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    基于特征圖譜及主要成分含量比例特征鑒別制草烏及其偽品

    2021-10-11 09:30:18高妍過(guò)立農(nóng)劉杰馬雙成鄭健昝珂
    化學(xué)分析計(jì)量 2021年9期
    關(guān)鍵詞:草烏甲酰偽品

    高妍,過(guò)立農(nóng),劉杰,馬雙成,鄭健,昝珂

    (中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050)

    草烏是一種常用中藥材,味辛、苦,具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效。2020 年版《中國(guó)藥典》(一部)收載草烏為毛茛科植物北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥塊根,主要用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛[1]。草烏主要分布于山西、河北、內(nèi)蒙古和東北三省等地[2],有大毒,含有烏頭堿等雙酯型生物堿等劇毒成分,需炮制后使用[3-5]。

    制草烏屬于草烏的加工炮制品,功效同草烏,是104 個(gè)中藥成方制劑的處方藥味??偵飰A為制草烏的有效成分和毒性成分。草烏經(jīng)炮制后,毒性強(qiáng)的雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿。研究表明,雖然單酯型生物堿的毒性是雙酯型生物堿毒性的1/150~1/500,但毒性依然較強(qiáng),長(zhǎng)期或超量使用會(huì)引起中毒癥狀,如口唇和四肢麻痹等,嚴(yán)重者可危及生命[6-8]。2020 年版《中國(guó)藥典》中制草烏含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定,制草烏中含苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的總量應(yīng)為0.020%~0.070%[1]。

    在近幾年開(kāi)展的藥材市場(chǎng)抽樣檢驗(yàn)工作中,發(fā)現(xiàn)一種制草烏偽品,該偽品經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院鑒定為毛茛科植物準(zhǔn)噶爾烏頭Aconitum soongaricum (Regel)Stapf 干燥根的炮制品。對(duì)收集的制草烏偽品按照2020 年版《中國(guó)藥典》(一部)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)樣品中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的總量結(jié)果均不符合規(guī)定,若制劑投料中混有該偽品,將造成安全隱患。

    采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定制草烏藥材中的生物堿已有報(bào)道[9-15],但制草烏的特征圖譜以及3 種指標(biāo)性成分的含量比例特征,特別是結(jié)合偽品進(jìn)行分析,尚未有報(bào)道。筆者采用HPLC 法建立了制草烏和偽品的特征圖譜,并對(duì)苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿3 種有效成分開(kāi)展含量測(cè)定,分析并探討制草烏及其偽品的含量特征,建立制草烏準(zhǔn)確、快速的鑒別方法,為規(guī)范制草烏藥材的使用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與試劑

    液相色譜儀:Agilent 1260 型,配備二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)安捷倫科技公司。

    電子天平:(1)QUINTIX313-1CN 型,感量為0.1 mg;(2)MSE125 s 型,感量為0.01 mg,德國(guó)賽多利斯公司。

    色譜柱: XBridge C18柱(250×4.6 mm,5 μm),填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠,沃特世科技(上海)有限公司。

    苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品:純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為97.5%,批號(hào)為111794-201304,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品:純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為96.3%,批號(hào)為111795-201303,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品:純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為94.6%,批號(hào)為111796-201304,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    甲醇、乙腈、冰乙酸、乙酸銨和異丙醇:均為色譜純,美國(guó)Fisher 公司。

    三氯甲烷:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    氨水:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    草烏藥材樣品:共收集30 批制草烏藥材樣品。其中20 批正品藥材(編號(hào)為1#~20#),經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院鑒定為毛茛科北烏頭干燥塊根的加工炮制品;10 批偽品(編號(hào)為21#~30#)鑒定為毛茛科植物準(zhǔn)噶爾烏頭根的加工炮制品。

    實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

    1.2 混合對(duì)照品溶液的制備

    分別精密稱(chēng)取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品適量于10 mL 容量瓶中,以異丙醇-三氯甲烷(體積比為1∶1)混合溶液定容至標(biāo)線(xiàn),即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于容量瓶中,用異丙醇-三氯甲烷(體積比為1∶1)混合溶液定容至標(biāo)線(xiàn),即得苯甲酰新烏頭原堿質(zhì)量濃度為68 μg/mL、苯甲酰烏頭原堿質(zhì)量濃度為16 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿質(zhì)量濃度為79 μg/mL 的對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.3 供試品溶液的制備

    取樣品過(guò)355±13 μm 的篩(三號(hào)篩),取約2 g粉末,精密稱(chēng)定,置于具塞錐形瓶中,加氨水3 mL,精密加入異丙醇-乙酸乙酯(體積比為1∶1)混合溶液50 mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率為250 W,頻率為33 kHz)30 min,放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用異丙醇-乙酸乙酯補(bǔ)足減失重量,搖勻,濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL,于40 ℃以下減壓回收溶劑至干,向殘?jiān)芯芗尤氘惐?三氯甲烷混合溶液3 mL 溶解,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

    1.4 液相色譜條件

    色 譜 柱:Waters XBridge C18柱[250 mm×4.6 mm,5 μm,沃特世科技(上海)有限公司];流動(dòng)相:A 為乙腈-四氫呋喃(體積比為25∶15),B 為0.1 mol/L 乙酸銨水溶液(每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL);梯度洗脫條件:0~48 min,15%~26%A;流量:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):235 nm。

    1.5 制草烏和偽品的特征圖譜的建立

    在上述條件下取得制草烏正、偽品色譜圖,采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件分析采集得到的數(shù)據(jù),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊處理,并指認(rèn)特征峰。通過(guò)精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性考察,對(duì)建立的特征圖譜進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)一步計(jì)算特征圖譜與制草烏正品、偽品的相似度以及聚類(lèi)結(jié)果,分析建立的特征圖譜是否能夠成功鑒別制草烏正、偽品。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 液相色譜流動(dòng)相選擇

    考察了乙腈-水、乙腈-0.1 mol/L 乙酸銨水溶液(每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL)以及2020 年版《中國(guó)藥典》(一部)制草烏項(xiàng)下[1]采用的A 相為乙腈-四氫呋喃(體積比為25∶15),B 相為0.1 mol/L乙酸銨水溶液(每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL)的流動(dòng)相體系下主成分的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙腈-水、乙腈-0.1 mol/L 乙酸銨水溶液(每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL)條件下主成分的色譜峰形不理想且分離度差,因此,最終按照2020 年版《中國(guó)藥典》 (一部)制草烏項(xiàng)下“含量測(cè)定”的方法進(jìn)行測(cè)定,也因此不再進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

    2.2 制草烏特征圖譜

    分別精密稱(chēng)量制草烏樣品(樣品1#~20#),按1.3方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)量,記錄25 min的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1 所示。采用Chempattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件分析采集所得數(shù)據(jù),將樣品1#設(shè)定為參照?qǐng)D譜,自動(dòng)匹配其它樣品,生成制草烏正品的特征圖譜見(jiàn)圖2 所示。對(duì)建立的特征圖譜中的3 個(gè)特征峰進(jìn)行指認(rèn),采用對(duì)照品比對(duì)法及DAD 光譜分析法,指認(rèn)苯甲酰新烏頭原堿為1 號(hào)峰,苯甲酰烏頭原堿為2 號(hào)峰,苯甲酰次烏頭原堿為3 號(hào)峰。

    圖2 制草烏HPLC 特征圖譜

    2.2.1 系統(tǒng)適用性

    在1.4 色譜條件下,分別對(duì)制草烏(樣品4#)、偽品(樣品23#)、對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè),以苯甲酰烏頭原堿數(shù)據(jù)計(jì)算理論塔板數(shù)大于6 000,分離度大于1.5。對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖如圖3所示。

    圖3 制草烏、偽品與對(duì)照品的HPLC 色譜圖

    2.2.2 儀器精密度試驗(yàn)

    精密吸取同一供試品溶液(樣品1#),在1.4色譜條件下,連續(xù)測(cè)定6 次,記錄色譜圖,采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件(科邁恩科技有限公司)評(píng)價(jià),相似度為0.99??疾焯卣鞣逑鄬?duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,以苯甲酰烏頭原堿為參照峰,結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于1%,單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對(duì)峰面積RSD 小于2%,表明儀器精密度良好。

    2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    分別于0、2、4、6、8、12、24 h,在1.4 色譜條件下測(cè)定同一的供試品(樣品1#)溶液,記錄色譜圖。采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià),相似度為0.99。進(jìn)一步考察特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,以苯甲酰烏頭原堿為參照峰,發(fā)現(xiàn)各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 小于1%,單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對(duì)峰面積RSD 小于2%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

    精密稱(chēng)定同一批樣品(樣品1#)6 份,按2.2.2方法分別制備供試品溶液并測(cè)定,記錄色譜圖。采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià),相似度為0.99。進(jìn)一步考察特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,以苯甲酰烏頭原堿為參照峰,發(fā)現(xiàn)各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 小于1%,單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對(duì)峰面積RSD 小于2%,表明該方法重復(fù)性好。

    2.3 比較分析制草烏特征圖譜與偽品色譜圖

    精密稱(chēng)定不同批次的制草烏偽品(樣品21#~30#),按2.2.2 方法制備供試品溶液,測(cè)定并記錄色譜圖如圖4 所示。采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件分析采集得到的數(shù)據(jù),計(jì)算特征圖譜與制草烏正、偽品相似度如圖5 所示。結(jié)果表明,制草烏正品和特征圖譜之間的相似度均大于0.90,說(shuō)明相似度良好;偽品和特征圖譜之間的相似度均小于0.25,可見(jiàn)偽品和特征圖譜差異大,存在顯著不同。建立的制草烏特征圖譜可用于制草烏的鑒別和質(zhì)量控制。

    圖4 10 批制草烏偽品準(zhǔn)噶爾烏頭HPLC 色譜圖

    圖5 制草烏及其偽品相似度分析

    2.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

    采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件處理采集的數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)為AIA 格式),對(duì)相應(yīng)的色譜峰進(jìn)行積分,按照樣品的標(biāo)準(zhǔn)化處理峰面積,聚類(lèi)分析和主成分分析的結(jié)果如圖6 和圖7 所示。

    圖6 制草烏及其偽品聚類(lèi)分析結(jié)果

    圖7 制草烏及其偽品主成分分析結(jié)果

    由圖6、圖7 可知,兩種方法均能將制草烏及其偽品分成兩組,進(jìn)而準(zhǔn)確地區(qū)分制草烏的正、偽品。

    建立的制草烏特征圖譜,20 批制草烏色譜圖與特征圖譜之間的相似度均大于0.90,相似度良好,說(shuō)明不同批次制草烏成分種類(lèi)及含量比例相似。而10 批偽品色譜圖與特征圖譜之間相似度均小于0.25,相似度較低,表明偽品與正品的化學(xué)成分存在差異。采用聚類(lèi)分析和主成分分析均能準(zhǔn)確區(qū)分正、偽品,因此,基于特征圖譜可以有效區(qū)分制草烏及其偽品。

    2.5 制草烏3 個(gè)成分含量測(cè)定

    樣品按照1.4 方法制備供試品溶液,在1.5 色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,采用外標(biāo)法對(duì)20 批正品和10 批偽品中3 種主成分的含量進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果分別見(jiàn)表1 和表2。由表1 和表2 可知,20 批正品制草烏和10 批偽品中均含有3 種單酯型生物堿,即苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿,但是制草烏和偽品中3 種成分的比例顯著不同。

    表1 20 批正品中3 種成分含量測(cè)定結(jié)果 %

    表2 10 批偽品中3 種成分含量測(cè)定結(jié)果 %

    制草烏中含量最高的是苯甲酰新烏頭原堿,苯甲酰新烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為6.80%~13.67%,平均值為10.08%;苯甲酰次烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為0.71%~1.50%,平均值為1.00%。從含量上看,20 批正品制草烏中,有13 批的含量超過(guò)《中國(guó)藥典》中0.020%~0.070%的規(guī)定,超標(biāo)1.1~7.9 倍,推測(cè)為炮制不規(guī)范所致。

    偽品中含量最高的是苯甲酰烏頭原堿,與正品明顯不同。偽品中苯甲酰新烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為0.01%~0.06%,平均值為0.03%;苯甲酰次烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為0.02%~0.05%,平均值為0.03%。由此可見(jiàn),制草烏正、偽品中3 種主要成分的含量比例差異較大,依據(jù)主要成分的含量比例特征可以鑒別制草烏正、偽品。同時(shí),從含量上看,10 批偽品中3 種單酯型生物堿的總量均高于《中國(guó)藥典》中含量0.020%~0.070%的規(guī)定,按最高限度計(jì)算,超標(biāo)4.2~26.1 倍。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,制草烏偽品與正品中3 種有效成分的含量比例差異較大,偽品中3 種單酯型生物堿的含量超標(biāo)嚴(yán)重,且制草烏正偽品存在差異化學(xué)成分,若混用偽品,將直接影響制草烏的療效和用藥安全,應(yīng)引起注意。

    3 結(jié)語(yǔ)

    建立了制草烏的特征圖譜,同時(shí)探討了3 種有效成分的含量比例特征,可以準(zhǔn)確、快速地鑒別制草烏正、偽品。該方法可同時(shí)定性、定量,將為制草烏的質(zhì)量控制提供科學(xué)有力的支持。

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