聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析復(fù)方川貝散中川貝母成分

張國(guó)林，魏星，邢以文，薛滿

貝母為百合科植物干燥鱗莖，具有清熱潤(rùn)肺、止咳化痰的藥理活性。貝母常見(jiàn)品種有川貝母（Fritillariae cirrhosae bulbus）、浙 貝 母（Fritillariae thunbergii bulbus）、平貝母（Fritillarae ussuriensis bulbus）和伊貝母（Fritillariae pallidiflorae bulbus）等。貝母屬川貝母止咳化痰效果優(yōu)于其他貝母，但由于川貝母資源短缺、價(jià)格較高，市場(chǎng)上存在摻假摻偽的現(xiàn)象。同時(shí)，川貝母多以藥材原粉入藥，給采用常規(guī)方法鑒別帶來(lái)較大困擾。川貝母ITS區(qū)的第75位堿基為C，含有CCCGGG序列的SmaI酶切位點(diǎn)，而非川貝類(lèi)此位點(diǎn)為T(mén)，是CTCGGG序列，無(wú)

SmaI

酶切位點(diǎn)?；诖?，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法（PCR-RFLP）可以實(shí)現(xiàn)從分子水平上對(duì)川貝母的鑒別。雖然目前有關(guān)于分子生物學(xué)方法鑒定川貝母的報(bào)道，但關(guān)于中藥制劑中采用分子生物學(xué)方法鑒定川貝母的報(bào)道較少。本研究研究起止時(shí)間為2019年2月至2019年5月，采用PCR-RFLP法對(duì)復(fù)方川貝散中的川貝母成分進(jìn)行分析，并以含有平貝母成分的蛇膽川貝液為對(duì)照。

1 材料與方法

1.1 藥品

國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)川貝母（暗紫貝母）（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批次121000～201609）；復(fù)方川貝散（處方為川貝母、浙貝母和珍珠）（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，批號(hào)Z04001116，批次20190307）；蛇膽川貝液（廣東一力羅定制藥有限公司，批號(hào)Z44023603，批次180201）；川貝母（無(wú)錫葆壽堂藥業(yè)有限公司，批次Y181204）；珍珠層粉（蘇州工業(yè)園區(qū)天龍制藥有限公司，批號(hào)Z32020625，批次CF190206）。

1.2 試劑與儀器

新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱）購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司（批號(hào)0020170104）；Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司（批號(hào)00517449）；20μmol引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（上游引物批號(hào)2409103320，下游引物批號(hào)2409103319）；Nuclease-free Water購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司（批號(hào)00513931）；50×TAE緩沖液購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司（批號(hào)20170620）；AGEAROSE G-10瓊脂糖購(gòu)自西班牙BIOWEST公司（批號(hào)111860）；GelRed購(gòu)自美國(guó)Biotium公司（批號(hào)14G0805）；10×T Buffer（BSA free）購(gòu)自日本TaKaRa公司（批號(hào)A1801A）；0.1%牛血清白蛋白購(gòu)自日本TaKaRa公司（批號(hào)A4201A）；SmaⅠ購(gòu)自日本TaKaRa公司（批號(hào)AGX0152A）；TissueLyserⅡ組織破碎儀購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；MK-10干式恒溫器購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司；Lab Dancer漩渦混合器購(gòu)自德國(guó)IKA公司；Transferpette? S移液槍購(gòu)自德國(guó)BRAND公司；Biofuge Primo R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Veriti96熱循環(huán)儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；PowerBac Basic電泳儀基礎(chǔ)電源購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；PURA10通用水浴槽購(gòu)自優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 DNA提取

DNA提取根據(jù)新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱）說(shuō)明書(shū)操作。提取完成后用50 μL洗脫緩沖液EB洗脫提取物，將收集的DNA于-20℃保存待用。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（暗紫貝母）取樣量約50 mg，復(fù)方川貝散取樣量約50 mg，蛇膽川貝液取樣量為50 μL。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系為50 μL：Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）25 μL；20 μmol正向引物1 μL；20 μmol反向引物1 μL；無(wú)菌超純水21 μL；DNA模板2 μL。以無(wú)菌超純水代替DNA模板作為空白對(duì)照。PCR程序?yàn)椋?5℃、4 min；（95℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s）30個(gè)循環(huán)；72℃、5 min。引物序列：正向引物5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3’；反向引物5’-GCTACGTTCTTCATCGAT-3’。

1.5 限制性內(nèi)切酶酶切

酶切體系為20 μL：10×T Buffer（BSA free）2 μL；0.1% BSA 2 μL；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12 μL；SmaⅠ（10 U/μL）1.5 μL；無(wú)菌超純水2.5 μL。酶切反應(yīng)體系在30℃水浴中孵育2 h。以無(wú)菌超純水代替PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為空白對(duì)照，其他操作均相同。

1.6 復(fù)方川貝散中川貝母靈敏度與檢出限

采用等量遞增法對(duì)川貝母粉和珍珠層粉進(jìn)行混合進(jìn)行靈敏度分析。設(shè)計(jì)川貝母含量分別為0%、5%、10%、20%、30%、40%共6個(gè)梯度進(jìn)行PCR-RFLP實(shí)驗(yàn)。待確認(rèn)靈敏度范圍后采用PCR-RFLP進(jìn)行第二次等量遞增法確認(rèn)靈敏度和檢出限。川貝母樣品采用組織破碎儀碎后使用（頻率30次/秒，5 min）。DNA提取、PCR擴(kuò)增及酶切操作按照“1.3”～“1.5”方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方川貝散和蛇膽川貝液PCR擴(kuò)增及限制性酶切結(jié)果

復(fù)方川貝散和蛇膽川貝液PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)特異性條帶，但經(jīng)SmaⅠ酶切后復(fù)方川貝散在100～250 bp之間出現(xiàn)兩條特異性酶切條帶，而蛇膽川貝液經(jīng)SmaⅠ酶切后無(wú)特異性條帶。見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)方川貝散和蛇膽川貝液PCR擴(kuò)增及限制性酶切結(jié)果：A為復(fù)方川貝散和蛇膽川貝液PCR電泳結(jié)果；B為復(fù)方川貝散和蛇膽川貝液PCR產(chǎn)物限制性酶切電泳結(jié)果

2.2 復(fù)方川貝散中川貝母檢測(cè)靈敏度

對(duì)川貝母含量為0%、5%、10%、20%、30%、40%共6個(gè)梯度樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)川貝母含量為5%時(shí)，PCR擴(kuò)增后可出現(xiàn)明顯的特異性條帶，見(jiàn)圖2A。對(duì)上述6個(gè)梯度樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用SmaⅠ酶切后發(fā)現(xiàn)川貝母含量為5%時(shí)，在100～250 bp之間得到兩條特異性DNA條帶，見(jiàn)圖2B。

圖2 復(fù)方川貝散中川貝母檢測(cè)靈敏度檢查：A為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；B為限制性內(nèi)切酶電泳圖

2.3 復(fù)方川貝散川貝母檢出限

以川貝母含量為1%、2%、3%、4%、5%共5個(gè)梯度進(jìn)行PCR-RFLP實(shí)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)川貝母含量為4%和5%時(shí)可得到特異性條帶。對(duì)上述5個(gè)梯度樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用SmaⅠ酶切后發(fā)現(xiàn)川貝母含量為4%和5%時(shí)，在100～250 bp之間得到兩條特異性DNA條帶。見(jiàn)圖3。

圖3 復(fù)方川貝散川貝母檢出限：A為川貝母檢測(cè)限PCR產(chǎn)物電泳圖；B為川貝母檢測(cè)限PCR產(chǎn)物SmaI酶切電泳圖

3 討論

復(fù)方川貝散具有止咳化痰、清熱鎮(zhèn)驚的藥理活性，臨床上可用于外感風(fēng)熱咳嗽或痰火郁結(jié)、肝火犯肺之久咳、痙咳等。復(fù)方川貝散是川貝母、浙貝母、珍珠制成的。川貝母由于資源少、價(jià)格高等原因，摻偽情況時(shí)有發(fā)生。由于中藥制劑中的川貝母通常為打粉入藥或提取物，故常規(guī)的顯微鑒別、薄層鑒別方法或藥師的經(jīng)驗(yàn)鑒別存在較大的局限性。PCR-RFLP是基于川貝母含有SmaⅠ酶切位點(diǎn)的特有ITS序列進(jìn)行分析的，具有特異性高和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。本研究也證實(shí)復(fù)方川貝散和蛇膽川貝液PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)特異性條帶，但復(fù)方川貝散經(jīng)SmaⅠ酶切后在100～250 bp之間出現(xiàn)兩條特異性酶切條帶，而蛇膽川貝液經(jīng)SmaⅠ酶切后無(wú)特異性條帶，提示復(fù)方川貝散中含有川貝母而蛇膽川貝液中不含川貝母。PCR-RFLP方法應(yīng)用于鑒別中藥制劑中的川貝母可行。PCR-RFLP經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶的酶切兩步完成的，其中待檢樣本中DNA分子的完整性是進(jìn)行有效鑒別的物質(zhì)基礎(chǔ)。復(fù)方川貝散屬于散劑劑型，各成分未經(jīng)過(guò)提取或化學(xué)手段處理，DNA分子相對(duì)較為完整，因此采用PCR-RFLP可以實(shí)現(xiàn)有效的鑒別。筆者同時(shí)也對(duì)部分含有川貝母成分的中藥口服液進(jìn)行了PCR-RFLP的實(shí)驗(yàn)，但均未獲得有效的結(jié)果，推測(cè)可能是其中的DNA分子被破壞，無(wú)法進(jìn)行有效的擴(kuò)增所致。因此，PCR-RFLP方法鑒別中藥制劑中的川貝母成分需確保川貝母DNA分子完整，否則可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

PCR-RFLP屬于高靈敏度的檢測(cè)方法。為進(jìn)一步分析不同川貝母含量樣本中的檢測(cè)靈敏度，我們制備了川貝母含量為0%、5%、10%、20%、30%、40%的6個(gè)梯度樣本進(jìn)行了PCR-RFLP分析，結(jié)果證實(shí)川貝母含量為4%時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用SmaⅠ酶切后發(fā)現(xiàn)川貝母含量為5%時(shí)，在100～250 bp之間得到兩條特異性DNA條帶，提示PCR-RFLP可以對(duì)川貝母含量超過(guò)4%的樣本進(jìn)行有效的檢測(cè)。但應(yīng)當(dāng)指出的是檢測(cè)的靈敏度除了與川貝母的含量有關(guān)外，也與樣本中DNA分子的完整程度以及制劑的制備工藝有關(guān)。同時(shí)，由于PCR-RFLP屬于高靈敏度檢測(cè)方法，若制劑的大量非川貝母中混有少量的川貝母成分，最終的檢測(cè)結(jié)果也可能會(huì)表現(xiàn)為陽(yáng)性。在以后的工作中我們將進(jìn)一步探索對(duì)制劑中川貝母成分定性分析的方法，為市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支撐。