用于1型糖尿病細(xì)胞治療的胰島低溫保存進(jìn)展

韓恒鑫 占太杰 崔夢冬 楊加敏 陳 亮 胥 義

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一種自身免疫疾病，免疫系統(tǒng)會攻擊胰腺中產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞，β細(xì)胞大量死亡導(dǎo)致胰島素分泌不足，從而造成患者血糖調(diào)控能力喪失[1]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)，2019年超過110萬兒童和青少年患有1型糖尿病[2]。目前，T1DM治療的主要方法是監(jiān)測血糖水平，在水平過高時進(jìn)行胰島素注射。頻繁的胰島素注射費時費力，且可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如血管疾病[3]和無意識性低血糖[4]等。

對于T1DM，胰島移植是十分具有潛力的治療方法，該方法可以恢復(fù)患者的血糖調(diào)控能力，避免定期的胰島素注射，很大程度上提高患者的生活質(zhì)量。但由于供體短缺以及供體與受體之間時間的不匹配，限制了胰島移植的廣泛應(yīng)用。目前已經(jīng)探索了胰島供體的其他來源[5]，例如豬胰島[6-8]和干細(xì)胞衍生的胰島類器官[9-11]。有望解決胰島移植供體短缺的問題，也對高質(zhì)量的胰島低溫保存提出了更為迫切的需求。

低溫保存是高質(zhì)量保存生物樣本的重要方法，液氮下的低溫可以使細(xì)胞代謝完全停滯，是長期保存胰島的理想條件[12-15]?，F(xiàn)用胰島低溫保存方案存在許多問題，例如回收率較低且功能較差，添加的有毒CPA需要復(fù)雜的洗脫步驟，此外還缺乏高質(zhì)量的、自動化的和高通量的胰島低溫保存技術(shù)。近年來，由于材料科學(xué)、低溫生物學(xué)和跨學(xué)科研究的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新的低溫保存方法，如開發(fā)出了天然來源的新型保護(hù)劑[16-18]、非滲透性保護(hù)劑胞內(nèi)遞送方法[19-22]和快速復(fù)溫方式[22-28]等。這些新技術(shù)方法提升了胰島的低溫保存質(zhì)量，在一定程度上降低了低溫保存過程中引起的胰島損傷。本文綜述了近年來胰島低溫保存領(lǐng)域出現(xiàn)的新材料新方法，這些新的低溫保存方法有助于建立隨用隨取的高質(zhì)量胰島庫，為后續(xù)T1DM的細(xì)胞治療提供可靠的胰島來源。

1 低溫保存機理

目前胰島的低溫保存方法主要有兩類：一類是慢速冷凍保存，另一類是玻璃化保存。

1)慢速冷凍保存，是通過添加低濃度(本文涉及的“濃度”如無特殊說明均為摩爾濃度)的冷凍保護(hù)劑(cryoprotective agents，CPA)結(jié)合兩步法降溫使胰島處于胞外結(jié)冰胞內(nèi)玻璃化的狀態(tài)。圖1(a)所示為在慢速降溫過程中降溫速率對于胰島低溫保存的影響，在該慢速降溫過程中，需要摸索適合胰島的最佳降溫速率[29-30]。若降溫速率過快，會在胰島細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生冰晶，這些胞內(nèi)冰在復(fù)溫過程中會產(chǎn)生再結(jié)晶而使細(xì)胞受損；若降溫速率過慢，則胰島細(xì)胞收縮過度，加重溶質(zhì)損傷。最佳降溫速率下，胰島的整體損傷最小。

2)玻璃化保存，是通過添加高濃度CPA結(jié)合小樣本快速的降溫速率，使體系達(dá)到整體的玻璃化狀態(tài)。玻璃化是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)(玻璃態(tài))的固化過程。實現(xiàn)玻璃化有兩種途徑，一是極大的提高冷卻速率，二是增加溶液濃度。玻璃化狀態(tài)是胰島保存的理想狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)外完全避免了結(jié)晶，但要達(dá)到完全的玻璃化，需要很高的CPA濃度，也會對胰島細(xì)胞產(chǎn)生毒性損傷，此外復(fù)溫過程中的反玻璃化現(xiàn)象也會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，如圖1(b)所示。

圖1 低溫保存原理Fig.1 Principle of cryopreservation

2 胰島低溫保存中損傷因素的抑制

胰島結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，單個胰島約含1 000～10 000個細(xì)胞[31-32]，平均直徑為150 μm，由多種細(xì)胞構(gòu)成。這種復(fù)雜結(jié)構(gòu)增加了胰島高質(zhì)量低溫保存的難度，首先熱傳遞限制導(dǎo)致了降溫和復(fù)溫過程中冰晶更加難以控制[29,33]。其次CPA滲透更加困難，較長的平衡時間加重了其對胰島的毒性損傷[31]。此外在胰島分離和體外培養(yǎng)過程中，其血管系統(tǒng)被破壞[34-35]，氧氣的輸送效率大大降低，復(fù)溫時氧氣供應(yīng)不足將導(dǎo)致胰島內(nèi)部細(xì)胞死亡。

造成胰島低溫保存過程中損傷的因素主要有冰晶損傷、保護(hù)劑損傷及缺氧損傷。近些年來出現(xiàn)了新的低溫保存方法，如天然無毒的新型保護(hù)劑、非滲透性保護(hù)劑的胞內(nèi)遞送和快速復(fù)溫方式等，從不同方面抑制了低溫保存過程中胰島的損傷，提高了胰島低溫保存效果。

2.1 冰晶損傷的抑制

胰島低溫保存過程中，冰晶的生成會產(chǎn)生機械應(yīng)力[29]，對細(xì)胞膜[30]和胰島結(jié)構(gòu)造成破壞。由于過冷度、冷卻速率、溶質(zhì)性質(zhì)和保護(hù)劑濃度的不同，冰晶的生長速率和形態(tài)也不同，冰晶可能呈現(xiàn)針狀、羽狀、不規(guī)則枝狀以及多種過渡形式的結(jié)構(gòu)，不同結(jié)構(gòu)的冰晶對胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷也不同。S.Matsumoto等[17]將不同濃度的合成抗凍蛋白類似物(sy AFGP)添加到保護(hù)劑中，研究其對低溫保存中胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。低溫顯微結(jié)果顯示，當(dāng)sy AFGP質(zhì)量濃度為500 μg/mL時，冰晶形態(tài)從鋒利的刀片狀變?yōu)橐幌盗杏馉罘种ЫY(jié)構(gòu)，羽狀結(jié)構(gòu)中晶體間未凍結(jié)區(qū)域更大，胰島處于冰晶間隙中，形態(tài)結(jié)構(gòu)保存較為完整；當(dāng)sy AFGP質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加，達(dá)到1 000 μg/mL以上時，會促使冰晶大量生長且晶體形態(tài)從樹枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)獒樇鉅?，對胰島結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重?fù)p傷。所以在胰島低溫保存過程中，控制冰晶生長是十分必要的，可以通過優(yōu)化降溫程序、微囊化包封及玻璃化保存等方法來減輕低溫保存過程中冰晶對于胰島的損傷。

2.1.1 降溫程序的優(yōu)化

冰核的產(chǎn)生和冰晶的生長過程與降溫速率有關(guān)，較慢的降溫速率形成少而大的冰晶；較快的降溫速率形成多而小的冰晶。圖2所示為慢速低溫保存中出現(xiàn)的過冷度示意圖，在實際降溫操作中，樣品體系可能會出現(xiàn)較大的過冷度，在釋放潛熱后出現(xiàn)很高的冷卻速率(圖2 e-f段)，導(dǎo)致胞內(nèi)冰的生成，對胰島造成損傷。

圖2 高過冷度導(dǎo)致胞內(nèi)冰的生成Fig.2 High degree of under cooling leads to the formation of intracellular ice

研究表明[36-37]，胰島最適降溫速率約為0.25～1.00 ℃/min。為了減輕體系在較大過冷度下釋放潛熱后出現(xiàn)的快速降溫階段的影響，通常采用“置核”來控制晶核的生成。目前主要的置核方法有兩種，一是通過冷媒在體系局部形成較大的過冷度來實現(xiàn)[38]，二是通過調(diào)節(jié)降溫程序來實現(xiàn)[39]。

2.1.2 微囊化胰島

微囊化胰島是將胰島包封在具有選擇透過性的微囊中，最早由F.Lim等[40]提出。微囊在胰島外部形成一層保護(hù)屏障，既可以最小化免疫反應(yīng)，又可以顯著減輕冰晶形成對胰島造成的機械損傷。

液滴生成器是最常用的液滴生成方式。常規(guī)液滴生成器(圖3(a))生成的液滴范圍通常為100～1 000 μm，液滴中通常包含不同數(shù)量的胰島且微囊的大小不一難以控制。同軸氣流液滴發(fā)生器(圖3(b))可以獲得尺寸較均勻的微囊，S.Schneide等[41]利用同軸氣流液滴發(fā)生器獲得的微囊直徑約為700～800 μm。靜電液滴發(fā)生器(圖3(c))在噴嘴和膠凝溶液之間施加靜電勢有助于制造更小的微囊[42-44]。近年來，微流體設(shè)備也已用于胰島封裝[22,43-45]。使用微流體包囊胰島可更好的控制膠囊大小，且可以利用多種包封材料形成核殼結(jié)構(gòu)的多層微囊，同時避免了胰島可能出現(xiàn)在微囊外部的問題(圖3(d))。J.D.Weaver等[43]，使用微流控技術(shù)將小鼠胰島封裝在300 μm PEG膠囊中，對照組使用靜電液滴發(fā)生器產(chǎn)生的最小膠囊為500 μm。此外，A.A.Tomei等[46]開發(fā)了基于流動聚焦的保型封裝方法(圖3(e))，可以貼合胰島形狀形成更薄、更穩(wěn)定且厚度均勻的微囊，大幅減小了微囊的體積，改善了氧氣及養(yǎng)分的獲取[47-48]。構(gòu)成微囊的材料通常有藻酸鹽水凝膠、殼聚糖、葡聚糖、超分子或其它合成聚合物[49-50]。這些材料的3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以限制冰晶生長[51]，并在復(fù)溫中抑制冰重結(jié)晶，最大限度地減少冰晶對細(xì)胞的物理損害[52]。A.A.Haridkar等[53]使用殼聚糖-海藻酸鹽水凝膠包封小鼠胰島，封裝組存活率為95.4%，而未包封組為69.4%。侯軍等[54-55]也得到類似的結(jié)論，侯軍等[54]的研究中，CPA為含有2 mol/L二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)的RPMI 1640溶液，降溫過程首先將樣本快速降溫至-7.4 ℃，然后以0.25 ℃/min降至-40 ℃，隨后投入液氮中保存。1個月后將樣本利用37 ℃水浴復(fù)溫，使用0.75 mol/L的蔗糖溶液洗脫DMSO，雙硫腙染色結(jié)果顯示，微囊化組的胰島回收率可以達(dá)到94.7%±1.4%，顯著高于裸露組(68.6%±2.9%)。K.D.Inaba等[55]優(yōu)化了降溫程序，將樣本以-0.2 ℃/min的降溫速率從4 ℃冷卻至-45 ℃，并在-7.5 ℃處置核，然后將樣品置于液氮中保存。保護(hù)劑均為含有2 mol/L DMSO的RPMI 1640溶液。結(jié)果顯示微囊化組胰島(97.2%±1.3%)的回收率顯著高于裸露組(79.5%±9.8%)，通過降溫程序的優(yōu)化，微囊化胰島的回收率得到進(jìn)一步的改善。此外，S.Schneide等[41]優(yōu)化了微囊化胰島低溫保存所需的DMSO濃度及降復(fù)溫程序，結(jié)果顯示在DMSO終濃度為2.0 mol/L時，在0 ℃下平衡15 min，37 ℃水浴并通過梯度蔗糖溶液逐步洗脫去除DMSO，結(jié)果最優(yōu)，這些條件與之前針對非微囊化大鼠胰島優(yōu)化的最優(yōu)低溫保存條件相當(dāng)[56]。

圖3 微囊化包封方法Fig.3 Microencapsulation encapsulation method

圖4所示為微囊化降低冰晶對胰島損傷的示意圖，微囊化可以顯著減輕胰島在低溫保存過程中受到的冰晶損傷，保護(hù)胰島形態(tài)，提高胰島低溫保存后的回收率，改善胰島細(xì)胞低溫保存后的功能，并在后續(xù)移植過程中避免免疫反應(yīng)。但微囊也增加了氧氣及養(yǎng)分的運輸距離[57-59]，限制了移植后的再血管化，加劇了胰島內(nèi)部細(xì)胞的缺氧死亡[60-61]，不利于胰島在體內(nèi)長期發(fā)揮功能。此外，微囊包封也顯著增加了胰島的體積，限制了移植的部位。保型封裝在一定程度上改善了氧氣及養(yǎng)分的輸送且減小了移植物的體積，但仍對再血管化存在限制，且其在冷凍過程中對于胰島的保護(hù)作用還需要進(jìn)一步研究。

圖4 微囊對冰晶損傷的抑制原理Fig.4 Inhibition principle of ice crystal damage by microcapsules

2.1.3 玻璃化保存胰島

玻璃化保存是克服低溫保存過程中冰晶損傷的有效方法，近年來，一些新的玻璃化裝置應(yīng)用于胰島低溫保存領(lǐng)域，顯著提高了降溫速率，降低了對于高濃度CPA的依賴，改善了玻璃化保存胰島的功能性。

冷表面玻璃化是將包含樣本的小液滴直接滴在冷表面實現(xiàn)玻璃化。H.Sasamoto等[36]將100個胰島懸浮于40 μL的保護(hù)劑溶液中，然后立即滴至液氮預(yù)冷的鋁皿上實現(xiàn)玻璃化。復(fù)溫后胰島達(dá)到92.4%的高存活率。

麥管加熱后拉伸得到拉伸麥管(open pulled straw，OPS)，外徑約為0.27～0.40 mm，管壁約為0.05 mm。拉伸麥管降溫速率可達(dá)11 400～18 400 ℃/min，復(fù)溫速率為12 200～32 300 ℃/min[62]。與普通麥管相比，使用拉伸麥管的降溫速率和復(fù)溫速率都快了約4倍，但拉伸麥管的容積也大幅減小，有效容積從普通麥管的約150 μL降至約10 μL，只能保存少量的胰島。

冷凍載桿(cryotop)由附著在耐液氮的塑料手柄上的細(xì)透明薄膜條及外套管組成，可以提供23 000 ℃/min的降溫速率和42 000 ℃/min的升溫速率，可以減輕對于高濃度CPA的依賴，提高玻璃化保存效果。但在降溫過程中樣本需要直接與液氮接觸，可能造成污染[63]。目前利用cryotop設(shè)備已經(jīng)成功保存了卵母細(xì)胞[64-66]以及胚胎[67-68]等生物樣本。近年來，cryotop也被用于胰島玻璃化保存[18,37]。

中空纖維(hollow fiber，HF)是一種由三乙酸纖維素材料制成的中空管，管壁約為15 μm；近些年來有研究者將中空纖維玻璃化應(yīng)用于胰島保存領(lǐng)域。M.Nagaya等[69]對比了冷表面、OPS和HF玻璃化對于胰島功能的影響，結(jié)果顯示HF組胰島功能最優(yōu)。

目前的玻璃化設(shè)備為了達(dá)到足夠快的降溫速率，一般容積都很小，單次保存的胰島量對于臨床應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，所以需要開發(fā)高通量的胰島玻璃化方法，冷表面玻璃化顯示出了高通量保存胰島的潛力，后續(xù)可以通過高精度的3D打印噴射成液滴矩陣來進(jìn)一步降低液滴大小，提高保存效果，實現(xiàn)高通量的玻璃化保存。

2.2 保護(hù)劑損傷的抑制

冷凍保護(hù)劑損傷包括細(xì)胞膜損傷[70]，增殖和分化能力減弱[71-74]，線粒體功能降低[75-77]，DNA、蛋白質(zhì)或其他大分子受損等[78-82]。這些損傷可能是CPA本身的毒性以及CPA引起的滲透壓沖擊所造成的。通過復(fù)配使用多種CPA，無毒低毒保護(hù)劑結(jié)合胞內(nèi)遞送等方法可以減輕這些損傷。

2.2.1 保護(hù)劑的復(fù)配使用

不同CPA具有不同的膜滲透能力[83]、玻璃化能力以及細(xì)胞毒性。通過不同CPA的復(fù)配使用可以降低CPA的整體濃度，在抑制冰晶的同時降低CPA對于細(xì)胞的毒性損傷以及滲透沖擊。G.Kojayan等[38]的研究結(jié)果顯示與目前的標(biāo)準(zhǔn)2 mol/L DMSO相比，復(fù)配使用CPA(1 mol/L DMSO + 0.5 mol/L EG)可獲得更高的存活率和細(xì)胞活力。此外，大鼠體內(nèi)實驗顯示，復(fù)配組可以更快的使血糖恢復(fù)正常。

了解CPA損傷機理和CPA功能特性是尋找更優(yōu)CPA配方的基礎(chǔ)。不同細(xì)胞對于CPA的滲透性差異很大，為了開發(fā)出更適合胰島的CPA配方，各種CPA對于胰島的損傷機理以及胰島與不同CPA的相互作用還需要進(jìn)一步研究。

2.2.2 非滲透冷凍保護(hù)劑胞內(nèi)遞送

目前用于胞內(nèi)遞送的非滲透CPA主要是天然糖類如海藻糖、蔗糖和棉子糖[84]。應(yīng)用最多的是海藻糖，海藻糖首先在極端耐寒和干燥的生物中發(fā)現(xiàn)[85-86]，它可以與生物大分子形成氫鍵促進(jìn)生物大分子的水合作用，充當(dāng)水以使細(xì)胞成分構(gòu)象保持穩(wěn)定；還可通過大幅降低分子流動性促進(jìn)玻璃態(tài)的形成來暫停代謝活動[87-88]。

通常海藻糖無法透過哺乳動物的細(xì)胞膜，且僅胞外的海藻糖不能起到良好的保存效果[89]。研究者探索了將海藻糖遞送至胞內(nèi)的方法，例如誘導(dǎo)磷脂相變[20]、電穿孔、超聲、顯微注射和納米粒子遞送[21,90]等。G.M.Beattie等[91]利用胰島細(xì)胞膜的脂質(zhì)相變將海藻糖遞送至胞內(nèi)，結(jié)果表明冷凍保存后的胰島在復(fù)溫后顯示出良好的活力和功能，移植到糖尿病大鼠模型中的效果與移植新鮮胰島無顯著差異。V.Mutsenko等[84]利用電穿孔將海藻糖、蔗糖和棉子糖分別遞送進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，對比了3種糖在細(xì)胞冷凍保存中的效果，結(jié)果表明蔗糖和棉子糖與海藻糖一樣有效。

Cheng Yue等[22]利用冷響應(yīng)納米膠囊(CR-NCs)遞送海藻糖，CR-NCs具有冷響應(yīng)特性，在溫度低于10 ℃時，CR-NCs會裂解釋放海藻糖，可使胞內(nèi)海藻糖濃度達(dá)到0.4 mol/L。該項研究還將胰島包封在海藻酸鹽水凝膠中，并通過磁熱復(fù)溫提高了復(fù)溫速率，進(jìn)一步降低對胰島的損傷。結(jié)果顯示，僅0.4 mol/L的游離海藻糖，冷凍保存后的細(xì)胞活力僅為30%，通過CR-NCs將海藻糖運送至細(xì)胞內(nèi)后，細(xì)胞活力達(dá)到60%以上。再加上海藻酸鹽封裝后，冷凍保存后細(xì)胞活力增至75%，最后引入磁熱復(fù)溫后，細(xì)胞活力進(jìn)一步提高至85%。海藻糖胞內(nèi)遞送，微囊封裝以及磁熱復(fù)溫的綜合使用，減少了對有毒CPA的需求，僅使用0.4 mol/L的海藻糖即可達(dá)到80%以上的細(xì)胞活力。該項工作體現(xiàn)了綜合利用多種工程方法保存胰島細(xì)胞的巨大潛力。

2.2.3 低毒性的冷凍保護(hù)劑

近年來，一些無毒或低毒的CPA應(yīng)用于胰島低溫保存領(lǐng)域，例如不同來源的抗凍蛋白以及聚兩性電解質(zhì)等。這些CPA具有較低的生物毒性且可以提高胰島低溫保存后的存活率和功能性，展現(xiàn)出了替代傳統(tǒng)有毒保護(hù)劑的潛力[92]。

抗凍蛋白是一種天然來源的保護(hù)劑，其保護(hù)機理可能為通過疏水相互作用與膜磷脂締合，起到穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用[93]，減少了胞外冰對膜造成的損傷。目前抗凍蛋白也已應(yīng)用于胰島低溫保存領(lǐng)域，并取得了良好的保存效果[17,93-95]。聚兩性電解質(zhì)也稱兩性聚電解質(zhì)，已成功實現(xiàn)了胰島[18]、紅細(xì)胞[96]、人肺腺癌細(xì)胞[97]、小鼠成纖維細(xì)胞[98]、小鼠胚胎[99]等樣本的冷凍保存。聚兩性電解質(zhì)具有較強的冰重結(jié)晶抑制作用[98,100-101]，可以減少胰島低溫保存過程中冰晶形成對于胰島的損傷；CPA配方中引入聚兩性電解質(zhì)可以降低保護(hù)劑的滲透壓[102]，從而減輕滲透沖擊對于胰島的損傷；且聚兩性電解質(zhì)具有較低的細(xì)胞毒性，可以降低有毒CPA的用量，減輕其對于胰島的毒性損傷；此外有觀點認(rèn)為聚兩性電解質(zhì)可以在胞外形成無冰的緩沖區(qū)域[103]，減輕冰晶對胰島的機械損傷。

2.3 缺氧損傷的抑制

胰島的血管網(wǎng)絡(luò)在分離過程會被破壞，被動擴散成為分離的胰島獲取氧氣的主要方式[34-35,104]。氧氣輸送受限導(dǎo)致胰島功能下降，內(nèi)部細(xì)胞缺氧死亡，最終導(dǎo)致整個胰島死亡。

在復(fù)溫過程中，細(xì)胞恢復(fù)代謝需要消耗大量能量，ATP耗盡導(dǎo)致細(xì)胞功能不足也會導(dǎo)致胰島的損傷[105-106]。H.Komatsu等[107]研究發(fā)現(xiàn)在高氧(50% 體積濃度的O2)下解凍可以降低胰島炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，更好的保存胰島功能。減輕炎癥細(xì)胞因子對于胰島細(xì)胞活力和功能的不利影響[108-109]，可能是提高胰島存活率和功能性的關(guān)鍵。

ROS(reactive oxygen species，ROS)是冷凍保存過程中細(xì)胞損傷的另一個重要因素[110-114]。通過添加姜黃素和牛磺酸等抗氧化物質(zhì)可以降低ROS水平，減輕細(xì)胞損傷。姜黃素是一種多酚化合物[115]，具有細(xì)胞保護(hù)和抗凋亡特性[116-117]。K.Meghana等[116]觀察到低溫保存胰島ROS水平是新鮮胰島的5倍，且加入姜黃素后低溫保存胰島的ROS水平降至與新鮮胰島ROS水平相當(dāng)。姜黃素增強了胰島中血紅素加氧酶-1(HO-1)和熱休克蛋白70(Hsp 70)基因的表達(dá)，這兩種蛋白在低溫保存中對細(xì)胞具有保護(hù)作用[118]。A.A.Hardikar等[119]研究了在低溫保存之前添加?；撬釋σ葝u的保護(hù)作用，結(jié)果表明，在低溫保存之前添加0.3 mmol/L和3.0 mmol/L?；撬峥商岣咭葝u的存活率(0.3 mmol/L為91.9%±2.3%，3.0 mmol/L為94.6%±1.58%)。

天然胰島復(fù)雜結(jié)構(gòu)給低溫保存帶來了諸多限制[120-123]。胰島的大小是影響低溫保存后胰島質(zhì)量的一個重要因素，在M.A.Mach等[56]將胰島根據(jù)直徑分為Small(<200 μm)、Medium(200～400 μm)和Large(>400 μm)3組，研究不同DMSO濃度和不同加載、去除方式對于胰島活力的影響，結(jié)果顯示，在中等DMSO濃度(1.4 mol/L，2 mol/L)下，胰島活力整體與胰島大小呈負(fù)相關(guān)。且經(jīng)過不同加載、洗脫方式處理后，不同大小的胰島對于處理方式改變的響應(yīng)程度也不同。經(jīng)過不同加載方式(45 min，4 ℃；15 min，4 ℃；45 min，22 ℃)處理的胰島低溫保存再復(fù)溫后，與22 ℃加載組(r=-0.79)相比，4 ℃加載組(45 min，r=-0.84；15 min，r=-0.84)的負(fù)相關(guān)性更強。該研究表明胰島大小對胰島低溫保存后的質(zhì)量影響顯著，對以后胰島低溫保存方案的優(yōu)化，特別是干細(xì)胞分化來源的胰島的低溫保存具有借鑒意義。

將胰島分解為單細(xì)胞可以顯著降低低溫保存中的缺氧損傷。但胰島功能實現(xiàn)高度依賴于細(xì)胞間通訊以及不同細(xì)胞類型間的旁分泌相互作用[124-126]。針對這些特點，研究者們研究了將胰島分解成單細(xì)胞進(jìn)行低溫保存，復(fù)溫后再將其聚合成胰島的保存方法。S.Rawal等[83]對比了將胰島分解為單細(xì)胞保存與整體保存后的胰島存活率與功能，結(jié)果表明胰島直接低溫保存和胰島單細(xì)胞保存的最終存活率均穩(wěn)定在約80%，但單細(xì)胞保存后再聚集的胰島比直接保存的完整胰島具有更高的代謝活性。A.A.Stock等[46]發(fā)現(xiàn)在胰島分解成單細(xì)胞再聚集的過程中會損失掉一部分細(xì)胞，有報道[127]稱該種細(xì)胞丟失可以消除與胰島素分泌無關(guān)的細(xì)胞類型，從而增加細(xì)胞群中胰島素分泌細(xì)胞的比例，起到純化的作用。

雖然將胰島分解為單細(xì)胞保存可以提高胰島細(xì)胞整體的功能性，但酶解成單細(xì)胞也破壞了胰島原本的細(xì)胞構(gòu)成與結(jié)構(gòu)，這些破壞對于胰島整體功能以及后續(xù)存活的影響還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

3 總結(jié)與展望

近年來，由于材料科學(xué)、低溫生物學(xué)和跨學(xué)科研究的發(fā)展，諸多新材料新方法應(yīng)用于胰島低溫保存領(lǐng)域，胰島低溫保存技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展。但現(xiàn)有方案與臨床細(xì)胞治療的需求還有一定差距。首先是仍然缺乏高通量玻璃化保存胰島的方法，一些技術(shù)方法如冷表面玻璃化展現(xiàn)出了高通量保存胰島的潛力，但仍需要進(jìn)一步研究。其次對于胰島低溫保存過程中損傷的機理的研究尚不夠深入，了解損傷機理對于后續(xù)低溫保存程序的設(shè)計具有一定的指導(dǎo)意義。

胰島低溫保存是一個系統(tǒng)性工程，高質(zhì)量保存需要綜合考慮保存過程中的各個方面。胰島低溫保存過程存在諸多損傷因素，最終胰島的損傷是這些損傷因素相互作用的共同結(jié)果。這些損傷的抑制方法很多，如保護(hù)劑的多步加載、降溫過程的控制、非滲透性保護(hù)劑胞內(nèi)遞送以及快速復(fù)溫等。胰島低溫保存要通過多種技術(shù)的協(xié)同作用，將強烈的損傷盡可能分化成為處于胰島耐受范圍內(nèi)的輕微損傷，避免引入單一強烈的處理方式。

在后續(xù)研究中，開發(fā)新材料新技術(shù)以及對于損傷機理的深入研究均具有重要意義。在利用現(xiàn)有的保護(hù)劑以及技術(shù)方法來設(shè)計胰島低溫保存方案時，需要綜合考慮保存過程中的各種損傷，各種保護(hù)方法帶來的不利影響以及其協(xié)同作用。