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      槲皮素對高脂飲食誘導肥胖小鼠結(jié)腸炎癥的改善作用

      2021-10-09 05:19:06曾鈺鵬盧曉丹李國坤董嘉華陳驍熠蘇立杰
      現(xiàn)代食品科技 2021年9期
      關(guān)鍵詞:槲皮素高脂結(jié)腸

      曾鈺鵬,盧曉丹,李國坤,董嘉華,陳驍熠,蘇立杰

      (廣州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,廣東廣州 511436)

      肥胖是體內(nèi)脂肪積聚過多而導致體重增加的一種代謝紊亂狀態(tài)[1]。肥胖會導致高血壓、糖尿病、非酒精性脂肪肝、結(jié)腸癌等疾病,嚴重威脅人類健康[2]。肥胖和體內(nèi)低程度的慢性炎癥相關(guān)。高脂飲食誘發(fā)的腸道菌群紊亂使革蘭氏陰性菌細胞壁裂解成分脂多糖(LPS)增加,而LPS 作為炎癥觸發(fā)因子與TLR4 受體結(jié)合激活NF-κB 信號通路,促進炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的合成和釋放,從而導致相關(guān)組織產(chǎn)生炎癥狀態(tài)[3,4]。相關(guān)研究表明,高脂肪飲食可誘發(fā)結(jié)腸組織炎癥[5-7]。結(jié)腸組織炎癥會損害腸屏障功能和增加腸道通透性,增加的LPS 進入血液循環(huán),引起體內(nèi)低程度的慢性炎癥,加劇肥胖以及產(chǎn)生胰島素抵抗[8]。長期高脂飲食引起腸道炎癥,增加肥胖和相關(guān)代謝性疾病的風險。因此,探索具有抗炎活性的天然產(chǎn)物以改善或治愈炎癥已成為當前研究與開發(fā)的熱點之一。

      槲皮素(Quercetin)作為膳食中最常見的黃酮類化合物,廣泛存在于蔬菜、水果和茶等食物中,具有抗氧化、抗炎、抗感染和抗腫瘤等多種生物活性作用[9,10]。高脂飲食中添加槲皮素可以改善肥胖,減少脂肪組織巨噬細胞浸潤和炎癥因子的表達,改善高脂引起的脂肪組織炎癥[11,12]。槲皮素可調(diào)節(jié)由高脂飲食誘導的肥胖大鼠的腸道菌群,顯著減低毛螺菌科菌等與肥胖相關(guān)菌科的豐度,增加Akkermansia等與緩解肥胖相關(guān)菌屬的豐度,達到減肥效果[13]。

      綜上所述,高脂飲食所誘導的腸道菌群紊亂可能會導致腸道炎癥,而槲皮素有調(diào)節(jié)腸道菌群和抑制炎癥的作用。針對結(jié)腸炎癥的抑制作用可能是治療肥胖和肥胖相關(guān)代謝紊亂的一種潛在的治療策略。本研究探索槲皮素對高脂飲食誘發(fā)腸道炎癥的改善作用,并探討其可能的作用機制,為深入研究開發(fā)以槲皮素為成分的功能食品提供理論依據(jù)。

      1 材料方法

      1.1 材料與試劑

      槲皮素(98%),西安天豐生物科技股份有限公司;D12450B 低脂飼料(脂肪含量:10 kcal%)、D12451高脂飼料(脂肪含量:45 kcal%),廣東省醫(yī)學實驗動物中心;TLR4 一抗、MyD88 一抗、NF-κB 一抗、IκBα一抗、p-IκBα一抗、TNF-α一抗、IL-6 一抗、IL-1β一抗,美國Affinity Biosciences 公司;無水乙醇、二甲苯、4%多聚甲醛,上海國藥集團化學試劑有限公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒,蘇州艾萊薩生物科技有限公司;Trizol、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒,日本Takara 公司。

      1.2 儀器與設備

      CFX96 型Real-time PCR 儀、PowerPac Basic 型電泳儀、T100 型梯度PCR 儀,美國Bio-Rad 公司;ODYSSEY 型化學發(fā)光儀,美國LI-COR 公司;JJ-12J脫水機、JB-P5 型包埋機、JB-L5 凍臺,武漢俊杰電子有限公司;RM2016 型病理切片機,上海萊卡儀器有限公司;GFL-230 型烤箱,天津市萊波瑞儀器設備有限公司;TSY-B 脫色搖床、MX-F 渦旋混合器、D1008E掌上離心機,Servicebio 公司;XSP-C204 顯微鏡,CIC公司。

      1.3 方法

      1.3.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

      SPF 級健康C57BL/6 雄性小鼠30 只,體重22~25 g,合格證號:NO.44007200049595,許可證號:SCXK(粵)2013-0002,購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心,飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境實驗室,室溫22±2℃,相對濕度50%~70%,清潔安靜,12 h、12 h 明暗周期的照明條件。小鼠飼養(yǎng)期間自由攝食、飲水。小鼠經(jīng)一周的適應性飼養(yǎng)及分組(具體分組見表1)后,開始正式試驗。試驗持續(xù)20 周,期間每日下午以灌胃方式給予槲皮素或生理鹽水,每日稱量飼料記錄小鼠攝食情況,每周稱量小鼠體重記錄小鼠體重變化。小鼠飼養(yǎng)20 周后,禁食(不禁水)8 h。禁食結(jié)束后,給小鼠注射麻醉劑(10%的水合氯醛),劑量為0.1 mL/只。小鼠經(jīng)摘眼球取血后,脫頸椎處死小鼠,用剪刀打開其腹腔,取出小鼠的結(jié)腸、結(jié)腸內(nèi)容物。剪取部分結(jié)腸組織放入裝有4%多聚甲醛固定液的離心管中,常溫放置,用于后續(xù)的蘇木精-伊紅染色及觀察;其余組織分別放入編號記號的2 mL 凍存管中,用液氮速凍后保存于-80℃的超低溫冰箱。本試驗經(jīng)過廣州醫(yī)科大學實驗動物福利倫理委員會審批。

      表1 實驗動物分組 Table 1 Animal grouping

      1.3.2 蘇木精-伊紅染色

      切取適量結(jié)腸組織放入4%多聚甲醛固定液中,固定24~48 h。取出固定后組織,流水沖洗2~10 h。用低濃度酒精到高濃度酒精依次進行脫水。二甲苯浸泡15 min,浸泡兩次。用軟蠟 (熔點為52~56℃)浸泡15 min,浸泡兩次。將浸好蠟的組織塊放入包埋框中用硬蠟包埋,修塊備用。將石蠟塊用切片機切成5~8 μm 厚的切片,用干凈的涂多聚賴氨酸的載玻片貼片。將鋪好的切片在40℃下烘干。依次將切片進行脫蠟與復水。從蒸餾水中取出后,放入蘇木精溶液中染色10~30 min;將切片放入1%的鹽酸酒精數(shù)秒至切片變紅即可,流水沖洗使切片返藍;再次脫水處理;用0.5%伊紅乙醇溶液染色2~5 min;切片脫水透明。將切片從二甲苯拿出來稍晾干,中性樹膠封片,做好標記便于后面觀察。

      1.3.3 Real-time PCR

      用Trizol 試劑提取所需總RNA,測取每份樣品RNA 濃度,并稀釋到250 mg/L,定總RNA 濃度為500 ng,分別取每份稀釋后樣品2 μL,配上額定的水和逆轉(zhuǎn)錄試劑后進行RNA 逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后檢測DNA 濃度,確定合格后再向八連管中加入1 μL cDNA 及混合物,加蓋混勻。PCR 反應體系10 μL,反應條件95℃30 s 預變性;95℃ 5 s,60℃ 30 s 擴增,39 個循環(huán);65℃ 5 s,95℃ 0.05 s 熔解。采用2-ΔΔCt法表示各組mRNA 表達量。PCR 引物序列見表2。

      表2 引物信息表 Table 2 Primer sequence

      1.3.4 蛋白免疫印跡(Western blotting)

      從-80℃冰箱中取出適量結(jié)腸組織,研磨離心并吸取上清液,按BCA 試劑盒說明書檢測蛋白濃度,計算并按比例將5×蛋白上樣緩沖液、超純水和樣品加入無菌離心管中,4℃離心混勻后,95℃金屬浴煮混合液體10 min,再次短暫離心,混勻后均等分成3 份,1 份放-20℃冰箱備用,余下放-80℃冰箱保存。配濃縮膠和的分離膠,所有樣品濃度均為5 g/L,每個膠孔加入樣品10 μL 并進行凝膠電泳,剪PVDF 膜,切膠后,膜與膠條貼好夾緊后放入轉(zhuǎn)膜槽中進行恒流轉(zhuǎn)膜(300 mA,100 min),5%脫脂牛奶封閉2 h,一抗4℃孵育16 h 過夜,次日進行37℃,1 h 的二抗孵育,洗膜3 次,發(fā)光并采圖保存。使用Image J 測定目的條帶與內(nèi)參β-actin 灰度值比值表示所測蛋白的表達水平。

      1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

      試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計分析,多組數(shù)據(jù)的組間比較采用非配對雙尾t 檢驗(Unpaired two-tailed t test),試驗結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 槲皮素干預對各組小鼠體重的影響

      各組小鼠的體重增加量如圖1所示。飼養(yǎng)20周后,HF 組小鼠的體重增加量為14.05 g,顯著高于LF 組小鼠的體重增加量(p<0.05);而HF+Q 組小鼠的體重增加量為7.83 g,顯著低于HF組的體重增加量(p<0.05)。因此,槲皮素干預能有效降低肥胖小鼠的體重增長。相關(guān)研究的結(jié)果也表明槲皮素具有降低高脂飲食誘導的體重增加的作用[11-12],與本研究的結(jié)果相一致。

      圖1 槲皮素對小鼠體重增加的影響 Fig.1 Effect of quercetin on weight gain in obese mice

      2.2 槲皮素干預對各組小鼠結(jié)腸組織病理情況的影響

      圖2 所示,在LF 組中,結(jié)腸絨毛排列整齊有序,隱窩結(jié)構(gòu)、結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較為完整。在HF 組中,結(jié)腸絨毛出現(xiàn)不規(guī)則排列,隱窩結(jié)構(gòu)有較為明顯的損傷,杯狀細胞數(shù)量著減少,有較為明顯的炎性浸潤現(xiàn)象。在HF+Q 組中,腸絨毛和隱窩結(jié)構(gòu)排列較為有序,沒有出現(xiàn)明顯的炎性浸潤。因此,在高脂飲食引發(fā)的肥胖小鼠結(jié)腸組織炎癥現(xiàn)象中,槲皮素干預能修復肥胖小鼠的結(jié)腸形態(tài)學上的損傷。有研究報道在高脂日糧喂食引發(fā)的肥胖大鼠結(jié)腸組織炎癥現(xiàn)象中,通過低聚木糖的灌胃能明顯改善大鼠結(jié)腸形態(tài)學上的損傷[14]。

      圖2 槲皮素對結(jié)腸組織病理情況的影響(×200)Fig.2 Effect of quercetin on pathological condition of colon in obese mice (×200)

      2.3 槲皮素干預對各組小鼠腸內(nèi)容物中脂多糖含量的影響

      炎癥作為肥胖和相關(guān)代謝性疾病的一個關(guān)鍵因素已被廣泛認可。觸發(fā)炎癥產(chǎn)生的主要來源是腸道中的革蘭氏陰性菌的菌壁成分-脂多糖(LPS)[15]。高脂肪飲食誘發(fā)的肥胖和腸道炎癥以及血漿LPS濃度增加密切相關(guān)[16]。如圖3 所示,HF 組小鼠腸內(nèi)容物中LPS含量為7.01 ng/mL,相比于LF 組(4.18 ng/mL)顯著升高(p<0.05),而HF+Q 組小鼠腸道內(nèi)容物中的LPS含量為5.04 ng/mL,相比于HF 組降低約28.10%的含量(p<0.05)。有研究報道槲皮素可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群和增強腸屏障功能,從而減少血液中的LPS 濃度來干預高脂飲食誘導肥胖小鼠非酒精性脂肪肝[17]。本研究結(jié)果提示槲皮素可能通過糾正高脂膳食誘導的腸道菌群紊亂,減少LPS 產(chǎn)生,降低腸道炎癥反應的觸發(fā)作用。

      圖3 槲皮素對小鼠腸內(nèi)容物中LPS 含量的影響 Fig.3 Effect of quercetin on LPS content in obese mice

      2.4 槲皮素干預對各組小鼠結(jié)腸組織相關(guān)炎癥因子表達的影響

      圖4 槲皮素對小鼠結(jié)腸組織中相關(guān)炎癥因子mRNA 表達影響 Fig.4 Effect of quercetin on relative mRNA expression of inflammatory cytokines in colon tissues

      LPS 水平的增加與局部組織中的低程度慢性炎癥相關(guān)[18],因此檢測了結(jié)腸組織中炎性因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的表達情況。Real-time PCR 結(jié)果如圖4 所示,HF 組小鼠TNF-αmRNA 表達水平相對于LF組上升約3.06 倍(p<0.05),IL-1βmRNA 表達水平約升高3.16 倍(p<0.05),IL-6mRNA 表達水平約升高2.55 倍(p<0.05)。

      而槲皮素干預可以顯著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA 表達水平(p<0.05),相對于HF 組,槲皮素干預分別抑制TNF-α(55.37%)、IL-1β(35.12%)和IL-6(52.55%)的mRNA 表達。Western Blot 結(jié)果如圖5 所示,HF 組小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 的蛋白水平明顯高于LF 組(p<0.05),分別增加約TNF-α(2.10倍)、IL-1β(2.20 倍)和IL-6(1.61 倍)的蛋白表達。而與HF 組相比,HF+Q 組小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達水平顯著下降(p<0.05),分別抑制TNF-α(39.04%)、IL-1β(17.73%)和IL-6(25.47%)的蛋白表達。

      圖5 槲皮素對小鼠結(jié)腸組織中相關(guān)炎癥因子蛋白表達影響 Fig.5 Effect of quercetin on relative protein expression of inflammatory cytokines in colon tissues

      TNF-α主要是由巨噬細胞產(chǎn)生的促炎性細胞因子,其在結(jié)腸炎模型中的表達會升高,與炎癥程度呈正相關(guān)[19]。本研究中,TNF-α的表達水平在HF 組中升高,而槲皮素干預可以顯著降低TNF-α的表達水平。槲皮素干預也可以顯著降低結(jié)腸組織中IL-1β和IL-6 的表達水平。與槲皮素類似,同屬于黃酮類化合物的芹菜素也可以降低IL-1β和IL-6 在結(jié)腸中的表達水平以及嗜酸性粒細胞浸潤,從而抑制肥胖小鼠的結(jié)腸炎癥[20]。有研究報道辣木油顯著降低結(jié)腸中炎性因子IL-1β和IL-6 的表達,對LPS 誘導小鼠腸道炎癥有改善作用[21]。本研究結(jié)果提示,槲皮素對高脂飲食誘導結(jié)腸炎癥的改善作用可能與降低炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達相關(guān)。

      2.5 槲皮素干預對各組小鼠結(jié)腸組織TLR4/NF-κB 信號通路的影響

      TLR4/NF-κB 信號通路在結(jié)腸炎癥的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[22]。LPS 可通過TLR4 受體和銜接蛋白MyD88,激活NF-κB 信號通路,促進炎性因子的轉(zhuǎn)錄[23]。而IκBα蛋白在受到外來刺激后,可與NF-κB 解離后降解,使NF-κB 活化,最終引起一系列的炎癥反應[24]。因此檢測了TLR4 和其適配器蛋白MyD88 以及下游信號分子(NFκB,IκBα和p-IκBα)的蛋白表達。結(jié)果如圖6 所示,HF 組小鼠結(jié)腸組織的TLR4、MyD88、NF-κB 和p-IκBα的表達水平顯著高于LF 組(p<0.05),分別增加TLR4(1.80 倍)、MyD88(2.24倍)、NF-κB(3.02 倍)和p-IκBα(2.21 倍)的蛋白表達,HF 組IκBα的蛋白表達水平相對LF 組約下降37.67%。而HF+Q 組TLR4、MyD88、NF-κB 和p-IκBα的表達水平相比于HF 組有顯著下降,分別抑制TLR4(27.06%)、MyD88(44.51%)、NF-κB(44.10%)和p-IκBα(31.38%)的蛋白表達。HF+Q 組IκBα的表達水平相比于HF 組顯著升高,增加約1.21 倍的蛋白表達,提示槲皮素可以抑制IκBα降解,從而抑制NF-κB的活化。這些結(jié)果說明高脂飲食誘導的肥胖小鼠結(jié)腸中的TLR4/NF-κB 炎性信號通路被激活,而槲皮素干預對該信號通路的激活有抑制作用。有研究報道槲皮素在Caco-2細胞中可以調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號通路影響IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生[25]。赤小豆可能通過抑制NF-κB 信號通路的激活,降低相關(guān)炎性因子表達水平,從而抑制高脂飲食誘導肥胖小鼠的結(jié)腸組織炎癥[26]。本研究結(jié)果提示在高脂飲食誘導的結(jié)腸炎癥中,槲皮素干預可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活來降低相關(guān)炎性因子的表達。

      圖6 槲皮素對小鼠結(jié)腸組織中TLR4/NF-κB 信號通路的影響 Fig.6 Effect of quercetin on the TLR4/NF-κB signaling pathway in colon tissues

      3 結(jié)論

      研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可通過減少腸內(nèi)容物中LPS 含量,限制TLR4 與其結(jié)合,抑制TLR4 通路信號轉(zhuǎn)導,下調(diào)下游信號分子表達,最終減少促炎因子,緩解高脂飲食誘導的結(jié)腸炎癥損傷。本研究為槲皮素用于預防和治療腸道炎癥和肥胖提供新的思路。

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