干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄有機(jī)酸、花色苷和單寧組分的影響

趙裴，成甜甜，王開(kāi)賢，韓富亮,2,3*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌，712100)2(陜西省葡萄與葡萄酒工程中心，陜西 楊凌，712100)3(西北農(nóng)林科技大學(xué)(合陽(yáng))葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 合陽(yáng)，715300)

干化葡萄酒是指將采收后的葡萄適度風(fēng)干，失去部分水分，達(dá)到一定的糖度和酸度后再進(jìn)行發(fā)酵得到的葡萄酒[1]。這種葡萄酒的釀造已經(jīng)有四千余年的歷史[2]。根據(jù)干化場(chǎng)所和干化過(guò)程葡萄失水的驅(qū)動(dòng)因素的不同，干化處理主要包括日光干化、室內(nèi)自然干化、設(shè)備輔助干化3種方式[3]。其中，室內(nèi)自然干化是不受天氣影響，不需額外設(shè)備投入的一種實(shí)用性強(qiáng)，成本較低的方式。

干化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不僅引起葡萄中游離水的散失，而且導(dǎo)致葡萄表皮組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞代謝方式發(fā)生明顯的變化，因此干化葡萄的糖分、有機(jī)酸、多酚等成分都與新鮮果實(shí)有所不同[4-5]。干化期間葡萄細(xì)胞的代謝變化可以分為兩步：第1步從開(kāi)始干化至葡萄失水10%～12%，此時(shí)細(xì)胞對(duì)脅迫作用作出響應(yīng)，脫落酸、脯氨酸和脂氧合酶積累；第2步發(fā)生在葡萄失水20%左右，這時(shí)脯氨酸和蛋白質(zhì)顯著積累，乙醇脫氫酶活性增強(qiáng)，乙醇和乙醛的合成增加，但隨著乙酸乙酯的生成而有所減少[6]。

有機(jī)酸影響葡萄酒酸度和甜度的平衡，同時(shí)對(duì)葡萄酒的微生物穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性有益?；ㄉ帐羌t葡萄酒和桃紅葡萄酒的主要呈色物質(zhì)。依據(jù)結(jié)構(gòu)差異，花色苷可以分為基本花色苷、?；ㄉ铡⑦拎ㄉ蘸突ㄉ昭苌颷7]。新釀紅葡萄酒中的花色苷通常以基本花色苷和?；ㄉ諡橹?，而陳釀紅葡萄酒的顏色來(lái)源主要是較穩(wěn)定的花色苷衍生物和吡喃花色苷[8]。MARQUEZ 等[9]采用HPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)，干化‘美樂(lè)’和‘西拉’葡萄醪中含有vitisin A和vitisin B，以及基本花色苷與兒茶素通過(guò)甲基-亞甲基橋形成的縮合花色苷。縮合單寧主要存在于葡萄的果皮和種子，是由黃烷-3-醇單體，包括兒茶素、棓兒茶素、表兒茶素、表?xiàng)攦翰杷睾捅韮翰杷貨](méi)食子酸酯形成的復(fù)雜聚合物[10]。葡萄破碎后，葡萄皮和籽中的縮合單寧緩慢進(jìn)入葡萄酒中，貢獻(xiàn)了葡萄酒的澀感[10]。干化處理對(duì)葡萄化學(xué)成分的改變受到葡萄品種、干化方式、干化時(shí)間等多種因素的影響，這些改變是由各成分的濃縮與擴(kuò)散、合成與氧化、聚合和降解等多種效應(yīng)所決定的[11]。

‘馬瑟蘭’是由赤霞珠和歌海娜雜交而成的品種，具有環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、果粒小等優(yōu)點(diǎn)。該品種自2001年由法國(guó)引入我國(guó)以來(lái)，其栽培面積不斷擴(kuò)大，具有生產(chǎn)高品質(zhì)葡萄酒的潛力[12]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)干化葡萄和葡萄酒的研究還較少[13-15]。本研究以‘馬瑟蘭’葡萄為材料，研究干化處理對(duì)其基本理化指標(biāo)、有機(jī)酸、花色苷、單寧組分的影響，以提高或改善‘馬瑟蘭’葡萄品質(zhì)，為釀造‘馬瑟蘭’干化葡萄酒提供參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料‘馬瑟蘭’葡萄于2019年取自西北農(nóng)林科技大學(xué)(合陽(yáng))葡萄試驗(yàn)示范站。還原糖137.50 g/L，滴定酸5.34 g/L(以酒石酸計(jì))，pH值3.36。

乙腈、甲醇(均為色譜純)，美國(guó)Tedia公司；甲酸(色譜純)，天津科密歐公司；丙酮、間苯三酚(均為分析純)，西隴科學(xué)公司；標(biāo)準(zhǔn)品：二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、抗壞血酸、乳酸、琥珀酸、乙酸，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LB32T手持糖度計(jì)，廣州速為公司；FE28 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)公司；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康公司；LC-20A高效液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器)，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄干化方法

葡萄干化處理在無(wú)太陽(yáng)直射、通風(fēng)良好的房間進(jìn)行，溫度20～25 ℃，空氣相對(duì)濕度65%～85%。葡萄懸掛于鋁合金架，每穗間隔15～20 cm(圖1)。整個(gè)干化時(shí)期持續(xù)27 d，分別在第0、10、18和27天采樣。隨機(jī)采集不同高度以及果穗底部、中部和頂部無(wú)物理性損傷及霉變的果實(shí)，共采集300粒漿果，分為3份。保存于-20 ℃冰箱備用分析。

圖1 干化處理過(guò)程中的‘馬瑟蘭’葡萄Fig.1 ‘Marselan’ grapes during the drying process

1.3.2 基本理化指標(biāo)的測(cè)定

葡萄手工壓榨并離心后得到澄清的果汁，進(jìn)行基本理化指標(biāo)測(cè)定?？扇苄怨绦挝锖客ㄟ^(guò)手持糖量計(jì)測(cè)定。還原糖、滴定酸含量參照GB 15037—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定[16]。pH值采用pH計(jì)測(cè)量。

1.3.3 葡萄汁有機(jī)酸的測(cè)定

取葡萄清汁，用去離子水稀釋5倍，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。HPLC的色譜條件參照成冰等[17]的方法。配制質(zhì)量濃度分別為 2.0、1.0、0.6、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.062 5 mg/mL的系列混標(biāo)溶液，過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：色譜柱為Synergi C18柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)，流動(dòng)相為0.02 mol/L KH2PO4-甲醇(體積比97∶3)溶液(H3PO4調(diào)節(jié)pH為2.30)，流速1 mL/min；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.3.4 葡萄果皮花色苷的提取與測(cè)定

花色苷的提取參照岳泰新[18]的方法。準(zhǔn)確稱取0.500 g葡萄果皮凍干粉于50 mL離心管中，加入10 mL鹽酸-甲醇-水溶液(體積比1∶600∶399)，30 ℃下避光超聲萃取30 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，隨后轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管中，殘?jiān)貜?fù)提取3次，合并上清液并搖勻，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。

HPLC分析參照本實(shí)驗(yàn)室YANG等[19]的方法。定量分析以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，所有花色苷濃度以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷當(dāng)量表示?；ㄉ諛?biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍為0.27～400 mg/L，決定系數(shù)為0.999 9。樣品測(cè)定前經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，色譜柱為Synergi Hydro-RP C18柱(250 mm×4.6 mm, 4 μm)。流動(dòng)相A[V(甲酸)∶V(乙腈)∶V(水)=2.5∶10∶80]，流動(dòng)相B[V(甲酸)∶V(乙腈)∶V(水)=2.5∶50∶40)]。梯度洗脫程序：0～45 min：0%～35%B；45～46 min：35%～100%B；46～50 min：100%B；50～51 min：100% ～0%B；51～55 min：0%B，流速：1 mL/min，柱溫：35 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm。根據(jù)花色苷的保留時(shí)間、最大吸收波長(zhǎng)和本實(shí)驗(yàn)室花色苷質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)花色苷進(jìn)行定性分析[8, 19-20]。

1.3.5 葡萄皮和籽單寧的提取與測(cè)定

單寧提?。喝?0粒冷凍后的葡萄，剝離果皮和種子，在液氮保護(hù)下研磨成粉末，果皮和種子分別移入50 mL離心管中，加入10 mL丙酮水(體積比2∶1)溶液，離心管內(nèi)充滿氮?dú)?，室溫下避?00 r/min振蕩提取24 h。離心后取上清液在35 ℃下減壓濃縮以除去有機(jī)相，剩余溶液凍干成粉末，最后加入1 mL甲醇復(fù)溶。

間苯三酚反應(yīng)：取100 μL甲醇提取液與100 μL間苯三酚溶液(含0.2 mol/L HCl、100 g/L間苯三酚和20 g/L抗壞血酸)混合均勻，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入400 μL 0.2 mol/L乙酸鈉水溶液終止反應(yīng)。

HPLC測(cè)定：上述600 μL反應(yīng)溶液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量10 μL。色譜柱與花色苷的檢測(cè)相同。流動(dòng)相A[V(水)∶V(甲酸)=98∶2]，流動(dòng)相B[V(乙腈)∶V(流動(dòng)相A)=80∶20]。梯度洗脫程序：0～5 min:0%B；5～65 min：0%～20%B；65～66 min：20%～100%B；66～74 min：100%B；74～75 min：100%～0%B，流速：1 mL/min，柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。參考BUSSE-VALVERDE等[21]和KENNEDY等[22]的方法定性分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。通過(guò)Tukey檢驗(yàn)和ANOVA方差分析法進(jìn)行變量間差異顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄形態(tài)和基本理化指標(biāo)的影響

圖2展示了‘馬瑟蘭’葡萄在開(kāi)始干化(記為CK)及干化第10、18和27天(分別記為G1、G2和G3)的形態(tài)變化。干化過(guò)程中，葡萄果梗顏色變深，果粒逐漸皺縮軟化，擠壓果?？梢园l(fā)現(xiàn)果皮變薄且為碎片狀，果汁輕微染成紅色。FASOLI等[4]對(duì)‘Corvina’葡萄的干化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。

圖2 干化過(guò)程中‘馬瑟蘭’葡萄形態(tài)變化Fig.2 Morphological alteration during postharvest dehydration of ‘Marselan’ grapes

由表1可知，干化處理后，G1、G2和G3失水率、皮占比和籽占比都顯著高于CK，百粒重和出汁率顯著低于CK(P<0.05)。G3的失水率最高，為32.76%，而出汁率最低，為54.67%。由于干化過(guò)程葡萄失水濃縮，葡萄汁的可溶性固形物含量不斷上升，G3的還原糖含量達(dá)到268.67 g/L，與CK相比上升了95.4%。G1和G2的滴定酸均顯著高于CK，而G3的滴定酸與CK無(wú)顯著差異(P>0.05)。有文獻(xiàn)報(bào)道，干化處理提高了‘赤霞珠’、‘美樂(lè)’、‘Xynisteri’、‘Mavro’、‘Chatus’的滴定酸，而‘Avana’、‘Nebbiolo’的滴定酸降低[5,9]。對(duì)‘Trebbiano’葡萄的研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)自然干化18 d，其總酸降低，而設(shè)備輔助干化18 d后其總酸升高[23]。因此，干化對(duì)滴定酸的影響可能與葡萄品種、干化程度和干化方式有關(guān)。干化過(guò)程中，葡萄汁的pH不斷上升，與滴定酸的變化趨勢(shì)不一致。這種差異可能與干化過(guò)程中金屬陽(yáng)離子(如K+)升高有關(guān)[24-25]。

表1 干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄基本理化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of postharvest dehydration on the basic physiochemical parameters of‘Marselan’ grapes

2.2 干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄汁有機(jī)酸的影響

有機(jī)酸的組成和含量不僅直接影響了葡萄果實(shí)的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)也間接塑造了葡萄酒的口感和風(fēng)格[25]。葡萄中有機(jī)酸的含量受到葡萄品種、產(chǎn)區(qū)氣候、成熟度等因素的影響[26]。

‘馬瑟蘭’葡萄汁中共檢測(cè)到草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸和檸檬酸5種有機(jī)酸(表2)。其中酒石酸含量最高，蘋果酸次之，兩者之和占有機(jī)酸總量的87%左右。所有干化處理葡萄汁有機(jī)酸總量較CK顯著上升(P<0.05)，其中G3含量最高，達(dá)(11.34±0.57) g/L。由表2可知，G1、G2和G3的草酸、酒石酸、檸檬酸的含量顯著高于CK(P<0.05)，說(shuō)明干化過(guò)程果實(shí)失水濃縮導(dǎo)致這些成分含量升高。G1、G2和G3的抗壞血酸含量顯著低于CK(P<0.05)，這是由于降解引起的損失高于失水引起的濃縮。蘋果酸的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，與滴定酸的變化趨勢(shì)相同。蘋果酸含量的下降可能與細(xì)胞氧化分解或糖異生反應(yīng)有關(guān)[26]。干化處理增加了葡萄原料的有機(jī)酸總量，有助于減少許多產(chǎn)區(qū)向葡萄酒中人為添加有機(jī)酸的措施。

表2 干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄汁有機(jī)酸的影響 單位：g/L

2.3 干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄皮花色苷類物質(zhì)組分和含量的影響

如表3所示，‘馬瑟蘭’葡萄皮中共檢測(cè)到19種花色苷，其中包括基本花色苷5種，乙?；ㄉ?種，香豆?；ㄉ?種，咖啡?；ㄉ?種，以及未鑒定結(jié)構(gòu)的花色苷衍生物2種。

表3 干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄花色苷含量的影響 單位：μg/g皮干重

從B環(huán)結(jié)構(gòu)來(lái)看，二甲花翠素類花色苷占總花色苷的比例最高，約占總量的81.37%～82.79%，花青素類花色苷占總花色苷的比例最低，約占總量的0.69%～0.91%。從C環(huán)取代形式來(lái)看，基本花色苷比例最大，占總量的48.66%～50.38%，其次為乙酰化葡萄糖苷、香豆?；咸烟擒?、咖啡酰化葡萄糖苷。FIGUEIREDO-GONZLEZ等[27]研究了‘Garnacha Tintorera’葡萄在干化期間花色苷的變化，發(fā)現(xiàn)二甲花翠素類和花青素類花色苷分別是含量最高和最低的花色苷。

新鮮‘馬瑟蘭’葡萄皮花色苷總量為(19 215.75±2.69)μg/g，G1、G2和G3的花色苷總量分別比CK低14.70%、32.67%和35.27%。與CK相比，G3中除花青素-3-O-乙?；咸烟擒?、花翠素-3-O-反式香豆?；咸烟擒铡⒓谆ù渌?3-O-反式香豆?；咸烟擒罩獾膯误w花色苷含量都顯著下降(P<0.05)。MENCARELLI等[28]研究了干化處理對(duì)‘Aleatico’葡萄花色苷含量的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄至干化結(jié)束時(shí)(失水40%)花色苷總量分別降低了4.71%、21.18%和60.71%。在正常的細(xì)胞中，花色苷等酚類物質(zhì)與多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶等氧化酶類位于不同的區(qū)域。干化處理誘導(dǎo)葡萄細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因的表達(dá)，引起表皮細(xì)胞壁解體，氧氣也更容易進(jìn)入細(xì)胞中。因此，干化有可能促進(jìn)了葡萄細(xì)胞中花色苷的酶促氧化[4]。另一方面，干化過(guò)程中，可觀察到果肉被染成紅色。因此，果皮花色苷向果肉擴(kuò)散也是引起果皮花色苷含量降低的原因之一[27]。

花色苷衍生物比單體花色苷更能抵抗SO2的漂白，在葡萄酒中的顏色穩(wěn)定性更強(qiáng)[8]。干化過(guò)程中，‘馬瑟蘭’葡萄中花色苷衍生物的含量不斷上升，至干化結(jié)束時(shí)上升了36.23%。葡萄干化過(guò)程中，伴隨有細(xì)胞破裂和氧化反應(yīng)的發(fā)生，單體花色苷與其他化合物反應(yīng)，從而導(dǎo)致了花色苷衍生物含量上升[9]。干化期間花色苷含量的動(dòng)態(tài)變化是由其合成、降解、聚合等各種反應(yīng)決定的[8]。

續(xù)表3

2.4 干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄皮和籽縮合單寧組分的影響

如表4所示，‘馬瑟蘭’葡萄皮縮合單寧的末端亞基有兒茶素(catechin，C)和表兒茶素(epicatechin，EC)2種，延伸亞基有4種類型：C、EC、表?xiàng)攦翰杷?epigallocatechin, EGC)及表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)。與葡萄皮不同，‘馬瑟蘭’葡萄籽縮合單寧亞基不含有EGC，末端亞基除C和EC外，還包括ECG。葡萄皮和籽縮合單寧相對(duì)含量最高的延伸亞基都為EC。

由表4可知， G3葡萄皮C延伸亞基、EGC延伸亞基和ECG延伸亞基的比例顯著低于CK(P<0.05)，G3葡萄籽ECG延伸亞基的比例顯著高于CK(P<0.05)，其他組分CK與G3間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。FIGUEIREDO-GONZLEZ等[27]對(duì)‘Garnacha Tintorera’葡萄的研究發(fā)現(xiàn)，末端亞基中C的比例最高(53%～61%)，EC(36%～42%)和ECG(1.3%～2.5%)次之。在延伸亞基中，EC的比例(63%～70%)最高，隨后是EGC(22%～27%)、C(6.5%～8.3%)和ECG(1.3%～2.5%)。

縮合單寧的平均聚合度(mean degree of polymerization，mDP)和沒(méi)食子?；潭葧?huì)影響澀感的質(zhì)量屬性。對(duì)模擬酒的研究發(fā)現(xiàn)，mDP 和沒(méi)食子酰化程度增加會(huì)增強(qiáng)縮合單寧的粗糙感和褶皺感[29]。如表4所示，干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄皮和籽的mDP沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。與CK相比，G3葡萄皮的沒(méi)食子?；潭蕊@著下降(P<0.05)，而干化處理對(duì)G3葡萄籽沒(méi)食子?；潭葲](méi)有顯著影響(P>0.05)。對(duì)‘黑比諾’和‘Garnacha Tintorera’葡萄的研究都觀察到干化過(guò)程中縮合單寧mDP下降[27, 30]?？傊?，干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄皮縮合單寧的影響程度高于葡萄籽，有助于改善馬瑟蘭葡萄酒的澀感質(zhì)量。

表4 干化處理對(duì)‘馬瑟蘭’葡萄縮合單寧組分的影響Table 4 Effect of postharvest dehydration on the condensed tannins fractions of‘Marselan’ grapes

3 結(jié)論

‘馬瑟蘭’葡萄采收后進(jìn)行27 d的干化處理，果實(shí)的還原糖、酒石酸和檸檬酸含量顯著提高(P<0.05)。單體花色苷含量顯著降低(P<0.05)，顏色穩(wěn)定的花色苷衍生物含量增加了36.23%，葡萄果皮縮合單寧的沒(méi)食子?；潭蕊@著下降(P<0.05)。干化處理提高了‘馬瑟蘭’葡萄的還原糖、有機(jī)酸、聚合花色苷含量和單寧品質(zhì)，本研究為干化技術(shù)的應(yīng)用和干化葡萄酒的釀造提供了理論依據(jù)。