楊樹菇凝集素誘導(dǎo)C57BL/6小鼠肝損傷和活化CD8+T細(xì)胞

李岳亮，陳麗瓊，文鈺棣，黃壯霖，曾淑嫻，梁一

（廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808）

食用型蘑菇具有美味、營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值高等特點(diǎn)，它富含各種酶和生物活性物質(zhì)，包括多糖、多萜、酚類、活性多肽/蛋白等，其具有抗腫瘤、降血壓、抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，因此，在中國(guó)、美國(guó)、荷蘭、波蘭等國(guó)家倍受歡迎[1]。

蘑菇的毒性研究主要集中在毒蘑菇中的毒傘肽、毒蠅蕈醇、鵝膏蕈氨酸等活性作用[2,3]，食用蘑菇的毒性報(bào)道較少。例如歐洲、北美食用已久的黃口菇，近期被報(bào)道過(guò)量食用會(huì)造成橫紋肌溶解，并伴隨血漿肌酸激酶和肝臟轉(zhuǎn)氨酶的異常升高[4]。在亞洲被稱為“天使之翼”的貝形圓孢側(cè)耳在日本因其脫髓鞘活性引發(fā)的腦病致死17人[5]。還有一些食用蘑菇例如雙孢蘑菇、雞油菌、平菇等，或可誘導(dǎo)突變、溶肌、臟器出血、肝臟炎癥等作用[6]。食用蘑菇中被鑒定到的毒性成分包括林地蘑菇、雞油菌中有微量的毒傘肽[6]，亞稀褶黑菇含有cycloprop-2-ene carboxylic acid，棕灰口蘑含有saponaceolide B 和M，平菇中含有造成高鉀血癥、心動(dòng)過(guò)緩的磷脂酶蛋白和抑制蛋白合成的奧來(lái)毒素[7]，雙孢蘑菇中的Agaritin 可誘導(dǎo)突變，貝形圓孢側(cè)耳含有一種二甲亞胺氨基酸，金針菇中含有心臟毒性的flammutoxin 蛋白等。毒性成分的鑒定難度也是食用菌毒性有所爭(zhēng)議的重要原因之一。

楊樹菇（Agrocybe aegerita）是一種常用的食用蘑菇，之前研究發(fā)現(xiàn)，楊樹菇水提物組分在小鼠試驗(yàn)中表現(xiàn)出致死作用，半致死劑量（LD50）為8.77 g/kg，在BALB/c 小鼠模型中，水提物組分灌胃有顯著的肝臟毒性[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，水提物中蛋白組分主要是凝集素AAL（Agrocybe aegeritalectin），它是由含有碳水化合物特異性識(shí)別區(qū)域的158 個(gè)氨基酸組成的分子量為18 ku 的半乳糖凝集素，具有抗腫瘤凋亡活性[9]。AAL 可誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞[10]和肝癌細(xì)胞[11]凋亡，對(duì)消化酶的作用耐受，口服或尾靜脈注射具有顯著的肝臟毒性[8]。AAL 的肝臟毒性損傷機(jī)制不明，因此，本文將研究AAL 在C57BL/6 小鼠模型中的作用，為食用蘑菇毒性研究和安全飲食提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

C57BL/6 小鼠，雌性，SPF 級(jí)，6～8 周齡，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)，動(dòng)物合格證書由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所出具。

小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒，小鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒，南京建成生物工程研究所；Trizol，Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A），Takara；SYBR（RR820A），Takara；Anti-mouse CD3e FITC，eBioscience；Anti-mouse NK1.1 APC，eBioscience；Anti-mouse F4/80-APC-eFluor，eBioscience ；Anti-mouse CD4-APC-eFluor，eBioscience；Anti-mouse CD8a PerCP Cyanine5.5，eBioscience；GAPDH，F(xiàn)：5′-G CAGTGGCAAAGTGGAGATT-3′，R：5′-CGCTCCTG GAAGATGGTGAT-3′；IL-10，F(xiàn)：5′-ACAACATACTG CTAACCGACTC-3′，R：5′-CTGGATCATTTCCGATA AGG-3′；IL-33，F(xiàn)：5′-GATGGGAAGAAGCTGATGGT G-3′，R：5′-TTGTGAAGGACGAAGAAGGC-3′；IL-27，F(xiàn)：5′-CTGTTGCTGCTACCCTTGCT-3′，R：5′-GGAA ACATTGGGAAGATGGTAT-3′；IFN-γ，F(xiàn)：5′-AGCAA CAACATAAGCGTCAT-3′，R：5′-CCTCAAACTTGGC AATACTC-3′；TNF-α，F(xiàn)：5′-CTACTGAACTTCGGGG TGAT-3′，R：5′-CAGGCTTGTCACTCGAATT-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 楊樹菇凝集素的制備

楊樹菇子實(shí)體購(gòu)買自福建省三明食用菌研究所，將之研磨成干粉后，通過(guò)浸泡、過(guò)濾和離心方式收集濾液。在濾液中加入硫酸銨至飽和度為40%，攪拌20 min 后離心棄沉淀收集上清。在上清中加入硫酸銨至80%飽和度，沉淀60 min 后離心收集沉淀。用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）重懸沉淀并將之透析除鹽得到楊樹菇總蛋白。將楊樹菇總蛋白用0.45 μm 的濾膜進(jìn)行抽濾。安裝lactose 親和層析柱，用PBS 平衡柱子30 min，調(diào)節(jié)機(jī)器的流速為1 mL/min。將楊樹菇總蛋白溶液（置于冰上）上樣到親和層析柱。然后用PBS 溶液沖洗雜蛋白，直到280 nm 吸收線處于水平。用200 mMα-lactose PBS 緩沖液洗脫并收集目的蛋白AAL，并在PBS 緩沖液中充分透析，真空干燥后于-20℃保存。

1.2.2 AAL 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠肝臟損傷

將AAL 溶解在無(wú)菌PBS 中，配制成2.5 mg/mL的AAL 溶液。根據(jù)不同處理時(shí)間0 h、6 h 和9 h 把小鼠分為三組，每個(gè)處理組的小鼠數(shù)量n=7。0 h 組注射無(wú)菌PBS 溶液，6 h 組和9 h 組按照2.5 mg/kg 的劑量將AAL 尾靜脈注射到C57BL/6 小鼠體內(nèi)處理6 h 和9 h。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行眼球采血，同時(shí)處死小鼠。血清用于檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶ALT 和AST 的活性，取小鼠部分肝臟組織做石蠟組織切片，部分肝臟組織用于提取肝臟總RNA 和單個(gè)核細(xì)胞分離、染色。

1.2.3 小鼠血清ALT 和AST 的檢測(cè)

使用南京建成生物工程研究所的ALT 和AST 試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定小鼠血清中的ALT和AST 兩項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.4 小鼠肝臟組織石蠟切片與蘇木精-伊紅染色法（HE 染色）

小鼠眼球取血處死后，取肝臟組織，剪下一塊組織（1.5 cm×1 cm×0.5 cm）置于包埋盒中，通過(guò)脫水、浸蠟、包埋、冰凍等操作后，用組織切片機(jī)將肝臟組織切成3 μm 厚的薄片。制作好的組織切片用HE 染色后，進(jìn)行脫水、透明、封片等操作，以便在鏡下觀察。

1.2.5 Real-time PCR 測(cè)定小鼠肝臟組織細(xì)胞因子表達(dá)

用Trizol 法提取肝組織中的RNA，按照Takara的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將肝臟組織中的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照Takara 的SYBR（RR820A）試劑說(shuō)明書，用熒光定量PCR 儀檢測(cè)并分析GAPDH、IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-α的mRNA 表達(dá)水平。

1.2.6 小鼠肝臟單個(gè)核細(xì)胞表面抗原染色

小鼠眼球取血處死后，取肝臟組織。用生理鹽水灌注清洗肝臟組織，并通過(guò)切塊、研磨、胰酶消化和過(guò)濾將提取肝臟細(xì)胞。將提取的細(xì)胞用RPMI1640 培養(yǎng)基重懸并800×g 離心5 min。重復(fù)上述步驟一次后棄上清，用15 mL 33% Percoll 分離液將離心后的細(xì)胞沉淀重懸。室溫條件下，800×g 離心30 min，棄上清。往細(xì)胞沉淀中加入1 mL RBC lysing buffer 破碎紅細(xì)胞，3 min 后加入9 mL RPMI1640 培養(yǎng)基終止反應(yīng)。800×g 離心5 min 后用RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，重復(fù)上述步驟一次后獲得單個(gè)核細(xì)胞。

設(shè)置空白對(duì)照管和單標(biāo)抗體管。在100 μL 重懸細(xì)胞液中加入 Anti-mouse-NK1.1-APC、Anti-mouse-CD3e-FITC、Anti-mouse-NK1.1-APC、Anti-mouse-CD69-PE，Anti-mouse-F4/80-APC-eFluor、Anti-mouseCD4-APC-eFluor、Anti-mouse-CD8a-PerCP Cyanine5.5，4℃避光孵育30 min。加入3 mL PBS，1500 r/min 離心5 min 棄上清收集細(xì)胞，重復(fù)上述步驟一次，最后加入200 μL 2%多聚甲醛，避光4℃保存，24 h 內(nèi)上機(jī)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。小鼠血清ALT、AST檢測(cè)結(jié)果，RT-PCR結(jié)果和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均用（）表示，p值小于0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

AST/ALT 比值，n=7，***p<0.001，****p<0.0001；（c）分別取小鼠的肝臟和胰臟，（d）進(jìn)行組織切片與HE 染色，組織切片的放大倍數(shù)均為400 倍。

2.1 尾靜脈注射AAL誘導(dǎo)C57BL/6小鼠肝臟損傷

對(duì)C57BL/6 小鼠靜脈注射AAL（2.5 mg/kg），在處理后的0 h、6 h、9 h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)眼球采血，其血清用于檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶活性，同時(shí)處死小鼠取其肝臟做石蠟組織包埋、切片及HE 染色。結(jié)果如圖1a、1b所示，AAL 處理6 h 后，ALT 的測(cè)定值升高了134 倍，AST 的測(cè)定值升高了23 倍。處理9 h 后，ALT 的測(cè)定值升高了94 倍，AST 的測(cè)定值升高了19 倍。6 h組和9 h 組中的AST 與ALT 比值均小于1，提示AAL的處理可能引起非酒精性脂肪肝疾病。與對(duì)照組相比，AAL 處理6 h 和9 h 的C57BL/6 小鼠肝臟均出現(xiàn)肉眼條件下明顯的肝損傷表征，包括肝臟淤血變暗和腫大；另外脾臟有變黑、腫大和淤血的現(xiàn)象（圖1c）。在6 h和9 h 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，肝臟與脾臟的肉眼觀察變化差異不明顯。從肝臟組織HE 染色結(jié)果（圖1d）可見(jiàn)，正常肝臟組織肝細(xì)胞以中央靜脈為中心放射狀排列形成肝板，相鄰肝板之間的空隙為肝竇，是肝小葉內(nèi)血液流通的管道。AAL 處理6 h 后，肝臟組織肝竇內(nèi)出現(xiàn)紅細(xì)胞淤積，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞皺縮，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，大量肝細(xì)胞開(kāi)始空洞化，壞死區(qū)還可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。9 h 組的肝臟組織的肝竇紅細(xì)胞淤積、肝細(xì)胞空洞化及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的程度減弱。

圖1 尾靜脈注射AAL 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠肝臟損傷 Fig.1 Tail intravenous injection of AAL induced liver injury in C57BL/6 mice

凝集素是一類廣泛存在于真核細(xì)胞和細(xì)菌、病毒、真菌中的蛋白質(zhì)或糖蛋白，能夠保護(hù)或促進(jìn)肝損傷。高劑量的槲寄生凝集素在小鼠模型中表現(xiàn)出致死性，低劑量的槲寄生凝集素具有肝臟毒性，并誘導(dǎo)血清AST 和ALT 顯著升高[12]。接骨木果實(shí)中的核糖體滅活凝集素Ebulin f在年老小鼠模型中表現(xiàn)出致死活性，誘導(dǎo)包括肝臟壞死等消化器官的衰竭[13]。巴西青香木葉提取物及凝集素在荷S180 小鼠模型中均有抗腫瘤活性，但會(huì)引起肝臟組織的液泡化和脂肪肝[14]。另外，常用于誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷模型的刀豆蛋白Con A（concanavalin A）也是一類凝集素[15]。結(jié)合研究結(jié)果提示，在食用或使用天然產(chǎn)物作為藥物時(shí)，要注意其中是否有凝集素成分，探討其安全使用劑量。

2.2 AAL 調(diào)節(jié)C57BL/6 小鼠肝臟細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)

檢測(cè)C57BL/6 小鼠在尾靜脈注射AAL 后6 h 和9 h肝臟組織五種細(xì)胞因子IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-α的mRNA 表達(dá)變化情況。如圖2 所示，與對(duì)照組相比，AAL 處理6 h 和9 h 組的肝臟IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-α的mRNA 表達(dá)水平都顯著升高（p<0.001）。6 小時(shí)組中，細(xì)胞因子的表達(dá)分別升高到25.14 倍（IL-10）、4.62 倍（IL-33）、5.14 倍（IL-27）、16.51 倍（IFN-γ）、28.10 倍（TNF-α）。9 小時(shí)組中，細(xì)胞因子的表達(dá)分別升高到7.60倍（IL-10）、3.22倍（IL-33）、1.52 倍（IL-27）、12.78 倍（IFN-γ）、10.99 倍（TNF-α）。

圖2 AAL 調(diào)節(jié)C57BL/6 小鼠肝臟細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá) Fig.2 AAL regulated mRNA expression of cytokines in the liver of C57BL/6 mice

肝臟細(xì)胞因子的表達(dá)水平與肝損傷機(jī)制密切相關(guān)。肝損傷上調(diào)了IL-10 表達(dá)水平，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)肝臟損傷的修復(fù)[16]。另一方面，肝臟中的巨噬細(xì)胞被IFN-γ誘導(dǎo)活化為M1，分泌TNF-α、IL-1β和IL-12，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡和肝纖維化[17]。同時(shí)，肝損傷后高表達(dá)的IL-27 促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而上調(diào)TNF-α和IL-6 的表達(dá)水平[18]。IL-33 在不同的肝臟損傷模型的作用機(jī)制不同，這可能與不同的免疫病理類型相關(guān)。在病毒性肝炎模型中，IL-33 通過(guò)Th2 細(xì)胞/IL-13/STAT6 誘導(dǎo)免疫抑制性中性粒細(xì)胞的發(fā)揮肝臟保護(hù)作用[19]。外源性IL-33 給藥處理降低Con A 誘導(dǎo)的肝損傷小鼠的IFN-γ和TNF-α表達(dá)水平，減輕肝臟炎癥[20]；在Con A 誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中，活化的CD8+T 細(xì)胞會(huì)損傷肝細(xì)胞，后者表達(dá)的IL-33 促進(jìn)淋巴細(xì)胞IL-5 等炎癥因子分泌[21]。另外在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中，阻斷IL-33 后影響肝臟炎癥因子的釋放從而減輕肝臟損傷[22]。研究結(jié)果表明AAL 誘導(dǎo)小鼠肝損傷后，細(xì)胞因子IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-α均參與肝損傷機(jī)制。

2.3 NKT 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞參與了AAL 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠的肝臟損傷

為探究AAL 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠肝損傷的作用機(jī)制，通過(guò)分離肝竇單個(gè)核細(xì)胞結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)尾靜脈注射AAL 后的C57BL/6 小鼠肝臟各類免疫細(xì)胞的變化情況。AAL（2.5 mg/kg）尾靜脈注射C57BL/6小鼠，0 h、6 h、9 h 分離小鼠肝臟的單個(gè)核細(xì)胞，使用anti-CD3、anti-NK1.1 和anti-F4/80 熒光抗體染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò)設(shè)門（圖3a、b），統(tǒng)計(jì)T細(xì)胞（CD3+T）、NKT 細(xì)胞（CD3+NK1.1+T）、Kupffer細(xì)胞（F4/80+）和NK 細(xì)胞（CD3-NK1.1+）占肝臟單個(gè)核細(xì)胞比例。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，6 h 組和9 h組小鼠肝臟T細(xì)胞比例由27.92%顯著升高到45.95%和47.86%（p<0.05），NKT 細(xì)胞的比例由2.46%顯著升高到6.36%和6.17%（p<0.05），而Kupffer 細(xì)胞和NK 細(xì)胞的比例沒(méi)有顯著改變（圖3c）。

進(jìn)一步用anti-CD3、anti-CD4 和anti-CD8 熒光抗體染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò)設(shè)門（圖3d、e），統(tǒng)計(jì)CD4、CD8 T 細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的比例，以反映T 細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，6 h 組小鼠肝臟CD8+T 細(xì)胞比例由17%顯著升高到27.15%（p<0.05），而CD4+T 細(xì)胞的比例沒(méi)有明顯的改變（圖3f）。

圖3 注射AAL 后NKT 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞數(shù)量的變化 Fig.3 The changes in number of NKT cells and CD8+T cells after AAL injection

正常肝臟中30%為非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，包括約50%的內(nèi)皮細(xì)胞、20%的Kupffer 細(xì)胞和25%的淋巴細(xì)胞等[23,24]。在Con A 誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，Kupffer細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞和NKT 細(xì)胞均參與其中[25-27]，且CD4+T 細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞。這與AAL主要誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞增多不同。另一關(guān)于AAL 誘導(dǎo)小鼠肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)，AAL 可誘導(dǎo)T 細(xì)胞和NKT細(xì)胞的數(shù)量比例增加[28]，這與該研究結(jié)果是一致的。

2.4 尾靜脈注射AAL 促進(jìn)了小鼠肝臟CD8+T細(xì)胞的活化

CD69 是T 淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）活化的表面標(biāo)志[29,30]，為進(jìn)一步探索小鼠肝臟免疫細(xì)胞在AAL 處理后的活化情況。AAL（2.5 mg/kg）尾靜脈注射C57BL/6 小鼠，0 h、6 h、9 h 分離小鼠肝臟的單個(gè)核細(xì)胞，用anti-CD3、anti-NK1.1、anti-CD4、anti-CD8 和anti-CD69 熒光抗體染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，6 h 組的CD69+T細(xì)胞的比例由10.02%顯著升高到18.28%（p<0.01），CD69+CD8+T 細(xì)胞的比例由 5.96%顯著升高到16.20%（p<0.01），CD69+CD4+T 細(xì)胞的比例由2.27%顯著降低到1.58%（p<0.01）。9 h 組的CD69+NKT細(xì)胞的比例由6.95%降低到4.62%（p<0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明AAL 促進(jìn)小鼠肝臟的T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的活化。

CD8+T 細(xì)胞是肝臟中主要的T 細(xì)胞群，CD8+T細(xì)胞的激活與急性甲型肝炎的肝損傷程度相關(guān)[31]，并且是非酒精性脂肪性肝炎的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞[32]。另一方面，急性肝炎的程度受CD8+T 細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，但是不受其細(xì)胞壽命變化的影響[33]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為CD4+T 細(xì)胞而非CD8+T 細(xì)胞在Con A 誘導(dǎo)小鼠的急性肝損傷中發(fā)揮重要作用[34]。最新的一項(xiàng)ConA 的研究發(fā)現(xiàn)，在Rag2 缺陷小鼠轉(zhuǎn)移T 細(xì)胞模型中，CD8+T細(xì)胞通過(guò)IL33 的釋放介導(dǎo)肝臟的嚴(yán)重?fù)p傷[21]。本研究中，AAL 誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷后使CD8+T 細(xì)胞的活化顯著增加，且IL33 的mRNA 水平顯著升高，提示在AAL 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠肝臟損傷中CD8+T 細(xì)胞的重要作用。未來(lái)仍需要通過(guò)封閉細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證CD8+T 細(xì)胞參與肝臟毒性的作用機(jī)制。

圖4 注射AAL 促進(jìn)小鼠肝臟免疫細(xì)胞的活化 Fig.4 The AAL injection promoted activation of liver immune cells in mice

3 結(jié)論

楊樹菇凝集素AAL 尾靜脈注射C57BL/6 小鼠，誘導(dǎo)血清ALT 和AST 水平顯著增加，肝臟組織中出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞壞死空洞。其作用機(jī)制是上調(diào)肝臟NKT 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量，活化CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞因子IL-10、IL-33、IL-27、IFN-γ和TNF-αmRNA 的表達(dá)增加。