苯丙氨酸-肌酐模型反應體系中甘蔗糖蜜酚酸單體對PhIP的抑制作用

于迪，龍娟，黃媛，黃嘉佳，趙立春，孔繁磊

（廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧 530200）

雜環(huán)胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs），是在200℃以上及長時間烹調加工肉類食物過程中產生的有機胺化合物。研究[1]表明，大多數(shù)的雜環(huán)胺都具有致癌和致突變作用，PhIP（2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶）是已知的致癌、致突變性的雜環(huán)胺類化合物中非常重要的一種，屬吡啶類雜環(huán)胺。由于PhIP 的致癌效果，國際癌癥研究中心將PhIP 作為導致人類致癌因素列入國家毒理學計劃中，屬于2B 級類致癌物[2]。

雜環(huán)胺的形成主要通過自由基途徑和美拉德反應兩種方式，而雜環(huán)胺的控制手段有多種多樣，如控制加工溫度和時間、改變加工方式、控制前體物質的含量、添加保水性物質及添加外源活性成分（如黃酮類物質、酚酸類物質）等。目前通過添加外源活性成分來抑制雜環(huán)胺成為國內外研究的熱點。如Ruan 等[3]研究中表明添加維生素E 可有效抑制雜環(huán)胺，其原理是當肉制品發(fā)生美拉德反應時，維生素E 作為自由基清除劑在高溫烹調過程中抑制雜環(huán)胺的形成；鄢嫣等[4]研究中表明當大豆分離蛋白達到10.0%的添加量時，對雜環(huán)胺的形成有抑制作用，抑制率達到85.7%；曾茂茂等[5]研究表明添加香辛料（如百里香、香薄荷等提取物）可以抑制肉制品中PhIP 的形成，但即使是同一種香辛料提取物，由于作用機制不同，其抑制效果也不同；Wang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)添加酚酸類物質BHA 可以有效抑制雜環(huán)胺，因為酚酸類物質中含有較高的抗氧化劑成分可以作為自由基清除劑來抑制美拉德反應中產生的雜環(huán)胺，但其研究機理還尚未明確。目前，已有研究表明[7]，苯丙氨酸和肌酸酐（肌酐）是PhIP形成的重要前體物質。

甘蔗糖蜜又稱為糖漿，是將甘蔗汁液經過加熱、沉淀、過濾和濃縮等步驟所得到的粘稠液體，蔗糖是其重要成分，還富含有機物、礦物質和酚酸。我國是制糖大國，廣西又是制糖大省，擁有大量的甘蔗產地，若能合理的利用甘蔗糖蜜，可提高其附加值。甘蔗中含有黃酮類物質和多酚類物質，如今對甘蔗生物活性的研究較多，如邱榮其等[8]研究表明，甘蔗制糖過程中的多種原料及制糖終產物廢蜜都具有較高的抗氧化性，趙振剛等[9]發(fā)現(xiàn)甘蔗廢料中含有多酚類物質，有較強的自由基清除能力；于迪等[10]研究發(fā)現(xiàn)糖蜜粗體物中保留有大量的抗氧化活性物質，可抑制雜環(huán)胺的生成。因此，本研究通過糖蜜凈化處理方法得到糖蜜粗提物，確定糖蜜提取物中含有阿魏酸和香草酸，同時研究兩種酚酸在模型反應體系中對PhIP 的抑制作用，為甘蔗糖蜜的綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗糖蜜，廣西崇左糖廠；無水乙醇（分析純），成都市科隆化學品有限公司；甲醇（色譜級），上海吉至生化科技有限公司；沒食子酸標品（分析級），上海源葉生物科技有限公司；H2SO4、丙烯酰胺，廣西南寧辰澤實驗科技有限公司；D101 大孔樹脂、丙氨酸（分析級）、肌酐（分析級），上海麥克林生化科技有限公司；PhIP 標準品（分析級），Toronto Research Chemicals（加拿大）；福林酚，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

752N 型紫外可見光分光光度計、臺式離心機，上海儀電分析儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海煜南儀器有限公司；冷凍干燥機，北京金洋萬達科技有限公司；RE-52AA 型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮儀生化儀器有限公司；Waters 超高液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜儀(UPLC-TQD)，美國Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 甘蔗糖蜜凈化處理

稱取甘蔗糖蜜100 g，用超純水將糖蜜溶液稀釋到600 g，用濃H2SO4將pH 值調至2，水浴100℃條件下，加熱90 min，在酸解后得到的糖蜜溶液中加入250 mg/L 的磷酸作為澄清劑，用Ca(OH)2溶液將pH 值調至7，再加入5 mg/L 的聚丙烯酰胺，在85℃水槽中水浴10 min 進行二次絮凝，將得到的糖蜜膠體溶液用紗布進行過濾，濾液在常溫下4000 r/min 離心10 min，得到上清液，再將上清液進行二次離心，在常溫下2000 r/min 離心5 min，保存上清液；將糖蜜上清液進行5 倍稀釋，再將溶液通過D101 大孔樹脂柱，將上述得到的溶液通過旋蒸和真空冷凍干燥，最終得到甘蔗糖蜜提取物干燥粉末。

1.3.2 糖蜜提取物中多酚的提取及測定

稱取0.0024 g 沒食子酸標品溶于25 mL 水，得到沒食子酸標準溶液。分別吸取標準溶液0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL置于6 個10 mL 的棕色容量瓶中，各加入0.50 mL 福林酚溶液，避光靜置5 min 后再分別加入20%碳酸鈉溶液1.50 mL，用蒸餾水定容到刻度，搖勻后避光靜置30 min。將溶液置于790 nm 處測定其吸光度，以沒食子酸含量為橫坐標，吸光度為縱坐標得到標準曲線。實驗所得的沒食子酸標準曲線如圖1 所示，吸光度值y 與沒食子酸含量x（mg）間的回歸關系為y=111.32x+0.0555，R2=0.9974。

圖1 沒食子酸標準曲線 Fig.1 Gallic acid standard curve

稱取0.0568 g 糖蜜提取物粉末樣品置于50 mL 棕色容量瓶中，用10%甲醇定容至刻度，搖勻，即可得到糖蜜提取物溶液。吸取3.00 mL 上述溶液于25 mL棕色容量瓶中，加入0.50 mL 福林酚溶液，避光靜置5 min，再加入20%碳酸鈉溶液1.50 mL，加入水定容，避光靜置30 min，將溶液放在790 nm 處測定其吸光度，并帶入標準曲線方程中計算甘蔗糖蜜中多酚含量。

1.3.3 甘蔗糖蜜提取物樣品溶液的制作

稱取0.0120 g 糖蜜提取物加入10%甲醇2 mL，使其充分溶解，再用水定容至10 mL 混勻，得到濃度為1.2 mg/mL 的甘蔗糖蜜提取物樣品溶液。

1.3.4 阿魏酸標準品溶液的制備

稱取0.0058 g 阿魏酸標準品溶于3 mL 甲醇，再加入水定容到10 mL，超聲3 min 混勻，得到濃度為0.58 mg/mL 的阿魏酸標準品原溶液。

1.3.5 香草酸標準品溶液的制備

與1.3.4 方法同，得到濃度為0.50 mg/mL 的香草酸標準品原溶液。

1.3.6 模型反應體系建立

分別稱取苯丙氨酸和肌酐標準品0.6 mmol 于25 mL 聚四氟乙烯反應管中，加入10 mL 水，混勻密封后加入實驗室定制的反應釜中，在200℃的烘箱內進行反應3.5 h 后，取出降至室溫，再用0.22 μL 微孔濾膜進行過濾備用。

1.3.7 阿魏酸單體對雜環(huán)胺PhIP 的影響

將前體物質苯丙氨酸和肌酐各0.6 mmol 加入到25 mL 聚四氟乙烯反應管中，取0.58×10-3mg/mL 濃度的阿魏酸溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 分別加入到聚四氟乙烯反應管中，加水定容至10 mL 混勻，在200℃的烘箱內進行反應3.5 h 后，取出降至室溫，用0.22 μm 微孔濾膜進行過濾，將過濾液稀釋至10-6濃度，冷藏備用。

1.3.8 香草酸單體對雜環(huán)胺PhIP 的影響

與1.3.7 方法同，取0.50×10-3mg/mL 濃度的香草酸溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 分別加入到模型反應體系中，加水定容至10 mL 混勻，在200℃的烘箱內進行反應3.5 h 后，取出降至室溫，用0.22 μm微孔濾膜進行過濾，將過濾液稀釋至10-6濃度，冷藏備用。

1.3.9 UPLC-MS 檢測PhIP、肌酐、苯丙氨酸

流速：0.2 mL/min；進樣體積：5 μL；色譜柱：Waters CO RTECS C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；泵：Waters Quaternary Solvent Manager-R；流動相條件：A 相為甲醇，B 相甲酸溶液（甲酸:水=1:1000，V/V）；洗脫梯度：0～2 min，A：0～5%；2～10 min，A：5%～90%；10～14 min，A：90%～5%；電離源：ESI 正離子模式；毛細管溫度：550℃；錐孔電壓：30 V；碎裂碰撞能：30 eV；UPLC-MS，目標母離子：PhIP：m/z=225；肌酐：m/z=114；苯丙氨酸：m/z=166。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

本實驗中，所有數(shù)據(jù)均是重復3 次實驗的平均值，結果數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差，采用Microsoft Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行分析和作圖。

2 結果與討論

2.1 甘蔗糖蜜多酚含量

將甘蔗糖蜜提取物所測得的吸光度帶入方程式，即可得到甘蔗糖蜜提取物中的多酚含量為3.58 mg/g。研究表明[11,12]，多酚類物質具有較高的藥理價值，有抗氧化、抗菌、抗癌、調節(jié)免疫的功效，芒果皮中的多酚含量為10.41～11.52 mg/g，梨全果中的多酚含量為0.27～0.40 mg/g，柑橘總酚含量為0.41～1.69 mg/g，所以，甘蔗糖蜜提取物中的多酚含量相對較高。

2.2 甘蔗糖蜜提取物中酚酸的鑒定

在SIR 負離子掃描模式下，利用UPLC-MS 對阿魏酸和香草酸標準品進行檢測得出SIR 圖及二級離子碎片圖。參照文獻[13]，在負離子掃描模式下，MS/MS碎裂得出母離子：m/z193→134 可初步判定為阿魏酸，MS/MS 碎裂得出母離子：m/z167→89 可初步判定為香草酸。如圖2 所示，在SIR 負離子掃描模式，對糖蜜提取物樣品和阿魏酸標品進行檢測，碎裂碰撞能為30 eV 時，糖蜜樣品中的物質在3.91 min 時出峰，與阿魏酸標準品出峰時間一致，存在質量數(shù)為193 的母離子二級碎片峰；錐孔電壓為30 V 時，出現(xiàn)質量數(shù)為133 的子離子二級碎片峰，響應值為5.45e7，峰型較為明顯，因此可確定此峰所對應的物質為阿魏酸。

圖2 糖蜜提取物中阿魏酸的SIR 圖（a）；阿魏酸標準品SIR 圖（b）；糖蜜提取物中阿魏酸母離子二級碎片圖（c）；糖蜜提取物中阿魏酸子離子二級碎片圖（d）Fig.2 SIR diagram of ferulic acid in molasses extract (a);SIR diagram of ferulic acid standard (b);The second fragment of ferulic acid precursor ion in molasses extract (c);The second fragment of ferulic acid ion in molasses extract (d)

同理，在圖3 中發(fā)現(xiàn)，在SIR 負離子掃描模式，碎裂碰撞能為33 eV 時進行檢測，糖蜜提取物樣品中的物質在3.50 min 時出峰，與香草酸標準品出峰時間一致，存在質量數(shù)為167 的母離子二級碎片峰；錐孔電壓為18 V 時，出現(xiàn)質量數(shù)為89 的子離子二級碎片峰，響應值為2.38 e5，峰型較為明顯，因此可確定此峰所對應的物質為香草酸。

圖3 糖蜜提取物中香草酸的SIR 圖（a）；香草酸標準品SIR 圖（b）；糖蜜提取物中香草酸母離子二級碎片圖（c）；糖蜜提取物中香草酸子離子二級碎片圖（d）Fig.3 SIR image of vanillic acid in molasses extract (a);SIR chart of vanillic acid standard product (b);The second fragment of vanillic acid precursor ion in molasses extract(c);The second fragment of vanillic acid ion in molasses extract(d)

2.3 空白模型反應中PhIP 的鑒定

利用1.3.10的檢測條件對PhIP標準品和空白模型進行檢測，由圖4 可知，在SIR 正離子掃描模式，碎裂碰撞能為30 eV 時進行檢測，空白模型中的物質在3.56 min 時出峰，與PhIP 標準品出峰時間一致，存在質量數(shù)為225 的母離子；錐孔電壓為33 V 時，出現(xiàn)質量數(shù)為210 的子離子，響應值為4.82 e6，峰型較為明顯，參照文獻[14]，在正離子掃描模式下，MS/MS 碎裂m/z225→210 可定性為PhIP，因此，可確定此峰對應的物質是PhIP。通過UPLC-MS 對模型體系進行鑒定時，在SIR 正離子模式下測得m/z216 的峰，出峰時間為4.89 min，響應值為1.11 e8，峰型較為明顯，參照文獻[15]可初步判定為中間產物苯乙醛進一步反應生成的丁間醇醛脫水縮合物，但是否可以確定該物質為丁間醇醛還需進一步研究。

圖4 PhIP 標準品SIR 圖（a）；空白模型中PhIP 的SIR 圖（b）；空白模型中PhIP 母離子二級碎片圖（c）；空白模型中PhIP 子離子二級碎片圖（d）Fig.4 SIR diagram of PhIP standard (a);SIR diagram of PhIP in blank model (b);The second fragment of PhIP precursor ion in the blank model (c);The second fragment of PhIP product ion in the blank model (d)

2.4 模型反應中酚酸單體對PhIP 的抑制作用

將不同濃度梯度的阿魏酸和香草酸單體加入到模型反應中，以空白模型組作為對照，通過UPLC-MS進行檢測，記錄各個酚酸單體在不同濃度下得出的峰面積，即可得出模型反應中苯丙氨酸、肌酐和PhIP的含量變化。

模型反應體系中肌酐、苯丙氨酸和PhIP 隨著阿魏酸標準品濃度的增加所產生的含量變化趨勢如圖5所示，模型反應中肌酐含量的變化呈先下降后上升再 下降的趨勢；苯丙氨酸含量逐漸減小后趨于平緩；PhIP的生成量則逐漸減少后趨于平緩，說明隨著阿魏酸標準溶液濃度的增加，模型反應中PhIP 的生成量逐漸減少，有明顯的抑制作用。

圖5 加入阿魏酸的模型體系中苯丙氨酸（左）、肌酐（左）、及PhIP（右）峰面積變化 Fig.5 Changes in the peak areas of phenylalanine (left),creatinine (left),and PhIP (right) in the model system with ferulic acid

模型反應中肌酐、苯丙氨酸和PhIP 隨著香草酸標準品濃度的增加所產生的含量變化趨勢如圖6 所示；模型反應中肌酐含量的變化呈先下降后上升再下降的趨勢；苯丙氨酸含量逐漸減小后趨于平緩；PhIP 的生成量則逐漸減少后趨于平緩，說明隨著香草酸標準溶液濃度的增加，模型反應中PhIP 的生成量逐漸減少，有明顯的抑制作用。

圖6 加入香草酸的模型體系中苯丙氨酸（左）、肌酐（左）、及PhIP（右）峰面積變化 Fig.6 Changes in the peak areas of phenylalanine (left),creatinine (left),and PhIP (right) in the model system with vanillic acid

利用UPLC-MS對配制好的甘蔗糖蜜提取物樣品溶液進行成分分析鑒定，將得到的質譜圖與酚酸標準品進行比對，得出在糖蜜提取物中含量較高的兩種多酚物質為：阿魏酸和香草酸。阿魏酸與香草酸具有較強的抗氧化性，對過氧化氫、羥自由基、超氧化自由基和過氧化亞硝基的清除效果明顯，使產生自由基的酶受到抑制，還可以使清除自由基的酶增加。

由圖5可知，模型反應中PhIP的生成量隨著阿魏酸標準溶液濃度的升高而降低，當阿魏酸溶液濃度從0到2.33×10-7g/mL時，PhIP的下降量最明顯，對模型反應中PhIP的生成有抑制作用，其抑制率高達66.86%，說明阿魏酸在此濃度范圍內有較強的自由基清除能力，而后PhIP的下降量趨于平緩，總體抑制率為76.67%。當阿魏酸溶液的濃度從1.17×10-7g/mL增加到2.33×10-7g/mL時，肌酐的生成量增加，苯丙氨酸的生成量減少，PhIP的生成量出現(xiàn)明顯的降低。而總體來說，模型反應中肌酐含量變化與阿魏酸標準溶液濃度的變化無明顯的線性關系，苯丙氨酸呈現(xiàn)下降趨勢。由圖6可知，模型反應中PhIP的生成量隨著香草酸標準溶液濃度的升高而降低，與在模型反應中添加阿魏酸時的變化相似，當香草酸溶液濃度從0到2.02×10-7g/mL時，PhIP的下降量最明顯，對模型反應中PhIP的生成有抑制作用，其抑制率高達69.67%，說明香草酸在此濃度范圍內有較強的自由基清除能力，而后PhIP的下降量趨于平緩，總體抑制率為77.43%。而模型反應中肌酐的含量變化與香草酸標準溶液濃度的變化無明顯的線性關系。在相同的物質的量（3×10-5mmol）時，香草酸單體比阿魏酸單體對雜環(huán)胺PhIP的抑制效果更佳。

苯丙氨酸和肌酐作為PhIP的重要前體物質，研究表明[16]，高溫條件下，苯丙氨酸與肌酐反應可生成PhIP，苯丙氨酸首先通過美拉德反應生成Strecker醛-苯乙醛，醛類再與肌酐通過醇醛縮合反應隨后脫水形成縮合物--丁間醇醛。PhIP結構吡啶基團中氮原子主要來源于肌酐的氨基與中間體的含氧基團反應、苯丙氨酸中的氨基和游離氨等。

實驗發(fā)現(xiàn)，模型反應體系中苯丙氨酸和PhIP均出現(xiàn)隨著酚酸含量增加明顯減少的現(xiàn)象，兩種酚酸單體可能通過以下兩種途徑抑制PhIP的形成：①酚酸在一定程度上通過阻斷苯丙氨酸生成苯乙醛。阿魏酸和香草酸在化學結構上均含有羥基和羧基，酚酸中的羧基可以和苯丙氨酸中的氨基脫水形成肽鍵，從而消耗PhIP的前體物質苯丙氨酸，使苯丙氨酸不能有效的轉化成苯乙醛，達到抑制PhIP的形成作用；②酚酸通過捕獲苯乙醛阻止醛類與肌酐縮合形成丁間醇醛。阿魏酸屬于酚類化合物，酚類物質具有清除自由基、淬滅活性炭和螯合金屬的能力，所以阿魏酸與香草酸是通過清除自由基，能很好的清除O2-及·OH來抑制PhIP的形成，從而阻斷了苯乙醛與肌酐進一步反應生成PhIP，使得PhIP的生成量減少。結合本實驗結果，從理論上推測酚酸單體可能會通過以上兩種途徑抑制PhIP的形成，但其具體的抑制機理還有待進一步研究。

3 結論

實驗通過糖蜜凈化處理方法去除糖蜜中的膠體、灰分和重金屬等物質，得到糖蜜粗提物，建立沒食子酸標準曲線，測定糖蜜提取物中多酚含量，發(fā)現(xiàn)多酚含量多達3.58 mg/g。甘蔗糖蜜提取物中富含多種多酚類化合物，其中，存在的酚酸物質有阿魏酸和香草酸，均具有較強的自由基清除能力，對模型反應體系中PhIP 的生成有明顯的抑制作用。當阿魏酸溶液濃度達到2.33×10-7g/mL 時，對PhIP 的抑制效果最佳，總體抑制率為76.67%；當香草酸溶液濃度達到2.02×10-7g/mL 時，對PhIP 的抑制效果最佳，總體抑制率為77.43%。甘蔗糖蜜作為一種能量原料，多用作改善口感的調節(jié)劑，甘蔗糖蜜提取物成分較多且復雜，其含有的多酚類化合物種類較多，若將甘蔗糖蜜作為食品添加劑加入到食品中，可有效降低由于長時間高溫烹調產生PhIP，為后續(xù)對PhIP 抑制物的研究提供了基礎，但其具體抑制機理還有待進一步研究。