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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究加味柴芍六君湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機制

    2021-10-12 09:14:16林澤豪陳靜怡莊芬妮黃安聞連雄瀚朱景茹涂文玲甘慧娟
    福建中醫(yī)藥 2021年9期
    關(guān)鍵詞:柴芍靶點通路

    林澤豪,傅 頤,陳靜怡,莊芬妮,黃安聞,連雄瀚,朱景茹,涂文玲,甘慧娟

    (福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,福建 福州350122)

    慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是臨床常見的消化性疾病,為胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵始動環(huán)節(jié),以胃黏膜固有腺體萎縮為主要病理特點,甚至伴見腸化或上皮內(nèi)瘤變,被世界衛(wèi)生組織定義為癌前狀態(tài)。該病癥狀易反復(fù)發(fā)作,嚴重影響患者的生活質(zhì)量,其發(fā)病率和檢出率隨年齡增長而增加[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療CAG主要采取根除幽門螺桿菌(Hp)、胃黏膜保護、抗氧化治療、促進胃黏膜再生、內(nèi)鏡微創(chuàng)技術(shù)等治療方法[3],臨床取得一定療效,但多以對癥治療為主,遠期療效較差。因此,迫切需要一種替代療法用以防治CAG。中醫(yī)藥治療消化疾病具有獨特的優(yōu)勢和廣闊前景,且因其療效安全,不良反應(yīng)小的特點而備受關(guān)注,臨床上有諸多醫(yī)家運用加味柴芍六君湯治療CAG取得了良好的療效[4-6],然而其治療CAG的作用機制尚未得到充分揭示。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程、從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)[7],近年來,越來越多科研工作者從系統(tǒng)的角度探討中藥復(fù)方多成分多靶點與疾病的關(guān)系,為現(xiàn)代中醫(yī)藥的研究提供了新的方向。因此,本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點,對加味柴芍六君湯治療CAG的靶點作用網(wǎng)絡(luò)進行分析,預(yù)測其治療CAG的可能作用機制。

    1 方 法

    1.1 加味柴芍六君湯有效活性成分與作用靶點搜集與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(簡稱TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php),分別以“白 芍”“白術(shù)”“半夏”“柴胡”“陳皮”“丹參”“莪術(shù)”“茯苓”“甘草”“人參”為檢索詞進行檢索,設(shè)置口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為篩選條件,搜集加味柴芍六君湯的有效活性成分信息。然后對篩選出的有效活性成分進行蛋白靶標查找,將獲取的蛋白靶標進行基因名稱轉(zhuǎn)換,獲取加味柴芍六君湯的作用靶點信息。

    1.2 CAG的疾病作用靶點獲取 用GeneCards數(shù)據(jù)庫對“Chronic at-rophic gastritis”進行檢索,獲取CAG的疾病作用靶點。通過Venny 2.1.0在線工具,獲得CAG與加味柴芍六君湯共同作用靶點,即加味柴芍六君湯治療CAG的作用靶點。

    1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的可視化構(gòu)建與分析 將加味柴芍六君湯的有效活性成分-作用靶點信息、單味藥-有效活性成分信息和CAG-作用靶點信息導(dǎo)入C-ytoscape3.7.2軟件,分別繪制出三者之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò),再利用“Merge”功能將其合并成加味柴芍六君湯治療CAG的有效活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。將共同作用靶點導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫“Multiple proteins”檢索框中,以互動得分≥0.900為篩選條件,構(gòu)建加味柴芍六君湯與CAG之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò)),并對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析。

    1.4 GO生物學(xué)過程和KEGG信號通路富集分析利用String數(shù)據(jù)庫分析后的核心靶點進行GO生物學(xué)過程和KEGG信號通路富集分析;利用Bioconductor生物信息軟件包,對所預(yù)測的化學(xué)成分靶點進行富集分析,以P<0.05為篩選條件進行可視化處理,再將加味柴芍六君湯對應(yīng)的靶蛋白直接映射到通路上,選取既包含藥物靶點又包含疾病靶點的通路做出KEGG信號通路富集分析柱狀圖。

    1.5 分子對接 利用PubChem數(shù)據(jù)庫得到加味柴芍六君湯活性成分的結(jié)構(gòu)信息,在PDB數(shù)據(jù)庫檢索得到核心靶點的結(jié)構(gòu)信息,最后利用Vina1.1.2軟件完成加味柴芍六君湯活性成分與靶點受體的分子對接。

    2 結(jié) 果

    2.1 加味柴芍六君湯靶點信息獲取 共篩選出加味柴芍六君湯有效活性成分195個(其中白芍13個、白術(shù)7個、半夏13個、柴胡17個、陳皮5個、丹參65個、莪術(shù)3個、茯苓15個、甘草92個、人參22個),藥物靶點265個。文中只保留OB值排名第1的有效活性成分,見表1。將經(jīng)過篩選轉(zhuǎn)化的單味中藥主要活性成分及作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建加味柴芍六君湯治療CAG的有效活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò),見圖1。

    表1 加味柴芍六君湯有效活性成分

    圖1 加味柴芍六君湯治療CAG的有效活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)

    2.2 加味柴芍六君子湯治療CAG的作用靶點獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索得到CAG作用靶點613個,將加味柴芍六君子湯的作用靶點和CAG的作用靶點分別輸入Venny 2.1.0在線工具分析,得到共同靶點89個。見圖2。

    圖2 疾病-藥物-靶點(DDT)韋恩圖

    2.3 相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將89個共同作用靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建出這89個共同作用靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)模型。見圖3。該網(wǎng)絡(luò)包含89個共同作用靶點,336條連接線,平均度值為35.8,其中NFKBIA、SPP1、CASP9、TIMP1、MMP1、MCL1、CDKN1A、HIF1A、SERPINE1、STAT1、MPO、VCAM1、PPARG、AR、CASP8、IFNG、ERBB2、ICAM1、BCL2L1、MMP2、CAT、MAPK14、FOS、CCL2、IL1B、CCND1、EGFR、MYC、MAPK1、CXCLB、MMP9、EGF、STAT3、MAPK3、CASP3、VEGFA、MAPK8、PTGS2、JUN、TP53、AKT1的度值高于平均度值即為相對核心靶點。見圖3。

    圖3 共同作用靶點互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

    2.4 GO生物學(xué)過程富集分析 通過R軟件運行腳本對89個共同作用靶點進行GO生物學(xué)過程富集分析,獲得P<0.05的GO條目117個,結(jié)果表明加味柴芍六君湯治療CAG過程主要涉及磷酸酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過程,文中共列出排名前20的GO富集氣泡圖。見圖4。

    圖4 前20名GO富集氣泡圖

    2.5 KEGG信號通路富集分析 通過R軟件運行腳本對89個共同作用靶點進行KEGG信號通路富集分析,根據(jù)P<0.05篩選到152條信號通路,涉及到的信號通路類型主要有病毒感染(卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人類巨細胞病毒感染等)、癌癥(前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等)、信號傳導(dǎo)(PI3K-Akt信號、AGE-RAGE信號、MAPK信號、HIF-1信號、JAK-STAT信號、RIG-I樣受體信號、B細胞受體信號、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號等)、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、麻疹等。見圖5。

    圖5 KEGG信號通路富集分析柱狀圖

    2.6分子對接 為了進一步驗證“有效活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測結(jié)果,將前5位核心靶點AKT1、TP53、JUN、PTGS2、MAPK8與其對應(yīng)的主要活性成分kaempferol、baicalein、beta-sitosterol、Cavidine、nobiletin進行分子對接,獲得的相關(guān)對接參數(shù)以及相應(yīng)的計算結(jié)果,見表2。一般認為配體與受體結(jié)合的自由能越低,結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定,發(fā)生作用的可能性越大,加味柴芍六君湯的主要活性成分與核心靶點結(jié)合自由能均<-5 kcal/mol,提示篩選出的核心靶點與其對應(yīng)的活性成分具有良好的親和力,證明結(jié)果具有一定的可信度。前5位核心靶點與其對應(yīng)的活性成分對接結(jié)果,見圖6。

    表2 活性成分與核心靶點對接參數(shù)及計算結(jié)果

    圖6 對接結(jié)果圖

    3 討 論

    近年來,CAG的發(fā)病率呈明顯上升趨勢,且逐漸趨于年輕化,發(fā)病機制尚未明確,由于內(nèi)外多重因素刺激導(dǎo)致胃黏膜腺體遭受破壞,從而出現(xiàn)萎縮、腸上皮化生甚至異型增生等難以逆轉(zhuǎn)的病理學(xué)改變,長期反復(fù)發(fā)作容易誘發(fā)癌變,是許多科研工作者廣泛關(guān)注的熱點問題之一[8]。課題組前期研究證實,肝郁脾虛是CAG重要病理特點,肝郁、脾虛常相互影響,氣郁、脾虛導(dǎo)致水液代謝障礙,產(chǎn)生痰濕,痰濕反過來影響了肝、脾功能,加重病情[9]。加味柴芍六君湯方中柴胡疏肝行氣;白芍養(yǎng)血柔肝;人參、茯苓、白術(shù)健脾益氣;半夏、陳皮理氣燥濕化痰,和胃降逆;丹參活血祛瘀,通經(jīng)止痛;莪術(shù)辛溫,破血止痛;甘草調(diào)和諸藥。全方共奏健脾和胃、活血祛瘀、疏肝理氣之功。現(xiàn)代藥理研究表明,白術(shù)能雙向調(diào)節(jié)胃腸道,保護胃黏膜,提高免疫功能;白芍具有調(diào)節(jié)免疫,解除平滑肌痙攣作用,其中芍藥甙能抗炎、保護胃黏膜;甘草具有抗?jié)?、抗痙攣、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤及解毒功效[10]。

    本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討加味柴芍六君湯治療CAG的可能作用機制。通過對加味柴芍六君湯有效活性成分、作用靶點搜集與篩選,獲取195個有效活性成分,包含槲皮素、常春藤皂苷元、甘草甜素、蓽澄茄素、米橘素等。槲皮素能逆轉(zhuǎn)DKK3啟動子甲基化恢復(fù)其表達將有助于抑制胃癌的惡性轉(zhuǎn)化。槲皮素逆轉(zhuǎn)MSX1基因的甲基化狀態(tài)后,恢復(fù)MSX1基因的功能則可誘導(dǎo)DKK3等基因的表達,理論上也可間接抑制胃癌的發(fā)生[11]。常春藤皂苷元能抑制胃癌MGC803增殖,對胃癌細胞侵襲、黏附、遷移能力有著明顯的影響,是一種良好的抗腫瘤藥物[12]。在對炎癥趨化因子和促炎癥因子的表達方面,甘草甜素能夠抑制結(jié)腸髓過氧化物酶,減少活性氧化物質(zhì)導(dǎo)致的脂質(zhì)蛋白變性和器官損傷,改善炎癥癥狀[13]。

    將加味柴芍六君湯的作用靶點和CAG的作用靶點分別輸入Venny2.1.0在線工具分析,得到共同作用靶點89個。通過構(gòu)建共同作用靶點互作網(wǎng)絡(luò),分析得出IL1B、AKT1、TP53、JUN、MAPK8、VEGFA、MAPK3、STAT3、MAPK1等41個相對核心靶點。其中IL-1β是典型的促炎性細胞因子,炎性信號可通過激活炎癥小體而刺激分泌IL-1β,過量分泌的IL-1β會引起廣泛的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致炎性損傷[14]。IL-1β還是目前發(fā)現(xiàn)的最強的胃酸分泌抑制劑,持續(xù)的低酸分泌會促進萎縮的發(fā)生發(fā)展,增加胃癌的發(fā)生危險[15-16]。IL-6是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子,是發(fā)動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性因子,可以誘導(dǎo)內(nèi)皮發(fā)生細胞活化,刺激中性粒細胞產(chǎn)生趨化作用,并產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)[17]。有研究表明,IL-6在胃黏膜炎癥反應(yīng)過程中具有極其明顯的指示作用,但是達到了一定的范圍就可能會對胃黏膜產(chǎn)生損傷作用[18]。

    通過GO生物學(xué)過程富集分析可知,加味柴芍六君湯對CAG的治療作用主要通過參與以下生物學(xué)過程而發(fā)揮療效:磷酸酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過程。進一步的KEGG信號通路富集分析提示,加味柴芍六君湯主要通過調(diào)控HIF-1、PI3K-Akt、MAPK等多種信號通路而達到治療CAG的作用。HIF-1α與慢性炎性反應(yīng)的關(guān)系密切,是廣泛存在于機體細胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,該基因由低氧誘導(dǎo)并介導(dǎo)細胞對缺氧微環(huán)境進行適性反應(yīng),缺氧時HIF-1α表達顯著上調(diào),由此啟動60余種下游因子的轉(zhuǎn)錄以使細胞逐漸適應(yīng)有氧到缺氧的轉(zhuǎn)變[19]。PI3K/Akt途徑信號傳導(dǎo)與異常細胞增殖和凋亡有關(guān),這兩者都與腫瘤發(fā)生直接相關(guān),PI3K/Akt通路在胃癌細胞增殖和存活中發(fā)揮著重要作用[20]。MAP-K途徑可以將細胞表面信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核,對多數(shù)細胞的增生和程序化死亡等的調(diào)節(jié)起到重要意義[21]。分子對接結(jié)果顯示,加味柴芍六君湯活性成分與相應(yīng)核心靶點對接親和力良好,對接體系穩(wěn)定,進一步證明了本研究關(guān)于加味柴芍六君湯治療CAG機制的有效性與可靠性。

    本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,從整體和系統(tǒng)的角度初步預(yù)測了加味柴芍六君湯治療CAG的作用機制,其可能是通過抗炎,降低炎性因子IL-1β、IL-6的水平來減輕CAG黏膜細胞的缺氧狀態(tài),調(diào)節(jié)HIF-1α等細胞轉(zhuǎn)錄因子和蛋白的表達,或通過調(diào)控HIF-1、PI3K-Akt、MAPK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而改善胃黏膜瘀血狀態(tài),起到抗胃黏膜萎縮的作用,具有一定的研究價值。為進一步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性,后期有必要開展相應(yīng)的基礎(chǔ)實驗進一步闡述加味柴芍六君湯治療CAG的作用機制。

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