棘孢木霉SFC-3菌劑對(duì)小麥生理生化特性及小麥孢囊線蟲的影響

王繼雯 李磊 劉瑩瑩 甄靜 岳丹丹 李冠杰 慕琦 楊金星 陳國(guó)參

摘要 采用盆栽試驗(yàn)探討了不同劑量棘孢木霉SFC-3菌劑對(duì)小麥生理生化指標(biāo)及生防效果的影響。結(jié)果表明：施用SFC-3菌劑對(duì)小麥的株高和主根長(zhǎng)度沒(méi)有明顯影響（P>0.05），但可提高小麥的出芽率，當(dāng)施菌劑量為1.0～2.0 g/kg時(shí)小麥的出芽率顯著高于對(duì)照（P<0.05）;施用SFC-3菌劑小麥葉片中葉綠素含量和可溶性蛋白含量與對(duì)照相比均顯著增加（P<0.05），其中施菌劑量為1.0 g/kg時(shí)最高。而小麥葉片中的MDA含量在施菌劑量為1.0 g/kg時(shí)顯著低于對(duì)照和其他施菌處理（P<0.05）;當(dāng)施菌劑量為0.5～1.0 g/kg時(shí)，小麥葉片中SOD和POD活性顯著高于對(duì)照，進(jìn)一步增加施菌劑量，小麥葉片中SOD和POD活性均隨之顯著降低（P<0.05）。當(dāng)施菌劑量為1.5 g/kg和2.0 g/kg時(shí)每克根中小麥孢囊線蟲2齡幼蟲數(shù)量最少，發(fā)病級(jí)別最低，其相對(duì)防效分別為88.68%和87.04%，其次為施菌劑量1.0 g/kg的處理，其相對(duì)防效為80.50%。施用不同劑量的棘孢木霉SFC-3菌劑對(duì)小麥生理生化指標(biāo)均有不同程度的影響，并且當(dāng)施菌劑量為1.0 g/kg時(shí)對(duì)小麥生長(zhǎng)和孢囊線蟲的防治效果最好。

關(guān)鍵詞 棘孢木霉; 小麥; 生理生化特性; 孢囊線蟲; 生防效果

中圖分類號(hào)： S 512.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020324

Effects of Trichoderma asperellum? SFC-3 agent on wheat physiological and biochemical characteristics and wheat cyst nematode

WANG Jiwen1，2， LI Lei1，2， LIU Yingying1， ZHEN Jing1，2， YUE Dandan1，2，LI Guanjie1，2， MU Qi1*， YANG Jinxing1， CHEN? Guocan1，2*

（1. Institute of Biology Co.Ltd.， Henan Academy of Sciences， Zhengzhou 450008， China;

2. Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province， Zhengzhou 450008， China）

Abstract

Pot experiments were conducted to explore the effect of different dosages of Trichoderma asperellum SFC-3 on wheat physiological and biochemical indicators and biocontrol effects. The results show that the application of SFC-3 showed no effect on the plant height and main root length of wheat （P>0.05）， but increased the germination rate. The treatment with 1.0-2.0 g/kg of SFC-3 showed significantly higher germination rates than the control （P<0.05）. The content of chlorophyll and soluble protein in wheat leaves increased significantly in all treatments compared with that of the control （P<0.05）. When treated with 1.0 g/kg of SFC-3， the wheat showed the highest content of chlorophyll and soluble protein but the lowest MDA content in the leaves （P<005）. When treated with 0.5-1.0 g/kg of SFC-3， the SOD and POD activities in wheat leaves were higher than those of the control， but decreased significantly with the increase of the dose （P<0.05）. Compared with other treatments， the number of second-instar larvae of wheat cyst nematode per gram of roots and the disease index was the lowest at the dosage of 1.5 g/kg and 2.0 g/kg， with the relative control efficacy of 88.68% and 87.04%， respectively， followed by the treatment of 1.0 g/kg with the relative control efficacy of 80.50%. These results indicate that the application of different doses of T.asperellum SFC-3 has different effects on the physiological and biochemical indexes of wheat， and the control effect on wheat growth and cyst nematodes is best at the dosage of 10 g/kg.

Key words

Trichoderma asperellum; wheat; physiological and biochemical characteristics; cyst nematode; biocontrol efficacy

小麥作為我國(guó)主要的糧食作物之一，當(dāng)前主要通過(guò)各種生物學(xué)方法來(lái)改善其生理生化指標(biāo)從而提高產(chǎn)量[1]。但是長(zhǎng)期以來(lái)，植物病蟲害一直是制約小麥生產(chǎn)的嚴(yán)重問(wèn)題之一。我國(guó)為提高小麥等農(nóng)作物的單位面積產(chǎn)量，過(guò)度依賴化肥和農(nóng)藥，不僅造成了土壤肥力下降，而且對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的破壞，成為制約我國(guó)農(nóng)業(yè)環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。因此，研發(fā)高效的生防菌劑對(duì)于改良土壤結(jié)構(gòu)，提高小麥產(chǎn)量，防治病蟲害有重要意義。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外開始著力研究節(jié)能環(huán)保、無(wú)污染、可持續(xù)的新型生物肥料。新型生物肥料主要有生物菌劑和生物有機(jī)肥[2]。研究證實(shí)，廣泛存在于土壤中的木霉，不僅在防治植物病害中具有重要作用，而且也具有良好的促進(jìn)植物生長(zhǎng)的效果[3]。木霉對(duì)番茄[4]、豇豆[5]、小麥[6]、黃瓜[7]等植物上的病害均具有良好的防治效果。李世貴[8]在田間施用木霉菌劑，其對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果為51.79%，大幅提高了黃瓜的抗病能力。姚彥坡[9]證明哈茨木霉能有效降低馬鈴薯和辣椒的死苗率和病情指數(shù)，對(duì)馬鈴薯晚疫病和辣椒疫病防治效果明顯，并且能明顯降低土壤中病菌的種群數(shù)量。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)枝木霉Trichoderma longibrachiatum 對(duì)小麥孢囊線蟲Heterodera avenae的寄生作用很強(qiáng)，并且其分泌的幾丁質(zhì)酶能夠降解孢囊。除了木霉，其他真菌對(duì)小麥孢囊線蟲也有抑制作用。Kerry等[11]發(fā)現(xiàn)，厚垣輪枝菌Verticillium chalamydosporium能使病田中孢囊數(shù)量減少40%以上。Stein等[12]從土樣中分離出的腐霉菌Pythium和鐮刀菌Fusarium可以使大田中孢囊減退率達(dá)98%。

因此，真菌對(duì)于發(fā)展綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要作用[13-14]。目前，關(guān)于棘孢木霉Trichoderma asperellum 作為生物肥料對(duì)小麥生理生化指標(biāo)的影響以及對(duì)小麥孢囊線蟲的防效研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過(guò)探討棘孢木霉菌劑對(duì)小麥的生理生化指標(biāo)的影響及生防效果，確定棘孢木霉菌劑的最佳施用量，為提高小麥產(chǎn)量及小麥孢囊線蟲的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用小麥品種為‘鄭麥9405，購(gòu)于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子公司。試驗(yàn)土壤采于汝南縣綠優(yōu)家庭農(nóng)場(chǎng)小麥孢囊線蟲發(fā)生嚴(yán)重的地塊。棘孢木霉SFC-3菌劑由河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，該菌劑為粉狀，其有效活菌數(shù)≥5億/g，有機(jī)質(zhì)≥20%，水分≤30%，塑料花盆（直徑25 cm，高20 cm）購(gòu)于鄭州市陳寨花卉市場(chǎng)。

1.2 溶液的配制

10%三氯乙酸（TCA）溶液：10 g TCA溶于50 mL蒸餾水中，攪拌均勻定容至100 mL。20 mg/mL L-甲硫氨酸溶液：2 g L-甲硫氨酸加磷酸緩沖液（pH 70）溶解并定容至100 mL，搖勻。0.1 mg/mL核黃素溶液：100 mg核黃素溶于少量1 mol/L的NaOH，然后加蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，搖勻。1 mg/mL 氮藍(lán)四唑（NBT）溶液：100 mg NBT加磷酸緩沖液（pH 7.0）溶解并定容至100 mL，搖勻。

1.3 試驗(yàn)方法

小麥盆栽試驗(yàn)每盆裝4 kg土壤，試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。處理1：不施菌劑的空白對(duì)照;處理2：每盆施SFC-3菌劑2 g（相當(dāng)于0.5 g/kg）;處理3：每盆施SFC-3菌劑4 g （相當(dāng)于1.0 g/kg）;處理4：每盆施SFC-3菌劑6 g（相當(dāng)于1.5 g/kg）;處理5：每盆施SFC-3菌劑8 g（相當(dāng)于2.0 g/kg）。

施菌后按50粒/盆播種小麥，自然光照，室溫培養(yǎng)20 d，試驗(yàn)結(jié)束后，將小麥整株從盆中移出，洗凈晾干后4℃保存?zhèn)溆?同時(shí)從每盆中隨機(jī)均勻地取一部分土樣，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 小麥生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

分別統(tǒng)計(jì)各處理小麥的發(fā)芽數(shù)量，計(jì)算發(fā)芽率。發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/供檢測(cè)種子數(shù)）×100%;同時(shí)從每個(gè)處理樣品中隨機(jī)抽取10株小麥，分別測(cè)量和統(tǒng)計(jì)株高和主根長(zhǎng)度。

1.4.2 小麥葉片生理指標(biāo)測(cè)定

1.4.2.1 小麥葉片中葉綠素含量測(cè)定

分別取一定量的各處理新鮮小麥葉片，洗凈，晾干，剪碎，去中脈，混勻后稱0.1 g，充分研磨勻漿后加入5 mL 95%乙醇，繼續(xù)研磨直到組織發(fā)白[15-16]。過(guò)濾，用95%乙醇沖洗多次，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，分別在663 nm和645 nm處測(cè)定吸光度。分別計(jì)算葉綠素a，葉綠素b，葉綠素a+b的含量和葉綠素含量。Ca=12.7×OD663-2.69×OD645;Cb=22.9×OD645-4.86×OD663;C（a+b）=8.02×OD663+20.20×OD645;葉綠素含量=[C（a+b）×V]/（M×1 000）。上述公式中Ca、Cb、 C（a+b）分別代表葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b的含量，V代表提取液體積（mL）;M代表樣品鮮重（g）。

1.4.2.2 小麥葉片中POD和SOD活性及可溶性蛋白、MDA含量的測(cè)定

各處理小麥葉片中過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定分別采用愈創(chuàng)木酚法和氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法;小麥葉片中可溶性蛋白含量和丙二醛（MDA）含量分別用考馬斯亮藍(lán)法和硫代巴比妥酸法檢測(cè)[17-19]。

1.4.3 小麥根部孢囊線蟲侵染情況統(tǒng)計(jì)

從每個(gè)處理樣品中隨機(jī)選取10 株小麥完整的根系，洗凈、晾干后分別稱其鮮重，然后用次氯酸鈉-酸性品紅染色，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)根內(nèi)2齡幼蟲數(shù)量，并按下面的公式分別計(jì)算出每克鮮根重中2齡幼蟲數(shù)量、病情指數(shù)和防效。同時(shí)分別按表1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各處理進(jìn)行病情分級(jí)。

每克鮮根重2 齡幼蟲數(shù)量（NP）=2 齡幼蟲數(shù)/鮮根重;

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí)數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)值）×100;

防效=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘孢木霉菌劑對(duì)小麥株高和主根長(zhǎng)度及出芽率的影響

由表2可知，施用不同劑量的棘孢木霉菌劑對(duì)小麥的株高和主根長(zhǎng)度沒(méi)有明顯影響（P>0.05），但對(duì)出芽率有一定的促進(jìn)作用，施菌劑量為1.0 g/kg的處理出芽率最高，并且施菌劑量1.0～2.0 g/kg的各處理與不施菌的對(duì)照相比，小麥的出芽率顯著增加（P<0.05）。

2.2 棘孢木霉菌劑對(duì)小麥葉片中葉綠素含量的影響

由圖1可以看出，施用棘孢木霉菌劑的處理小麥葉片的葉綠素含量顯著高于對(duì)照（不施用棘孢木霉菌劑組）（P<0.05），當(dāng)施菌劑量在1.0 g/kg時(shí)，小麥葉片中葉綠素含量最高，極顯著高于對(duì)照（P<0.01）;然而隨著施菌劑量的增加，小麥葉片中葉綠素含量反而有所降低。

2.3 棘孢木霉菌劑對(duì)小麥葉片中丙二醛（MDA）含量的影響

由圖2可以看出，當(dāng)施菌劑量為1.0 g/kg時(shí)，小麥葉片中MDA含量顯著低于對(duì)照和其余處理（P<0.05），此時(shí)抑制作用最為顯著。當(dāng)施菌劑量為0～1.0 g/kg時(shí)，隨著施菌劑量增加小麥葉片中MDA含量也隨之減少，當(dāng)施菌劑量為1.0～2.0 g/kg時(shí)，隨著施菌劑量增加小麥葉片中MDA含量也隨之增高，其中施菌劑量為2.0 g/kg時(shí)小麥葉片中MDA含量與對(duì)照相比差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，與對(duì)照相比施菌劑量在0.5～1.5 g/kg時(shí)能極顯著降低小麥葉片中的MDA含量（P<0.01）。

2.4 棘孢木霉菌劑對(duì)小麥葉片中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖3可以看出，與對(duì)照相比，施用0.5 g/kg棘孢木霉菌劑對(duì)小麥葉片中SOD活性的促進(jìn)作用最顯著（P<0.05）。施用劑量為0.5 g/kg和1.0 g/kg時(shí)小麥葉片的SOD活性較高，且兩者差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)劑量大于1.0 g/kg時(shí)，隨著施菌劑量增加小麥葉片的SOD活性反而極顯著降低（P<0.01）。

圖3 棘孢木霉菌劑對(duì)葉片中超氧化物歧化酶活性的影響

Fig.3 Effect of Trichoderma asperellum agent on

SOD activity in wheat leaves

2.5 棘孢木霉菌劑對(duì)小麥葉片中過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響

由圖4可以看出，施用0.5 g/kg棘孢木霉菌劑時(shí)小麥葉片中POD活性最高，極顯著高于對(duì)照（P<0.01）;施用劑量為0.5 g/kg和1.0 g/kg的兩個(gè)處理小麥葉片POD活性差異不顯著（P>0.05），但進(jìn)一步增加劑量，小麥葉片中POD活性顯著減?。≒<0.05），施菌劑量為2.0 g/kg的處理葉片POD活性極顯著低于其余處理組（P<0.01）。

2.6 棘孢木霉菌劑對(duì)小麥葉片中可溶性蛋白含量的影響

由圖5可以看出，與對(duì)照相比，施用棘孢木霉菌劑后小麥葉片中可溶性蛋白含量均極顯著增加（P<0.01）。當(dāng)施菌劑量為1.0 g/kg時(shí)，小麥葉片中可溶性蛋白含量最高;1.5 g/kg和2.0 g/kg處理可溶性蛋白含量差異不顯著（P>0.05）。

2.7 棘孢木霉菌劑對(duì)小麥孢囊線蟲的防治效果

從表3可知，與不施菌對(duì)照相比，隨著施菌劑量增加，小麥每克根中2齡幼蟲數(shù)量隨之減少，其中，施菌劑量為1.5 g/kg時(shí)，每克根中2齡幼蟲數(shù)量最少，病情指數(shù)最低，其防效最高，達(dá)88.68%，當(dāng)施菌劑量大于等于1.0 g/kg時(shí)，其防效可達(dá)到80%以上，施菌劑量2.0 g/kg的防效為8704%，極顯著高于05 g/kg和1.0 g/kg（P<001），與1.5 g/kg差異不顯著（P>0.05）。

3 結(jié)論與討論

宋玉娟[20]研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉T-6的孢子懸浮液不僅能夠增加煙草體內(nèi)葉綠素和類胡蘿卜素的含量，提高煙草的根系活力，促進(jìn)煙草生長(zhǎng);還能夠誘導(dǎo)煙草體內(nèi)POD、SOD、CAT 3種防御酶的活性，有效地防治煙草根部病害黑脛病和根黑腐病，但是對(duì)煙草葉部病害赤星病的防治效果不明顯。對(duì)比本試驗(yàn)，當(dāng)土壤中施用1.0 g/kg棘孢木霉菌劑時(shí)，小麥葉片中的葉綠素含量最高;并且能極顯著提高小麥葉片中SOD和POD酶活。這兩種酶對(duì)于清除植物體內(nèi)活性氧，減少植物在逆境中所受的傷害具有重要作用[21]。張春龍等[22]進(jìn)行了淡紫擬青霉顆粒菌劑防治小麥禾谷孢囊線蟲的田間試驗(yàn)，結(jié)果表明，100 kg/hm2顆粒菌劑處理的防效最好，在小麥苗期和小麥生長(zhǎng)后期（抽穗至揚(yáng)花期）的防效分別為5725%和40.22%。對(duì)比本試驗(yàn)：隨著施菌劑量的增加，小麥每克根中2齡幼蟲數(shù)量也隨之減少，當(dāng)施菌劑量大于或等于1.0 g/kg時(shí)，其防效達(dá)到80%以上，尤其是當(dāng)施菌劑量為1.5 g/kg時(shí)，每克根中2齡幼蟲數(shù)量最少，病情指數(shù)最低，防效最高，達(dá)8868%，生防效果明顯優(yōu)于張春龍的試驗(yàn)結(jié)果，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)是盆栽試驗(yàn)而非大田試驗(yàn)，受外界環(huán)境影響較小，若要應(yīng)用于生產(chǎn)還需進(jìn)一步進(jìn)行大田試驗(yàn)。棘孢木霉SFC-3對(duì)小麥孢囊線蟲的防治主要依靠其生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的幾丁質(zhì)酶，這種酶可以有效降解孢囊，這與Zhang等[10]分離的長(zhǎng)枝木霉的作用機(jī)理相同。

在小麥生長(zhǎng)過(guò)程中葉綠素含量增高意味著植物的凈光合速率、實(shí)際光化學(xué)效率增高，這有利于作物干物質(zhì)的積累從而增加小麥的穗長(zhǎng)和穗粒數(shù)[23];MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，MDA的積累會(huì)損傷小麥膜系統(tǒng)，加速植物的衰老[24-25]，而SOD、POD等酶類則可以減少M(fèi)DA的積累維持小麥中活性氧的平衡[26];可溶性蛋白和可溶性糖能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，對(duì)小麥的生長(zhǎng)、發(fā)育有重要作用[27-28]。本研究結(jié)果表明，施加棘孢木霉菌劑可以有效提高小麥葉片中葉綠素、可溶性蛋白含量、SOD和POD的活性，并能顯著降低MDA含量，同時(shí)對(duì)小麥孢囊線蟲病有較好的防效。該研究結(jié)果證明了棘孢木霉菌劑在防病促生方面有較高潛力，為提高小麥產(chǎn)量、開發(fā)新型生物肥料提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）