圓葉葡萄抗性種質(zhì)及利用

楊博涵，傅佩寧，盧江*

（上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院葡萄與葡萄酒研究中心，上海 200240）

圓葉葡萄 [Muscadinia rotundifolia（Michx.）Small]起源于美國[1-3]，主要分布在特拉華州到佛羅里達州中部，以及從墨西哥灣到德克薩斯州東部地區(qū)[4-5]。與葡萄屬相比，圓葉葡萄在染色體數(shù)量、抗性、果實特征、栽培方法以及樹體形態(tài)等方面都存在很大差異。其中，最顯著的差異是對主要病蟲害具有極強的抗性，尤其是對葡萄第一大病害霜霉病免疫。

世界范圍內(nèi)有多種葡萄病蟲害，而主栽葡萄品種抗性差是制約葡萄產(chǎn)業(yè)健康快速發(fā)展的關(guān)鍵[6]。早在19世紀，葡萄根瘤蚜就曾經(jīng)對歐洲的葡萄產(chǎn)業(yè)造成毀滅性打擊。而在中國，濕潤多雨的南方產(chǎn)區(qū)以及部分采收前多雨的北方產(chǎn)區(qū)，葡萄霜霉病會嚴重危害葡萄果實的葉片與果實，造成大量減產(chǎn)[7]。而隨著大棚栽培的推廣，許多產(chǎn)區(qū)又受到葡萄白粉病的侵害[8]。而為了抑制這些病害，就需要大量施用化學農(nóng)藥，這不僅會對土壤和地下水造成長久的污染，同時也導致了病原菌耐藥性的增強，最終導致農(nóng)藥的過量噴施或者失效[9]。利用葡萄中已有的抗性種質(zhì)，培育抗病蟲害的葡萄品種，可以從根源上減少病蟲害的發(fā)生。圓葉葡萄對根瘤蚜、劍形線蟲等多種蟲害，均對霜霉病、白粉病、黑痘病、皮爾斯病等多種病害具有高度抗性甚至完全免疫[10]。除了病蟲害等生物脅迫，圓葉葡萄具有較厚的果皮，果實內(nèi)含有多種酚類物質(zhì)，因此對于高溫高濕、紫外輻射等逆境也具有優(yōu)良抗性[11]。這些特質(zhì)表明了圓葉葡萄是不可多得的抗性種質(zhì)來源，不僅可以在原本不適宜種植的地區(qū)進行推廣，創(chuàng)造經(jīng)濟價值，還暗示著圓葉葡萄品種中蘊含著許多抗病基因可以挖掘和利用。本文將從圓葉葡萄抗性出發(fā)，對其抗性種質(zhì)挖掘、研究方法以及利用推廣等方面進行綜述，以期為圓葉葡萄抗性資源的挖掘利用提供一定的參考。

表1 圓葉葡萄與真葡萄的病蟲害抗性對比Table 1 Comparison of disease and pest resistance between Muscadine and Vitis

1 圓葉葡萄抗病種質(zhì)挖掘

1.1 抗霜霉病

葡萄霜霉?。―owny mildew）起源于美國東北部，由葡萄霜霉菌[Plasmopara viticola(Berk.&Curtis.) Berl et de Toni]引起。在19世紀時，歐洲為了抵御根瘤蚜的泛濫，從美國引進了大量抗根瘤蚜的葡萄品種作為砧木，而葡萄霜霉菌也借此傳向歐洲并廣泛傳播。截止目前，世界各地的葡萄產(chǎn)區(qū)均有葡萄霜霉菌的報道，是公認的第一大病害。圓葉葡萄對霜霉病免疫，但是其免疫機制尚不明確。

2003年，Merdinoglu等人將圓葉葡萄與幾個歐亞種葡萄雜交，并在回交兩代后獲得了具有圓葉葡萄背景的139株BC2回交群體群體，使用RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）以及SSR（Simple Sequence Repeat）標記，利用區(qū)間作圖法在12號染色體10 Mbp處定位到了第一個抗葡萄霜霉病的數(shù)量性狀位點（Quantitative Trait Locus，QTL）。該位點解釋了73%的觀測變異率和83%的遺傳變異率，并將其命名為Rpv1[12]；之后Feechan等人又將其精確定位并挖掘到主效基因，將其命名為MrRPV1[13]。隨后的2006年，Wiedemann-Merdinoglu等人利用具有圓葉葡萄背景的株系‘8624’作為父本，歐亞種葡萄‘赤霞珠’作為母本，在18號染色體上定位到另一個抗霜霉病位點Rpv2[14]。

近年來，隨著研究的深入，圓葉葡萄抗病的作用機制也在逐漸被了解。2012年，Yu等人的研究發(fā)現(xiàn)，圓葉葡萄在受到霜霉菌侵染時會形成胼胝質(zhì)沉淀，并且在感染初期就抑制游動孢子的萌發(fā)，從而起到阻礙霜霉菌侵染繁殖的目的[15]。王超霞對抗病圓葉葡萄品種‘Noble’的研究表明，白藜蘆醇及其衍生物的積累模式、相關(guān)基因的表達模式受到霜霉菌侵染的誘導，并在葡萄抗病過程中發(fā)揮廣譜的抗性作用[16]。

1.2 抗白粉病

葡萄白粉?。≒owdery mildew）由葡萄鉤絲殼菌[Uncinula necator(Schw.) Burr.] 引起，主要侵害葉片、新梢和果實等幼嫩部位。感染時，受侵染的部位覆蓋白色粉狀物，嚴重時可導致侵染部位萎縮、枯萎。葡萄白粉菌在干燥、溫暖的條件下可以迅速傳播，難以徹底根除。

研究人員陸續(xù)從圓葉葡萄品種及其雜交后代上定位到諸多與抗葡萄白粉病相關(guān)的QTLs，如從具有圓葉葡萄背景的單株VRH3082-1-42的12號染色體上定位到Run1[13,17]，從Magnolia和Trayshed的18號染色體上定位到Run2[18]，以及Regale的14號染色體上定位到Ren5位點[19]。有趣的是，Rpv1和Run1被定位到同一個位點[12-13,20]。Rubio對于抗蟲QTL的定位研究中也發(fā)現(xiàn)，有些抗劍形線蟲QTL位點附近也包含其他抗病QTL，例如Rpv3緊密連鎖的一個標記與XiR4緊密連鎖[21]。這表明，在進化的過程中，與抗性相關(guān)的基因可能會有成簇聚集、共同進化的現(xiàn)象出現(xiàn)。

1.3 抗黑痘病

葡萄黑痘?。⊿pot anthracnose）由葡萄痂囊腔菌[Sinoe ampelina(de Bary) Shear] 引起，多發(fā)于4—6月雨水較多的季節(jié)。這種病菌可以侵染葡萄的果實、葉片、卷須和葉柄，癥狀通常表現(xiàn)為許多圓形斑點，這些斑點擴大后變成凹陷并產(chǎn)生圓形邊緣的病變，具有非常大的破壞性。

此前人們認為，所有的圓葉葡萄都對葡萄黑痘病具有抗性，而Louime等人證實圓葉葡萄黑痘病抗性具有多態(tài)性，對51個圓葉葡萄品種接種黑痘病致病菌并評估其抗病性，其中，‘Noble’‘Fry’‘Regale’等12個品種對黑痘病具有極強抗性。深入研究發(fā)現(xiàn)，查爾酮合酶、二苯乙烯合酶等關(guān)鍵酶合成基因只在抗性品種中表達，這表明這些基因可能是圓葉葡萄抗黑痘病的主效功能基因[22]。

1.4 抗皮爾斯病

葡萄皮爾斯病（Pierce's disease）是葡萄主要的細菌病害，其致病菌為革蘭氏陰性細菌Xylella fastidiosa。葡萄感染皮爾斯病后，葉片從邊緣處出現(xiàn)不規(guī)則形狀的干枯病斑，且病斑呈現(xiàn)有層次的波紋狀，引起葡萄葉片大面積干枯，嚴重影響正常的光合作用，導致植株生長衰弱，通常只能存活幾年，危害葡萄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[23-24]。目前，該病害在美洲地區(qū)較為嚴重。

我國目前種植的鮮食和釀酒葡萄主要為歐亞種，普遍易感皮爾斯病，而1968年就已經(jīng)有研究證實圓葉葡萄對皮爾斯病具有抗性[25]。Krivanek和Walker利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測接種在不同葡萄品種上Xylella fastidiosa的數(shù)量，證實圓葉葡萄具有皮爾斯病抗性[26]。Ruel等人通過對多個栽培種和野生種的抗性水平進行定量接菌評價，進一步證實，與歐亞種和美洲種等葡萄相比，圓葉葡萄對皮爾斯病抗性更強[27]。且圓葉葡萄對皮爾斯病的抗性已經(jīng)被人們加以利用，作為育種親本培育具有抗性的品種[28]。

1.5 其他病害

圓葉葡萄除對上述病害具有極強的抗性之外，對于根腐病、環(huán)帶狀葉斑病、頂枯病等多種病害高抗或免疫，但這些病害的相關(guān)抗性機理還有待進一步研究[10-11]。

2 圓葉葡萄抗蟲種質(zhì)挖掘

2.1 抗根瘤蚜

19世紀，葡萄根瘤蚜（Phylloxera,Daktulosphaira vitifoliae）的泛濫對歐洲葡萄產(chǎn)業(yè)造成了毀滅性的打擊。法國在1868—1877年約有29萬 hm2的葡萄園被根瘤蚜摧毀[29-30]。近期，中國多地也發(fā)現(xiàn)了葡萄根瘤蚜的蹤跡[31]?？梢哉f，根瘤蚜一直以來都是葡萄產(chǎn)業(yè)的極大威脅，且從未被根治。

圓葉葡萄對根瘤蚜具有極強抗性，也一直被作為抗蟲親本進行育種[32]。Rubio等人利用具有圓葉葡萄背景，且對病蟲害具有抗性的單株VRH8771進行定位，在7號染色體上挖掘到了一個主效抗根瘤蚜位點RDV6。該位點可解釋70%以上的表型變異率，同時在3號和10號染色體上分別定位到抗根瘤蚜位點RDV7和RDV8。這些位點的發(fā)掘為圓葉葡萄抗根瘤蚜種質(zhì)的利用奠定了非常好的基礎(chǔ)[21]。

2.2 抗劍形線蟲

葡萄劍形線蟲（Dagger nematode,Xiphinema index）是葡萄上一種常見的蟲害，并且是葡萄扇葉病毒（Grapevine fanleaf virus,GFLV）等的傳播媒介，而該病毒是葡萄扇葉病的病原體[33]。受劍形線蟲侵染的植株生長衰弱，新梢短，嚴重時完全喪失結(jié)果能力。目前最為常見的是美洲劍形線蟲和標準劍形線蟲，而湖南劍形線蟲于1992年在我國被發(fā)現(xiàn)，但相關(guān)研究還比較少[34]。

Rubio等在具有圓葉葡萄背景的劍形線蟲抗性單株VRH8771的9號、10號和18號染色體上各定位到一個抗劍形線蟲的位點，分別命名為XiR2、XiR3和XiR4[21]。這從遺傳層面表明圓葉葡萄具有抗劍形線蟲的基因。

2.3 抗根結(jié)線蟲

葡萄根結(jié)線蟲（Root-knot nematode）是葡萄上另一種常見的蟲害，在中國危害最為嚴重的是南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）。根結(jié)線蟲以幼蟲侵入葡萄幼嫩的根尖端組織，在吸收根或生長根上形成根結(jié)，侵染嚴重時根系幾乎無吸收根。在地上部，受害植株葉片產(chǎn)生圓形病斑，并且隨時間由黃色變?yōu)榛野咨?，外圈有紫褐色暈圈并穿孔，嚴重時造成葉片枯萎掉落，葡萄植株生長緩慢且衰弱，產(chǎn)量低。

圓葉葡萄對于包括根結(jié)線蟲在內(nèi)的多種病蟲害均有優(yōu)異的抗性甚至完全免疫。2008年Riza等人的文章中就提及圓葉葡萄是抗根結(jié)線蟲的重要種質(zhì)來源[35]，而2015年Li等人的研究證實，圓葉葡萄葉片提取物能有效殺死根結(jié)線蟲。這從產(chǎn)物層面揭示了圓葉葡萄或許是通過生成具有殺蟲功能的代謝物來實現(xiàn)抗根結(jié)線蟲的作用[36]。

3 圓葉葡萄抗性種質(zhì)利用

由于圓葉葡萄具有豐富的抗性種質(zhì)資源，因此利用圓葉葡萄優(yōu)質(zhì)種質(zhì)培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的葡萄新品種一直是育種家的目標。育種家們已經(jīng)利用雜交育種的方式，篩選并培育出許多新的圓葉葡萄品種。而歐亞種葡萄由于出色的釀酒與鮮食品質(zhì)被人們廣泛接受，但卻飽受病蟲害的危害，因此如何利用圓葉葡萄的抗性種質(zhì)改良已有的歐亞種葡萄品種也成為了現(xiàn)代重要的育種手段。

3.1 圓葉葡萄抗性育種技術(shù)進展

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，多種分子標記技術(shù)被用于構(gòu)建遺傳圖譜、定位抗性相關(guān)QTL及相關(guān)基因。1995年Lodhi等人利用RAPD和RFLP標記，第一次構(gòu)建了葡萄雜交群體的遺傳圖譜[37]。2008年Summaira等人首次利用簡單重復序列標記（SSR）對57份葡萄材料（其中39份圓葉葡萄）進行了鑒定，最終發(fā)現(xiàn)圓葉葡萄品種中出現(xiàn)了88個獨特的等位基因，這些基因沒有在此前包含600多個歐亞種葡萄品種的數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)過[35]。這也意味著圓葉葡萄和歐亞種葡萄巨大的性狀差異與其基因差異密切相關(guān)。此后，圓葉葡萄抗性基因及其機制也隨著更多的研究逐漸被揭曉。

現(xiàn)代分子遺傳學已經(jīng)形成了一套通過“構(gòu)建雜交群體-繪制遺傳圖譜-關(guān)聯(lián)表型鑒定-QTL定位-圖位克隆”的方法，用來定位可能含有目的基因的染色體位點，挖掘主效基因[38]。在不同的研究過程中，雖然研究方法不盡相同，但是其基本原理相似。首先選擇具有表型差異的葡萄品種作為親本并構(gòu)建性狀分離的雜交/回交群體，隨后提取DNA并構(gòu)建其遺傳圖譜；根據(jù)遺傳圖譜以及表型進行連鎖分析，確定出與表型緊密連鎖的分子標記；此后通過不斷的雜交/回交，增加交換事件頻率或增大標記密度等方法，逐漸縮短定位到的QTL區(qū)段。當包含有抗性位點的區(qū)段足夠小時，可以通過構(gòu)建YAC（Yeast Artificial Chromosome）文庫或者BAC（Bacterial Artificial Chromosome）文庫的方式，篩選出所要的主效基因。

盡管利用圓葉葡萄與歐亞種進行雜交的研究已超過一個世紀，然而圓葉葡萄含有20對染色體，真葡萄含有19對染色體，染色體數(shù)目的差異導致了減數(shù)分裂時基因組之間的不完全同源性[39]，因此圓葉葡萄與真葡萄雜交后結(jié)實率低，這導致了難以構(gòu)建足夠數(shù)量的子代群體用以進行遺傳分析。而得到的少量雜交種子也多為39條染色體的不育子代，使得雜交工作難以繼續(xù)推進。然而研究人員也有成功得到圓葉葡萄與真葡萄可育雜交后代的例子，1986年法國研究人員在進行白粉病抗性育種時，培育出了‘NC6-15’等可育的圓葉葡萄與真葡萄的雜交后代[20,35,40]。這項工作為此后利用雜交手段挖掘抗性種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

組織培養(yǎng)技術(shù)也被應用于圓葉葡萄及抗性育種中，為了克服葡萄遠緣雜交不親和這一難題，研究人員利用原生質(zhì)體融合以及胚挽救技術(shù)以獲得圓葉葡萄與真葡萄雜交后代。前人已有報道圓葉葡萄原生質(zhì)體的分離以及培養(yǎng)條件[41]，并且已有用胚挽救技術(shù)獲得歐亞種葡萄與圓葉葡萄雜種抗病無核F1代的實例[42]。然而近些年進行的抗性QTL定位工作多數(shù)都利用歐亞種葡萄、河岸葡萄（V.riparia）、沙地葡萄（V.rupestris）、美洲葡萄（V.labrusca）及其種間雜種進行研究，而在圓葉葡萄上進行的研究逐漸變少[43]。

3.2 圓葉葡萄抗性種質(zhì)利用

由于圓葉葡萄具有多種優(yōu)異的抗性，因此培育品質(zhì)優(yōu)異的圓葉葡萄，推廣種植圓葉葡萄品種就是最直接的抗性資源利用方式[44]。而且圓葉葡萄本身香氣濃郁，還具有很多生物活性物質(zhì)如多種糖類、花色苷、白藜蘆醇等，這些物質(zhì)對人體健康十分有益[45-47]，這些優(yōu)良特性使得圓葉葡萄推廣具有可行性。在上世紀70年代，‘Carlos’和‘Noble’被育出，這兩個品種都具有較好的抗病性。同時由于其具有兩性花和較強的適應性，其果實產(chǎn)量也較高（15～25 t/hm2），直到現(xiàn)在，這兩個品種都是全世界種植范圍最廣的用于釀酒的圓葉葡萄品種。而且近些年來新發(fā)布的品種已經(jīng)能夠?qū)尚曰ㄅc較大的果實結(jié)合起來，以適應人們對于鮮食葡萄的需求，有些鮮食圓葉葡萄品種單個果實甚至能夠達到15 g[48]。而單雌花的品種由于產(chǎn)量較低且不規(guī)則，逐漸被淘汰[49]。

圓葉葡萄進入中國的時間較晚。我國南方地區(qū)氣候濕潤多雨，傳統(tǒng)的歐亞種鮮食、釀酒葡萄在此環(huán)境下容易爆發(fā)嚴重的病蟲害。而圓葉葡萄對病蟲害抗性高，適應性強，且加工品質(zhì)優(yōu)良，能夠彌補傳統(tǒng)主栽品種在南方地區(qū)表現(xiàn)出的不足。盧江等人于2006年將圓葉葡萄引入中國，當前已有優(yōu)良的圓葉葡萄品種20余個，其中包括鮮食品種、釀酒（制汁）專用品種，以及釀酒鮮食兼用品種。在推廣方面，已有多個品種推廣定植于廣西、云南、浙江及福建等地[50-51]，而其中有5個品種（Noble、Carlos、Fry、Alachua、Granny Val）在廣西、浙江等地區(qū)可以實現(xiàn)一年兩熟[52-54]。隨著圓葉葡萄在中國的試種成熟以及推廣，對于不同圓葉葡萄品種的栽培管理技術(shù)的研究也正在開展[55]，相關(guān)的圓葉葡萄產(chǎn)品也正在逐步開發(fā)與完善。基于圓葉葡萄優(yōu)異的病蟲害抗性，葡萄抗性QTL以及主效抗性基因的挖掘工作也在陸續(xù)開展。

4 展望

圓葉葡萄由于其具有的特殊品質(zhì)、遺傳特征，成為了葡萄這一大類作物中最為特殊的存在。人類已經(jīng)開發(fā)、利用圓葉葡萄數(shù)百年，起初將其作為裝飾材料或者抗性砧木使用，而隨著育種技術(shù)以及分子技術(shù)的發(fā)展，圓葉葡萄具有的優(yōu)異抗性也逐漸被人們揭曉并利用，當前已成為具備鮮食、釀酒、制干、制汁、制醬以及抗性育種等價值的重要經(jīng)濟作物。

未來應加大對圓葉葡萄抗性種質(zhì)的利用，逐步挖掘圓葉葡萄具有的多種抗性基因，并通過分子生物學、分子遺傳學等手段將其導入現(xiàn)有的優(yōu)秀歐亞種栽培品種中，改良已有的葡萄品種或培育具有多種抗性的歐亞種葡萄。這樣能最大程度的保留現(xiàn)有歐亞種葡萄的風味特征，同時提高葡萄抗病性，減少化肥、農(nóng)藥的使用，減少污染并提升現(xiàn)有葡萄產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。

當前圓葉葡萄的抗性育種還有許多難點有待解決。（1）雖然像霜霉病、白粉病等病害的抗性位點已經(jīng)得到了較為充分的研究，但是還有許多圓葉葡萄抵抗其他病害的抗性位點缺少研究，有待挖掘；（2）盡管人們一直認為借助抗性基因?qū)崿F(xiàn)病蟲害抗性比依賴農(nóng)藥控制病蟲害更穩(wěn)定，但是已經(jīng)出現(xiàn)了抗性位點對霜霉菌抗性失效的研究實例[56]，因此在進行抗性育種時也需要盡可能的進行多種質(zhì)聚合育種，使同一單株中具有多個抗性位點。這樣才能夠使得植株的抗性更持久；（3）雖然真葡萄屬中許多葡萄品種已經(jīng)被證實對許多病蟲害表現(xiàn)出抗性，且已定位出抗性基因位點，但是如果能夠利用親緣關(guān)系更遠的圓葉葡萄的豐富抗性資源，實現(xiàn)多種抗性聚合，則能夠提前避免未來可能出現(xiàn)的病蟲害傳播，更好地實現(xiàn)對病蟲害的防范；（4）當前利用抗性種質(zhì)的技術(shù)手段主要為雜交育種，育種周期較長，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以通過將已發(fā)現(xiàn)的抗性基因直接轉(zhuǎn)入到易感品種的基因組中，使得易感品種攜帶有新的抗性，更快更有效的利用抗性種質(zhì)，縮短育種周期。

圓葉葡萄本身兼具高產(chǎn)、易栽培管理、易機械化、附加值高等特點，其果實富含的多種多酚類物質(zhì)如白藜蘆醇、鞣花酸等具有優(yōu)秀的抗氧化、抗癌作用，對人體健康大有裨益，而且具有其他葡萄品種沒有的特殊香氣，因此改良和推廣圓葉葡萄既能給農(nóng)戶帶來豐厚的經(jīng)濟價值，又能滿足人們對于健康飲食的追求，具有優(yōu)良的前景。圓葉葡萄未來的發(fā)展也將圍繞著改良現(xiàn)有葡萄品種以及培育新的圓葉葡萄品種這兩方面來進行，這對研究人員、育種家等提出了新的挑戰(zhàn)。