多西他賽聯(lián)合胸腺肽α1對(duì)大鼠乳腺癌免疫微環(huán)境中Treg數(shù)量的影響及其機(jī)制研究

曹愛玲，曹 喆，周 劍

咸寧市中心醫(yī)院/湖北省科技學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤科，湖北 咸寧 437000

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，目前，中國乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的生命健康［1］。乳腺癌常規(guī)的治療手段包括手術(shù)、放療、化療及內(nèi)分泌治療等。隨著治療手段的進(jìn)步和女性健康意識(shí)的增強(qiáng)，乳腺癌的死亡率基本保持平穩(wěn)［2］，但乳腺癌類型中的三陰性乳腺癌仍是臨床治療的難題，其預(yù)后較差，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高，無法有效控制病情［3］。因此，尋求一種新型、有效、安全的治療方法對(duì)乳腺癌患者有重要的臨床意義。近年來，腫瘤的免疫治療成為研究熱點(diǎn)。臨床研究［4-5］顯示，多種惡性腫瘤（如乳腺癌、胃癌等）患者體內(nèi)存在免疫失衡，表現(xiàn)為免疫負(fù)性因子調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）數(shù)量異常升高，提示Treg在腫瘤免疫中有重要作用，可能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，并抑制腫瘤特異性免疫。多西他賽（docetaxel，DCT）是第二代紫杉烷類化療藥物，對(duì)于乳腺癌治療的臨床效果較好［6］。胸腺肽α1（thymosin α1，Tα1）是一種免疫增強(qiáng)劑，可誘導(dǎo)T細(xì)胞的發(fā)育和成熟，增強(qiáng)患者的免疫功能［7］。宋曉丹等［8］研究顯示，將免疫調(diào)節(jié)劑烏司他丁與DCT聯(lián)用，可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中Treg數(shù)量，抑制小鼠乳腺癌的生長。但DCT聯(lián)合Tα1用于乳腺癌的報(bào)道較少，本研究旨在探究DCT聯(lián)合Tα1對(duì)大鼠乳腺癌免疫微環(huán)境Treg數(shù)量的影響及其相關(guān)機(jī)制，為乳腺癌的臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和動(dòng)物

SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞株購自美國ScienCell公司。無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)SD大鼠由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2019-0010］，6～8周齡，雌性，體重180～220 g，常規(guī)飼養(yǎng)1周，使其適應(yīng)環(huán)境。

1.2 試劑和儀器

DCT注射液購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（國藥準(zhǔn)字H20080366，規(guī)格：1.5 mL∶60 mg），胸腺肽腸溶片購自吉林康乃爾藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字H20065576，規(guī)格：15 mg×12片），原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒購自瑞士Roche公司（批號(hào)11772465001），流式細(xì)胞術(shù)用試劑購自美國Beckman Coulter公司，白介素10（interleukin 10，IL-10，批號(hào)KE1435）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β，批號(hào)KE1443）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自美國Immonoway公司，程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1，批號(hào)為018L3521）兔單克隆抗體、程序性死亡受體-1配體（programmed death ligand 1，PD-L1，批號(hào)為018L3018）兔單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.3 分組、造模與干預(yù)

將60只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、DCT組（劑量為10 mg/kg）、Tα1組（劑量為0.8 mg/kg）及3個(gè)DCT+Tα1組（DCT劑量為10 mg/kg，Tα1劑量分別為0.2、0.4、0.8 mg/kg），每組10只。以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SHZ-88細(xì)胞，收集生長狀態(tài)良好的SHZ-88細(xì)胞，待細(xì)胞密集成片時(shí)加入胰蛋白酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成2×107個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，于大鼠第4對(duì)乳腺處皮下注射50 μL SHZ-88細(xì)胞懸液，構(gòu)建乳腺癌大鼠模型［9］，對(duì)照組以等量0.9%NaCl溶液替代。觀察并記錄大鼠一般情況和腫瘤生長情況，10 d左右可在注射部位觸及腫塊，經(jīng)H-E染色判斷是否為腫瘤細(xì)胞。成瘤后，DCT組、Tα1組及DCT+Tα1組分別腹腔注射相應(yīng)劑量的DCT、Tα1，給藥周期均為20 d，1次/d；對(duì)照組和模型組以0.9%NaCl溶液替代。

1.4 樣本采集與處理

干預(yù)結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，剝離腫瘤組織，凍存于液氮罐中備用。腫瘤生長抑制率=（模型組腫瘤體積－治療組腫瘤體積）/模型組腫瘤體積×100%。

1.4.1 TUNEL染色

將腫瘤組織固定于4%甲醛溶液中過夜，石蠟包埋后切片，參照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作，在光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況并計(jì)數(shù)，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

提取腫瘤組織中的淋巴細(xì)胞，分管作抗體標(biāo)記，加入染色緩沖液洗滌細(xì)胞后再加入固定劑和穿膜劑，避光條件下溫育30 min；加入穿膜緩沖液洗滌后，重懸于染色緩沖液中，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，以CD4＋CD25＋Foxp3＋細(xì)胞/CD4＋CD25＋細(xì)胞反映Treg數(shù)量。

1.4.3 ELISA檢測(cè)

將腫瘤組織冰上勻漿，以10000 r/min離心10 min，分離上清液，參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)腫瘤組織中IL-10、TGF-β的表達(dá)。

1.4.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

提取腫瘤組織中的總蛋白，取60 μg變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；β-actin、PD-1、PD-L1一抗以1∶1000比例稀釋，4 ℃下反應(yīng)過夜；第2天，HRP標(biāo)記二抗以1∶8000比例稀釋，37 ℃下反應(yīng)40 min；最后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）成像，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算PD-1及PD-L1的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采取SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)乳腺癌大鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

H-E染色顯示，所取腫塊組織中有橢圓形或圓形癌細(xì)胞，大小不一，染色質(zhì)、核仁著色深，可見病理性核分裂象，細(xì)胞排列紊亂，呈彌漫性片狀實(shí)性分布（圖1），表明該組織為癌變組織，乳腺癌大鼠模型復(fù)制成功。與模型組相比，其他給藥組細(xì)胞增大，腫瘤細(xì)胞開始?jí)乃?，且伴隨有淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞浸潤，以DCT+0.8 mg/kg Tα1組腫瘤細(xì)胞抑制效果最顯著。

圖1 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)乳腺癌大鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effects of DCT combined with Tα1 on morphology of tumor tissues in breast cancer rats

2.2 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)乳腺癌大鼠腫瘤生長的影響

藥物干預(yù)組均可顯著抑制腫瘤的生長，DCT+0.8 mg/kg Tα1組抑制效果最顯著，顯著高于DCT組和0.8 mg/kg Tα1組（P＜0.05，圖2、3）。TUNEL染色結(jié)果見圖4，各組腫瘤細(xì)胞凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型組相比，藥物處理組均可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡（P＜0.05），其中DCT+0.8 mg/kg Tα1組細(xì)胞凋亡率顯著高于DCT組和0.8 mg/kg Tα1組（P＜0.05）。

圖2 各組乳腺癌大鼠剝離腫瘤組織Fig.2 The stripped tumor tissues of breast cancer rats in each group

圖3 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)乳腺癌大鼠腫瘤體積的影響Fig.3 Effects of DCT combined with Tα1 on tumor volume of breast cancer rats

圖4 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)乳腺癌大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of DCT combined with Tα1 on tumor cells apoptosis in breast cancer rats

2.3 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)腫瘤組織中Treg數(shù)量的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，各組腫瘤組織中CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型組相比，藥物干預(yù)組均可顯著下調(diào)CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg數(shù)量（P＜0.05），其中DCT+0.8 mg/kg Tα1組下調(diào)作用最顯著，顯著低于DCT組和0.8 mg/kg Tα1組（P＜0.05，圖5）。

圖5 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)腫瘤組織中Treg數(shù)量的影響Fig.5 Effects of DCT combined with Tα1 on number of Treg in tumor tissues

2.4 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)腫瘤組織中IL-10、TGF-β水平的影響

與模型組相比，藥物處理組均可顯著下調(diào)IL-10、TGF-β水平（P＜0.05），其中DCT+0.8 mg/kg Tα1組IL-10、TGF-β水平顯著低于DCT組和0.8 mg/kg Tα1組（P＜0.05，圖6）。

圖6 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)腫瘤組織中IL-10和TGF-β水平的影響Fig.6 Effects of DCT combined with Tα1 on levels of IL-10 and TGF-β in tumor tissues

2.5 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)腫瘤組織中PD-1、PD-L1表達(dá)的影響

各組大鼠腫瘤組織中PD-1、PD-L1表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型組相比，藥物干預(yù)組均可顯著下調(diào)PD-1、PD-L1表達(dá)（P＜0.05），其中DCT+0.8 mg/kg Tα1組下調(diào)作用最顯著（圖7、8）。

圖7 DCT聯(lián)合Tα1對(duì)腫瘤組織中PD-1和PD-L1表達(dá)的影響Fig.7 Effects of DCT combined with Tα1 on the expressions of PD-1 and PD-L1 in tumor tissues

圖8 各組表達(dá)PD-1的Treg數(shù)量的比較Fig.8 Comparison of the number of Treg with PD-1 expression among all groups

3 討 論

本研究通過給雌性SD大鼠接種大鼠乳腺癌細(xì)胞系SHZ-88，建立移植瘤模型，10 d左右注射部位可觸及腫塊組織，H-E染色結(jié)果顯示為癌組織，提示乳腺癌大鼠模型復(fù)制成功。Tα1可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)水平對(duì)機(jī)體免疫功能產(chǎn)生影響，臨床已應(yīng)用于癌癥、感染、免疫缺陷等疾病的治療。Vladimirova等［10］研究顯示，應(yīng)用Tα1輔助治療晚期乳腺癌患者的效果較好，可抑制腫瘤血管的生成。Guo等［11］研究指出，Tα1可通過PTEN介導(dǎo)PI3K/AKT/mTOR通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，Tα1組可控制大鼠腫瘤組織體積，抑制其生長，同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，與Wang等［12］的研究結(jié)果相似，提示Tα1可能通過解除免疫抑制狀態(tài)，增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫力。而DCT聯(lián)合Tα1對(duì)腫瘤的抑制效果更好，提示聯(lián)用Tα1可增強(qiáng)DCT的抗腫瘤效果，Tα1可以改善免疫功能，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的抑制作用。

腫瘤微環(huán)境內(nèi)多種因素參與調(diào)控腫瘤與免疫系統(tǒng)的相互作用，如局部效應(yīng)細(xì)胞的功能障礙、Treg和T細(xì)胞代謝活性的負(fù)調(diào)節(jié)等。最近研究［13］指出，腫瘤微環(huán)境的免疫抑制可能削弱免疫治療的效果。因此，正確調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)可能成為腫瘤治療的新方向。Treg是一類負(fù)性免疫調(diào)控作用的T細(xì)胞，可激活TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子的釋放，活化和募集更多的Treg，抑制抗腫瘤的效應(yīng)T細(xì)胞［14］。大量數(shù)據(jù)表明，TGF-β、IL-10可以通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能并抑制免疫功能等促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，參與腫瘤的逃逸和轉(zhuǎn)移過程［15-16］。本研究結(jié)果顯示，DCT聯(lián)合Tα1后，CD25＋Foxp3＋Treg數(shù)量、IL-10及TGF-β水平顯著下降，提示DCT聯(lián)合Tα1可能通過降低Treg浸潤，減少TGF-β、IL-10的分泌，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫能力。

近年來有研究［17］指出，PD-1/PD-L1信號(hào)通路可介導(dǎo)負(fù)性免疫調(diào)節(jié)通路，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。PD-1分布于Treg表面，是Treg發(fā)揮免疫抑制作用的重要分子；而PD-L1可誘導(dǎo)Treg發(fā)育和成熟，與TGF-β有協(xié)同作用［18］。本研究結(jié)果顯示，DCT聯(lián)合Tα1可顯著下調(diào)腫瘤組織中PD-1、PD-L1表達(dá)，提示DCT聯(lián)合Tα1可能通過抑制PD-1/PD-L1信號(hào)通路，降低Treg浸潤，從而減輕腫瘤免疫抑制狀態(tài)，抑制腫瘤的生長。

綜上所述，本研究報(bào)道了DCT聯(lián)合Tα1對(duì)乳腺癌大鼠腫瘤組織的抑制作用，其中DCT+0.8 mg/kg Tα1效果最佳，初步分析其調(diào)控機(jī)制可能是通過抑制PD-1/PD-L1信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，不僅為臨床DCT和Tα1的聯(lián)合應(yīng)用提供了全新的理論依據(jù)，同時(shí)也為乳腺癌帶來新的治療思路。