研究從R 基因與轉錄組數據庫中[亞洲栽培稻Oryza sativa、短花藥野生稻O.brachyantha、秈稻O.sativa indica group、粳稻O.sativa japonica group、

美國蒺藜草Cenchrus americanus、狗牙根Cynodon dactylon、甘蔗品種‘N 11Saccharum hybrid cultivar ‘N 11、

甘蔗品種‘LCP 85-384 Saccharum hybrid cultivar ‘LCP 85-384、甘蔗品種‘NCo 376 Saccharum hybrid cultivar ‘NCo376、大麥Hordeum vulgare]比對上的Unigenes中選擇16個顯著差異表達的Unigenes進行熒光定量分析，研究其在梢腐病菌誘導后的表達趨勢。引物設計選用軟件Primer 5.0，引物序列見表1。本試驗內參基因25S rRNA正向引物5′-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3′，反向引物5′-CCTATTGGTGGGTGAACAATCC-3′[14]。

1.4 基因表達量分析

Unigene表達量的計算使用RPKM法（reads per kb per million reads），其計算公式為：RPKM=（1 000 000×C）/（N×L/1 000）。設RPKM為Unigene A的表達量，則C為比對到Unigene A的reads數，N為比對到所有Unigene的總reads數，L為Unigene A的堿基數。RPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因表達差異。

1.5 抗性相關基因的表達模式分析

采用qPCR分析抗病品種‘YT 94-128在梢腐病菌誘導下與抗性相關的基因表達情況。分別選取梢腐病菌誘導及清水處理后7、14 d和21 d葉片的cDNA為模板。熒光定量試劑盒選用SYBR Premix EX TaqTM（TaKaRa公司），儀器選用Applied Biosystems 7500 Fast。每個樣品重復3次。采用2—△△Ct法[15]計算目的基因在不同樣品中的表達量。計算公式：RQ=2—△△Ct;△△Ct=△Ct2-△Ct1;△Ct1=目的基因Ct1-內參基因Ct1;△Ct2=目的基因Ct2-內參基因Ct2;結果繪制成柱狀圖。其中，Ct表示擴增產物達到一定閾值時需要的循環(huán)數。

2 結果與分析

2.1 RNA 檢測

對‘YT 94-128和‘GT 37接種梢腐病菌后14 d的葉片進行RNA提取。樣本初始濃度都大于200 μg/μL，RNA integrity number（RIN值）大于7，總量都超過7 μg，樣本無DNA、雜質污染，無降解或者輕微降解，樣品質量滿足建庫測序要求，且總量滿足2次或者2次以上建庫需要。

2.2 候選抗病基因的表達情況

從‘YT 94-128和‘GT 37中的轉錄本中共獲得174個NBS-LRR基因，其中‘YT 94-128含162個，‘GT 37含171個，兩者間不同的有18個，相同的有156個，然后進一步篩選出顯著差異表達的16個NBS-LRR類Unigenes（RPKM值的倍數變化>1.0，見表1）。16個Unigenes在抗病品種‘YT 94-128中均為上調表達，其中Unigene0008680接種后較之接種清水差異表達倍數最大，但表達量并不高，而Unigene0064857接種病原菌后的差異表達倍數僅為1.19，但其表達量最高。這16個Unigenes在感病品種‘GT 37接種病原菌后或上調或下調表達，Unigene0074043在接種清水情況下不表達，但在接種病原菌后卻能夠注釋到其基因信息。代謝通路分析顯示大部分Unigenes存在于植物與病原體相互作用的通路中（ko04626），還有部分Unigenes存在苯丙烷類代謝途經中（ko00940）。總體來看，NBS-LRR類基因在受到病原菌誘導后會持續(xù)上調表達，表達方式可分為兩種情況：3個基因（Unigene0054622、Unigene0008546、Unigene0064857）在病原菌誘導7 d后上調表達不顯著，誘導14 d后才顯著上調表達;其他13個基因快速被誘導表達，即在梢腐病菌誘導后7 d顯著或極顯著上調表達。這表明NBS-LRR類基因積極參與甘蔗防御梢腐病菌的侵染反應，據此將其分為瞬時基礎防御基因（0～7 d）和滯后特異性防御基因（14～21 d）。

2.3 候選抗病基因表達的熒光定量PCR分析

對抗病品種‘YT 94-128中主要涉及活性氧代謝、基質蛋白輸入和受體再循環(huán)、腺苷酸載體以及過氧化物酶體組成部分的4個Unigenes進行熒光定量分析發(fā)現（圖1），各基因在接菌處理的樣品中表達量都顯著或極顯著高于清水處理的樣品，驗證了轉錄組測序的結果，并表現出隨著病原菌侵染程度加劇，其含量逐漸積累，但表達模式具有一定差異。其中，Unigene0030984、Unigene0007184屬于高或較高豐度表達基因，而Unigene0008680、Unigene0074043屬于低豐度表達基因。

3 結論與討論

利用轉錄組測序發(fā)掘甘蔗目標基因是一種常規(guī)方法，已有研究表明甘蔗轉錄組序列中存在大量未知信息的轉錄本[16-17]。通過抗病相關基因識別病原物入侵，從而誘導植物產生過敏反應（hypersensitive reaction， HR）或者隨后引起系統抗性，是植物抗病性重要組成部分[18]。本試驗基于甘蔗抗病種質資源創(chuàng)制需要，利用轉錄組測序從抗病品種‘YT 94-128和感病品種‘GT 37中獲得了甘蔗響應梢腐病菌侵染的差異基因表達譜，篩選出16個NBS-LRR類抗病Unigenes，極大豐富了甘蔗抗病基因信息，也說明了不同植物NBS-LRR抗病基因的總數及其各亞家族中基因數目都各不相同[19]。

基因功能注釋結果（轉錄組測序后的注釋信息）表明這16個Unigenes含有NBS、LRR、ARC等抗病保守結構域，且Unigene0012327、Unigene0040908、Unigene0065328以及Unigene0054622與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶WNK1同源，Unigene0008680、Unigene0006333以及Unigene0007184與抗病蛋白（pathogenesis related， PR） RGA2同源，Unigene0014727和Unigene0039476與過敏反應誘導蛋白同源，Unigene0030984與抗病蛋白RPS2同源。這與前人獲得的11條甘蔗抗黑穗病基因同源序列中的kinase-2（LLVL DDVW/D）最后一個氨基酸皆為色氨酸的結果形成驗證[14]，也表明梢腐病菌侵染甘蔗使其葉片發(fā)生系統性HR反應，從而引起局部細胞死亡。這部分的細胞死亡可以延緩或抑制病原菌的生長和擴散，也使得這部分細胞與周圍的健康細胞相區(qū)別。來源于感染處的信號分子誘導甘蔗的其余部分產生局部獲得抗性或系統獲得抗性，以防止病原菌的擴散和二次侵染?？赡苁歉收峥剐韵嚓P基因和梢腐病菌無毒基因識別后的信號傳遞激活了包括ROS的生成和各類防衛(wèi)反應。雖然，這16個Unigenes均具有NBS-LRR結構特征，但尚不能根據其序列特征來作為判定甘蔗抗梢腐病性狀的分子指標，只能視其與抗病基因連鎖，或者為抗病基因的一部分[20]。若這些基因與甘蔗梢腐病抗性有關，則該結構域可能在甘蔗對梢腐病的抗性中參與病原識別，或與ATP（GTP）結合，提供能量，最終激活激酶或G蛋白，參與蛋白質磷酸化，放大抗病反應信號，使甘蔗對病原產生HR反應[21]，這有待于進一步序列分析和功能驗證。

綜上所述，本文在獲得差異基因表達譜的基礎上，根據已知植物抗病基因保守區(qū)設計簡并引物，成功驗證了NBS-LRR表達規(guī)律，可為最終克隆獲得甘蔗抗梢腐病基因奠定基礎。

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（責任編輯：田 喆）