東北地區(qū)玉米大斑病菌交配型組成及遺傳多樣性分析

馬周杰，何世道，龐欣宇，王禹博，張照然，唐爽爽，高增貴

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110161）

玉米大斑病作為世界玉米生產(chǎn)的一種葉部病害，在玉米生育期的多數(shù)階段均可造成為害，該病害在溫度15~25℃以及降水過多的地區(qū)普遍流行[1]。20世紀(jì)初，玉米大斑病已在世界所有玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)生并流行[2]。據(jù)報道，在法國、奧地利以及美國等地區(qū)，由玉米大斑病造成的田間產(chǎn)量損失達(dá)到30%，有些年份甚至近50%[3-4]。1899年，在我國東北地區(qū)首次報道了玉米大斑病的發(fā)生，20世紀(jì)30年代后期，該病害遍及我國玉米主產(chǎn)區(qū)，主要流行于東北、華北北部、西北和南方山區(qū)等冷涼玉米產(chǎn)區(qū)[5]。80年代初，隨著抗病品種的廣泛應(yīng)用和推廣，玉米大斑病曾一度得到有效控制，但后期由于生理小種的變異以及先玉335等感病品種的大面積種植，玉米生產(chǎn)再次遭受玉米大斑病的威脅，經(jīng)濟(jì)效益遭受嚴(yán)重影響，特別是在東北地區(qū)的春玉米種植區(qū)[6]。

玉米大斑病菌有性態(tài)為大斑剛毛座腔菌[Setosphaeria turcica(Luttr.)K.J.Leonard&Suggs]，屬子囊菌門剛毛座腔菌屬真菌，其有性生殖受MAT基因控制[7]。作為異宗配合真菌，玉米大斑病菌交配型分為僅含StMAT1-1基因的A交配型、僅含StMAT1-2基因的a交配型和2種基因都包含的Aa交配型[8]。玉米大斑病菌交配型存在明顯的分化現(xiàn)象，其A交配型和a交配型被指在熱帶地區(qū)分布均勻，而在溫帶地區(qū)表現(xiàn)出明顯的不平衡現(xiàn)象[3]，且同一國家的不同地區(qū)間交配型均存在顯著差異[9]。在國內(nèi)，孫淑琴[10]（2005）指出我國玉米大斑病菌主要存在3種交配型（A、a和Aa），Aa交配型的兩性菌株數(shù)量最大，而a交配型比例最小。王利智等[11]（2011）對云南省玉米大斑病菌進(jìn)行交配型檢測，發(fā)現(xiàn)A交配型比例明顯大于a交配型。楊貝貝[12]（2020）報道a交配型已在組成上占據(jù)絕對優(yōu)勢?？梢?，不同年份、不同地理區(qū)域間，玉米大斑病菌交配型組成及比例不同，自然條件下玉米大斑病菌遺傳變異加劇。

近幾年，SRAP分子標(biāo)記技術(shù)被越來越多的應(yīng)用于分析植物病原真菌遺傳多樣性[20-21]。但在國內(nèi)外尚未有關(guān)SRAP技術(shù)檢測玉米大斑病菌遺傳多樣性的報道。本試驗利用SRAP技術(shù)對東北地區(qū)玉米大斑病菌遺傳多樣性進(jìn)行分析，并確定所有分離菌株的交配類型，進(jìn)一步討論遺傳多樣性、交配類型以及地理來源之間的關(guān)系，明確東北地區(qū)玉米大斑病菌遺傳動態(tài)，為玉米大斑病的科學(xué)合理防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年9月在東北地區(qū)的黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古4個?。ㄗ灾螀^(qū)）34個市縣采集玉米大斑病病葉標(biāo)樣，用標(biāo)本紙壓制后帶回實驗室進(jìn)行病原菌分離。

供試水瓊脂培養(yǎng)基為瓊脂18g，蒸餾水1000mL；PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL；PD培養(yǎng)液為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。

供試2×Power Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker和植物基因組DNA提取試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；TAE和4S Green Plus Nucleic Acid Stain均購自上海生工生物工程股份有限公司；PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng)采用單孢分離法[22]從病葉標(biāo)樣上分離病原菌，首先通過敲打葉子將孢子轉(zhuǎn)移到水瓊脂培養(yǎng)基上，然后使用挑孢針在普通光學(xué)顯微鏡4倍物鏡下直接挑取單個孢子轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將平板置于25℃光暗交替（12h/12h）培養(yǎng)7d后，4℃保存，同時用PD培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)，富集菌絲進(jìn)行DNA提取。通過分離培養(yǎng)，共從病葉標(biāo)樣上獲得57株病菌，其地理來源信息見表1，菌株編號由采集省份（自治區(qū)）漢語拼音首字母縮寫加數(shù)字組成。

表1 供試菌株地理來源信息及編號Table 1 Information of geographic source and codes of tested isolates

1.2.2 DNA提取及檢測挑取PD培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)后的菌絲用無菌雙層紗布過濾，用無菌蒸餾水洗滌3次后轉(zhuǎn)移至離心管中，-20℃冰凍后，使用真空冷凍干燥機干燥24h，置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨，利用植物基因組DNA提取試劑盒提取各菌株DNA，測定OD260/OD280，確定其濃度與純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病原菌鑒定將純化后的單菌落接種至PDA培養(yǎng)基平板上，置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，觀察菌落特征，并置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察各菌株的微觀結(jié)構(gòu)。同時，以提取的DNA為模板，利用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對ITS區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×Power Taq PCR Master Mix，12.5μL；DNA模板，1μL；引物ITS1，1μL；引物ITS4，1μL；ddH2O補足至25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，54℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃最終延伸10min；4℃保存產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測拍照后，交于上海生工生物工程股份有限公司測序。將ITS測序結(jié)果與GeneBank中的Setosphearia turcica菌株序列（NCBI accession No.KJ380909.1）進(jìn)行比對。

1.2.4 交配類型分子鑒定以提取的DNA為模板，參照張泗舉[23]提出的玉米大斑病菌交配型測定引物進(jìn)行PCR鑒定。交配型基因StMAT1-1片段（A交配型）引物為MAT1-1-F（5’-ACAGGCTACTACATCACAATCC-3’）和MAT1-1-R（5’-ATAGTCGATCAATTCAGGCATG-3’），交配型基因StMAT1-2片段（a交配型）引物為MAT1-2-F（5’-CGTCCGATGAACTGCTGGATC-3’）和MAT1-2-R（5’-ACGCAGGTGTTCTTCTTTCGC-3’）。PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×Power Taq PCR Master Mix，12.5μL；DNA模板，1μL；上游引物，1μL；下游引物，1μL；ddH2O補足至25μL。A交配型PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火40s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；72℃最終延伸10min；4℃保存產(chǎn)物。a交配型PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，53℃退火45s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃最終延伸10min；4℃保存產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)擴(kuò)增條帶有無及大小確定交配型。

1.2.5 SRAP分析根據(jù)表2提供的10條正向隨機引物和10條反向隨機引物共產(chǎn)生了100對引物組合。隨機選擇5個菌株DNA用于引物篩選，選擇條帶清晰、豐富且穩(wěn)定的引物組合進(jìn)行SRAP分析。PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×Power Taq PCR Master Mix，12.5μL；DNA模板，1μL；上游引物，1μL；下游引物，1μL；ddH2O補足至25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，30~40℃退火1min（各引物組合最適溫度不同），72℃延伸1min，5個循環(huán)；94℃變性1min，50~56℃退火1min（各引物組合最適溫度不同），72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃最終延伸10min；4℃保存產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，對電泳圖譜條帶進(jìn)行統(tǒng)計，在相同遷移率下，同一位置出現(xiàn)條帶記為“1”，沒有觀察到條帶記為“0”，以所得數(shù)據(jù)構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYS pc 2.1軟件分析遺傳多樣性，聚類分析通過算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行。

由表2可知，不同配方制作的油茶湯色不同。加入花生及魚粉的油茶湯色為乳狀綠色，加入冰鮮烏龍茶的油茶湯色偏黃、稍暗，加入羅漢果和石崖茶油茶的茶湯色顏色較相同，對比原料嫩度相同無輔料添加的配方，湯色較淺。各配方制作的油茶湯色排名為配方2＞（配方3，配方4，配方5） ＞配方1＞配方 6＞配方 7＞配方 8＞配方 9＞CK。

表2 SRAP引物序列Table 2 Sequences of SRAP primers

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

利用普通光學(xué)顯微鏡觀察，所有供試菌株的菌落正圓形，呈黑褐色（圖1A）；菌絲為灰黑色，分生孢子梗單生或簇生，呈直立狀或彎曲狀，褐色，具2~6個橫隔膜，（30.2~180.6）×（2.7~5.2）μm（圖1B）；分生孢子頂側(cè)生，淡黃褐色，呈長梭形或紡錘形，中下部較寬，存在明顯臍點，具2~8個橫隔膜，（58.7~106.8）×（11.2~23.6）μm（圖1C）。同時，所有分離菌株均用ITS1/ITS4引物擴(kuò)增出約600bp的條帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列結(jié)果與GeneBank中的Setosphearia turcica菌株序列（NCBI accession No.KJ380909.1）進(jìn)行比對，同源性性均高達(dá)100%。因此，所有分離株均被鑒定為凸臍蠕孢菌，為玉米大斑病病原菌。

圖1 供試菌株形態(tài)學(xué)特征Figure 1 Morphology of tested isolates

2.2 玉米大斑病菌交配型組成分析

利用鑒定交配型的2對特異性引物對57株供試菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示（圖2），只擴(kuò)增出800bp左右目的條帶的菌株為A交配型菌株，只能擴(kuò)增出250bp左右目的條帶的菌株為a交配型菌株，同時可以擴(kuò)增出2個目的條帶的菌株為Aa交配型菌株，無條帶擴(kuò)增結(jié)果的菌株為中性菌株。

圖2 部分供試菌株交配型基因MAT1-1和MAT1-2電泳圖譜Figure 2 The electrophoresis results of mating type genes MAT1-1 and MAT1-2 of some tested isolates

在供試的57個菌株中，A交配型的（僅包含MAT1-1）共有12株，占菌株總數(shù)的21.05%，而a交配型的（僅包含MAT1-2）共有45株，占菌株總數(shù)的78.95%，并未檢測到Aa交配型菌株和中性菌株（表3）。從東北地區(qū)各?。ㄗ灾螀^(qū)）交配型的分布情況來看，a交配型菌株數(shù)量均明顯大于A交配型，表明a交配型為東北地區(qū)玉米大斑病菌優(yōu)勢交配型，玉米大斑病菌交配型種類在地理分布上存在隨機性。

表3 東北地區(qū)玉米大斑病菌交配型鑒定Table 3 Mating type determination of Setosphaeria turcica in Northeast China

2.3 玉米大斑病菌遺傳多樣性分析

2.3.1 SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果對100對引物組合進(jìn)行初篩，最終有8對引物能夠擴(kuò)增出清晰、多態(tài)性豐富、分布均勻且穩(wěn)定性較好的條帶。利用這8對SRAP引物進(jìn)行2輪退火溫度的篩選，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜各條帶的明亮整齊程度確定每一對引物的退火溫度組合（表4）。8對引物組合共擴(kuò)增出64條帶，其中引物組合Me5/Em9和Me8/Em1可擴(kuò)增出數(shù)量最多的10條帶，而Me3/Em3僅可擴(kuò)增出數(shù)量最少的5條帶，在64條帶中有44條帶為多態(tài)性條帶，不同引物組合可擴(kuò)增出3~7條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為60.00%~77.78%，平均每個引物組合擴(kuò)增出5.5個多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達(dá)到68.75%，表明玉米大斑病菌存在遺傳分化現(xiàn)象，菌株間表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

表4 SRAP引物組合篩選及擴(kuò)增結(jié)果Table 4 SRAP primer combination screening and amplification results

2.3.2 玉米大斑病菌聚類分析結(jié)果聚類分析系結(jié)果表明（圖3），從東北地區(qū)分離的57株玉米大斑病菌遺傳相似系數(shù)介于0.76~1.00。當(dāng)閾值為0.76時，供試菌株被分為2個類群（SRAP groups，SGs），其中SGI僅包含9個菌株，占菌株總數(shù)的15.79%；其余的48個菌株均被聚類到SGII，占菌株總數(shù)的84.21%；當(dāng)閾值為0.78時，SGII又可分為2個亞類群（SRAP subgroups，SSGs），其中SSGII包含3個菌株（HLJ01、JL01和JL02），其余的45個菌株均被聚類到SSGI；當(dāng)閾值為0.82時，供試的所有菌株又可被分為4個SGs。由此說明東北地區(qū)玉米大斑病菌存在遺傳分化現(xiàn)象。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，來自同一地區(qū)的供試菌株被劃分到不同的類群或亞類群中，例如，盡管NM06和NM05都是從內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市的標(biāo)樣中分離出來的，但它們分別分配到SGI和SGII中。同時，來自不同省市的部分供試菌株被劃分為同一類群，例如，SGI中菌株地理來源就包括黑龍江省的黑河市（HLJ03）和綏化市（HLJ04），吉林省的白城市（JL07）和吉林市（JL11），遼寧省的丹東市（LN02）、阜新市（LN15）和大連市（LN20和LN23）以及內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市（NM06）4省8市縣。綜上，玉米大斑病菌SRAP類群的劃分與菌株的地理來源沒有明顯的相關(guān)性。另外，由聚類分析樹狀圖中各菌株交配型分布可以看出，SGI中所有菌株均為A交配型，a交配型菌株均聚集于SGII，由此可見，玉米大斑病菌菌株遺傳類群和交配型在分子水平上存在密切關(guān)系。

圖3 東北地區(qū)玉米大斑病菌菌株SRAP聚類分析圖譜Figure 3 Cluster analysis of isolates of Setosphearia turcica in Northeast China based on SRAP

3 討論與結(jié)論

玉米大斑病在東北各玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，其是玉米生產(chǎn)上不可忽視的重要病害。我國玉米大斑病菌存在不同的交配類型（A交配型和a交配型），并具有有性生殖的潛力，這可能導(dǎo)致玉米大斑病菌的遺傳變異。對異宗配合的真菌來說，有性生殖受交配基因MAT的控制，交配類型A和a分別由MAT1-1和MAT1-2基因編碼[7]。BUNKOED等[24]報道泰國玉米大斑病菌A交配型與a交配型比例接近1∶1，在國內(nèi)，孫淑琴等[10]報道我國玉米大斑病菌中Aa交配型的兩性菌株數(shù)量最大，王利智等[11]發(fā)現(xiàn)云南省玉米大斑病菌A交配型比例明顯大于a交配型。同時，NELSON[25]報道了玉米大斑病菌存在雙性菌株和中性菌株，玉米大斑病菌的交配類型不是簡單的雙極性。而在本研究中，只檢測出了a和A兩種交配類型，且a交配型比A交配型更為普遍，說明不同地區(qū)玉米大斑病菌交配型組成情況存在較大差異，遺傳背景趨于多態(tài)化和復(fù)雜化。

分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于研究真菌中的遺傳多樣性，本研究通過計算SRAP程序中引物的2輪退火溫度，擴(kuò)增清晰，穩(wěn)定和重復(fù)性較好的DNA條帶，并從不同的分離菌株中獲得具有較高多態(tài)性的DNA片段。這些結(jié)果表明SRAP技術(shù)是研究玉米大斑病菌遺傳變異和親緣關(guān)系的有效方法。同時，本研究首次利用SRAP技術(shù)分析東北地區(qū)玉米大斑病菌遺傳多樣性。結(jié)果表明，57個供試菌株之間存在遺傳差異，8個引物組合共擴(kuò)增出64條條帶，其中多態(tài)性條帶為44個，平均每個引物組合擴(kuò)增出5.5個多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為68.75%，略低于之前的報道[26]。同時，本研究SRAP標(biāo)記用簡單的瓊脂糖凝膠分析代替了更敏感的聚丙烯酰胺凝膠銀染或熒光標(biāo)記來檢測菌株擴(kuò)增DNA片段的條帶；這也可能是多態(tài)性比率較低的原因。FERGUSON等[9，14]分別通過RAPD和AFLP等方法證實玉米大斑病菌存在豐富的遺傳多態(tài)性。在歐洲，玉米大斑病菌遺傳結(jié)構(gòu)被報道與地理分布存在密切關(guān)系[27]，本研究卻發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性與地理起源沒有顯著的相關(guān)性，這與MA等[28]和谷守芹等[17]關(guān)于不同地區(qū)玉米大斑病菌研究結(jié)論一致。本研究另發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌遺傳多樣性與交配型之間存在密切關(guān)系,其可能是因為交配型受MAT基因調(diào)控，其在分子水平與遺傳信息存在某種必然聯(lián)系。本研究只使用有限數(shù)量的引物，而且某些地區(qū)的菌株數(shù)量還不夠，有必要擴(kuò)大引物組合和菌株數(shù)量，以期通過SRAP分析更好地了解玉米大斑病菌遺傳多樣性與交配型之間的關(guān)系。此外，應(yīng)進(jìn)一步分析菌株的致病性和生理小種類型，以幫助更好地解釋所獲得SRAP分子標(biāo)記的遺傳信息。

在生產(chǎn)上，由于東北地區(qū)大量感大斑病玉米品種的種植以及適宜的氣候條件，玉米大斑病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，因此應(yīng)加強對東北地區(qū)玉米大斑病菌遺傳結(jié)構(gòu)及其與交配型間密切關(guān)系的研究，明確其優(yōu)勢種群及遺傳動態(tài)，為玉米大斑病的科學(xué)合理防治提供理論依據(jù)。