通過發(fā)酵優(yōu)化提高大腸桿菌生產(chǎn)L-半胱氨酸產(chǎn)量

張博，史永吉，楊輝，吳梓丹，陳開，蔡雪，柳志強(qiáng)，鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310023)

半胱氨酸(cysteine，Cys)是生物體內(nèi)常見的硫源供體，其L型具有生物學(xué)活性。L-Cys是蛋氨酸、硫胺素以及谷胱甘肽等生物體內(nèi)常見物質(zhì)的重要組成成分[1]。L-Cys在細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝過程中起著重要作用，包括蛋白質(zhì)的折疊、修飾、催化活性的調(diào)節(jié)等[2]。此外，L-Cys可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[3]。作為生物體中一種重要氨基酸，L-Cys在醫(yī)藥、食品、化妝品和飼料行業(yè)中有廣泛應(yīng)用[4]。由于L-Cys活性巰基大量積累會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒性，因此制約了其作為發(fā)酵產(chǎn)物在微生物中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[5]。

L-Cys的生物合成途徑和調(diào)節(jié)機(jī)制已被廣泛研究。大腸桿菌(Escherichiacoli)[6]、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)[7]、菠蘿泛菌(Pantoeaanantics)[8]、卡式棘阿米巴氏菌(Acanthamoebacastellanii)[9]以及鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)[10]等均可以作為發(fā)酵菌株生產(chǎn)L-Cys。其中，以E.coli和C.glutamicum作為宿主菌最為常見。KAWANO等[11]研究發(fā)現(xiàn)E.coli中新的硫代硫酸鹽利用途徑，結(jié)合yciW基因的敲除，L-Cys 產(chǎn)量顯著提升[12-13]。NAKATANI等[6]通過過表達(dá)氧化還原蛋白NrdH、亞硫酸鹽還原酶CysI以及半胱氨酸合酶CysK提高L-Cys產(chǎn)量，降低了前體物質(zhì)S-磺基半胱氨酸(S-sulfo-L-cysteine,SSC)積累。NONAKA等[14]通過敲除主要的半胱氨酸降解酶YhaM,顯著改善了L-Cys的合成。YAMAZAKI等[15]發(fā)現(xiàn)了L-Cys轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YdjN在E.coli中參與SSC的轉(zhuǎn)運(yùn)，YdjN的表達(dá)受L-CysB調(diào)控。LIU等[16-18]利用代謝工程手段嘗試不同的模塊優(yōu)化組合，最終在1.5 L發(fā)酵罐中得到了8.34 g/L的L-Cys。

除代謝改造工程菌株以獲得高產(chǎn)菌株外，通過優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件來提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的方法也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前已有多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用于發(fā)酵過程的建模和優(yōu)化[19]。其中，響應(yīng)面分析方法較為成熟，其優(yōu)勢(shì)在于在多變量系統(tǒng)中能快速篩選關(guān)鍵因素，通過爬坡實(shí)驗(yàn)找到中心點(diǎn)附近位置以及整體連續(xù)考慮中心點(diǎn)附近的規(guī)律[20]。與傳統(tǒng)方法相比，即使對(duì)其中的作用過程知之甚少，通過響應(yīng)面法建立模型，測(cè)試不同變量之間的整體關(guān)系，也可得到最優(yōu)響應(yīng)值。

本研究以E.coliMCYS-7菌株為生產(chǎn)菌，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)培養(yǎng)基組分和濃度進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)，在2 L 發(fā)酵罐中優(yōu)化了發(fā)酵條件，結(jié)合外源添加甜菜堿、氨基酸等物質(zhì)，開發(fā)出了一條有效的L-Cys發(fā)酵工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

生產(chǎn)菌株為E.coliMCYS-7(保藏號(hào)為CCTCC NO.M 2019108)。

1.1.2 試劑與儀器

L-Cys等各類氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、維生素B1、3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)、4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯(4-chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride，CNBF)、甜菜堿，中國(guó)百靈威；氨芐青霉素，中國(guó)生工；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，上海生工；乙酸鈉，溫州吉翔化工有限公司；乙腈，Tedia 公司。除另有說明外，所有其他化學(xué)品和試劑均為分析純，并購自商業(yè)渠道。

Eppendorf AG紫外分光光度計(jì)、Thermo Scientific U3000超高壓高效液相色譜系統(tǒng)，德國(guó)賽默飛；Waters高效液相色譜系統(tǒng),美國(guó)沃特世；C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)，中國(guó)月旭；軌道培養(yǎng)箱搖床ZWYR-D2402，上海智域；2 L四聯(lián)微小型平行生物反應(yīng)器，上海迪必爾。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母提取物5,NaCl 10;基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L，硫酸銨 16 g/L，酵母粉 2 g/L，硫代硫酸鈉 2 g/L，蛋白胨 1 g/L，磷酸二氫鉀 1 g/L，鹽溶液 1 mL/L，維生素B15 mg/L，CaCO310 g/L；補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖 300 g/L，硫酸銨10 g/L，硫代硫酸鈉12.5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，鹽溶液 1 mL/L，維生素B15 mg/L。鹽溶液配制(g/L)：MnSO4·8H2O 5，MgSO4·7H2O 500，ZnSO45，F(xiàn)eSO4·7H2O 10。所有培養(yǎng)基均要加入100 mg/L的氨芐青霉素。

1.2 培養(yǎng)條件

1.2.1 搖瓶發(fā)酵

種子液的制備：從活化平板中將MCYS-7單菌落接種于10 mL LB試管，并在37 ℃和180 r/min條件下于軌道培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)12 h。

搖瓶發(fā)酵：接種量為5%，裝液量20 mL/500mL，30 ℃和180 r/min條件下培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行至6 h后添加0.9 mmol/L的IPTG，培養(yǎng)48 h。

1.2.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

一級(jí)種子液制備：見1.2.1。

二級(jí)種子液制備：取一級(jí)種子液1%(體積分?jǐn)?shù))，裝液量100 mL/500mL，30 ℃和180 r/min條件下于軌道箱中搖床培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵罐發(fā)酵：使用2 L四聯(lián)發(fā)酵罐，接種量為10%，裝液量1 L/2L，用50%(體積分?jǐn)?shù))NH3·H2O和1 mol/L H3PO4溶液自動(dòng)控制pH，培養(yǎng)溫度30 ℃，當(dāng)生長(zhǎng)至OD600=20左右時(shí)加入0.9 mmol/L的IPTG，通過控制攪拌槳轉(zhuǎn)速(0～800 r/min)以及通氣量[0～5 m3/(m3·min)]來維持溶解氧在30%以上，當(dāng)培養(yǎng)基初始的葡萄糖耗盡時(shí)，補(bǔ)料流加以維持發(fā)酵過程中葡萄糖質(zhì)量濃度在5 g/L以下。發(fā)酵過程中定期取樣檢測(cè)相關(guān)參數(shù)。

1.3 響應(yīng)面模型

響應(yīng)面分析是多因素建模分析的有效方法，可在多變量系統(tǒng)中快速篩選關(guān)鍵因素，通過爬坡實(shí)驗(yàn)找到中心點(diǎn)附近位置以及整體連續(xù)考慮中心點(diǎn)附近的規(guī)律。與傳統(tǒng)方法相比，即使對(duì)其中的作用過程知之甚少，通過響應(yīng)面法建立模型，測(cè)試不同變量之間的整體關(guān)系，也可得到最優(yōu)響應(yīng)值。

以預(yù)實(shí)驗(yàn)中篩選到的葡萄糖，硫酸銨，硫代硫酸鈉以及酵母粉作為重要影響因素，取葡萄糖質(zhì)量濃度38～46 g/L，硫酸銨質(zhì)量濃度7～9 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度5～7 g/L，硫代硫酸鈉質(zhì)量濃度5～7 g/L(表1)。

表1 Box-Behnken Design參數(shù)設(shè)計(jì)取值Table 1 The parameter values designed in Box-Behnken Design

以Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)制定實(shí)驗(yàn)方案，以帶有交互項(xiàng)的二次項(xiàng)模型進(jìn)行擬合，擬合如公式(1)所示：

(1)

式中:Y表示L-Cys的產(chǎn)量，g/L；A0表示模型截距；Bi是一次項(xiàng)線性因子系數(shù)；Bii是二次項(xiàng)線性因子系數(shù)；Bij是交互項(xiàng)線性因子系數(shù)；Xi、Xj是每個(gè)變量的水平。

1.4 分析方法

通過用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD600來表示細(xì)胞生長(zhǎng)情況。發(fā)酵液中的葡萄糖濃度使用DNS法進(jìn)行定量[21]。乙酸等常見有機(jī)酸使用高效液相色譜系統(tǒng)測(cè)定[8]。L-Cys和(L-Cys)2的含量通過超高壓高效液相色譜系統(tǒng)并配有C18反相色譜柱進(jìn)行檢測(cè)[22]，將兩者的總含量認(rèn)為是L-Cys含量[18]。無特殊說明，所有樣品均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，并選用平均值作為檢測(cè)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于響應(yīng)面的L-Cys優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 影響L-Cys產(chǎn)量的因素分析

Box-Behnken Design的結(jié)果如表2所示。表3顯示模型(P<0.05)有足夠的精度來預(yù)測(cè)L-Cys的產(chǎn)量，該模型下的失擬項(xiàng)的均方為0.014 2，在一定程度上表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值在允許偏差的范圍內(nèi)，另外，模型的F值為18.453，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果足夠顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有分析意義。

表2 Box-Behnken Design的結(jié)果 單位：g/L

表3 Box-Behnken Design結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 3 Statistical analysis of Box-Behnken Design results

2.1.2 基于響應(yīng)面法的回歸分析

將29個(gè)組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用多元回歸分析，建立回歸分析方程式：

L-Cys=+3.80-8.333E-003A-0.043B+0.23C+5.000E-003D-5.000E-003AB-5.000E-003AC-0.21AD+0.11BC+0.012BD+0.17CD-0.47A2-0.14B2-0.16C2-0.24D2

通過設(shè)置方程式的偏導(dǎo)數(shù)可以計(jì)算響應(yīng)值L-Cys的產(chǎn)量最大下的培養(yǎng)條件，具體表示為葡萄糖(42.69 g/L)、硫酸銨(7.77 g/L)、酵母粉(6.53 g/L)、硫代硫酸鈉(6.22 g/L)，其他成分：蛋白胨(1 g/L)、KH2PO4(1 g/L)、Na2HPO4·10H2O(2.5 g/L)、金屬鹽溶液(1 mL/L)。該條件下理論L-Cys的產(chǎn)量為3.74 g/L，實(shí)際發(fā)酵結(jié)果為3.85 g/L，兩者結(jié)果吻合度較高，證實(shí)了模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

圖1-a揭示了葡萄糖和硫酸銨影響L-Cys產(chǎn)量的變化過程，隨著兩者質(zhì)量濃度在其范圍內(nèi)升高，響應(yīng)值L-Cys質(zhì)量濃度表現(xiàn)為先上升再下降的趨勢(shì)，并且無明顯的傾斜。這種趨勢(shì)在圖1-b～圖1-d中也有類似體現(xiàn)。在圖1-d探究硫酸銨和酵母粉對(duì)L-Cys的影響中，圖形顯示等高線向低水平的酵母粉方向傾斜，表明在低水平的酵母粉濃度下，酵母粉成為其主要的影響L-Cys產(chǎn)量的因素，酵母粉成為此時(shí)的主要限制條件。類似的現(xiàn)象也可以在圖1-e和圖1-f中顯示。

2.2 在2 L發(fā)酵罐上的放大

根據(jù)搖瓶結(jié)果進(jìn)行發(fā)酵放大，在罐上發(fā)酵的結(jié)果并沒有如搖瓶中明顯提升。通過發(fā)酵測(cè)試，發(fā)現(xiàn)高濃度的葡萄糖會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生一定抑制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)菌體在罐上對(duì)硫源和氮源的利用能力進(jìn)一步提升，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，將葡萄糖質(zhì)量濃度降低至30 g/L，提升硫酸銨和硫代硫酸鈉質(zhì)量濃度均至10 g/L，酵母粉和蛋白胨的添加量參考LB培養(yǎng)基，分別為5 g/L和10 g/L，再進(jìn)行發(fā)酵放大。

2.2.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

發(fā)酵測(cè)試了不同發(fā)酵溫度下的L-Cys發(fā)酵過程特性，結(jié)果如圖2所示。從發(fā)酵過程曲線中可以看出，溫度是影響發(fā)酵結(jié)果的重要因素，26 ℃是生產(chǎn)L-Cys最適溫度?？傮w上來說，在研究范圍內(nèi)，發(fā)酵溫度越高，菌株產(chǎn)L-Cys的時(shí)間越提前；但當(dāng)溫度過低時(shí)，較低的發(fā)酵溫度會(huì)影響菌株的正常生長(zhǎng)并延緩發(fā)酵過程[23]。本研究中，當(dāng)發(fā)酵溫度低于26 ℃時(shí)，L-Cys 產(chǎn)量大幅下降，故選擇26 ℃作為發(fā)酵最適溫度，此時(shí)L-Cys產(chǎn)量可達(dá)6.13 g/L。

a-葡萄糖和硫酸銨對(duì)L-Cys產(chǎn)量影響；b-葡萄糖和酵母粉對(duì)L-Cys產(chǎn)量影響；c-葡萄糖和硫代硫酸鈉對(duì)L-Cys產(chǎn)量影響；d-硫酸銨和酵母粉對(duì)L-Cys產(chǎn)量影響；e-硫酸銨和硫代硫酸鈉對(duì)L-Cys產(chǎn)量影響；f-酵母粉和硫代硫酸鈉對(duì)L-Cys產(chǎn)量影響圖1 不同因素交互作用對(duì)L-Cys產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Effects of different factors on L-Cys yield in response surface studies

圖2 不同溫度對(duì)L-Cys發(fā)酵過程的影響Fig.2 The effects of different temperatures on L-Cys production

2.2.2 外源物質(zhì)的添加

在氨基酸發(fā)酵過程中，菌株一方面會(huì)自身合成所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另一方面會(huì)從外部攝取。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)自身合成困難或者無法合成時(shí)，外源添加是一個(gè)很好的添加策略[24-25]。故嘗試在罐上進(jìn)行外源物質(zhì)的添加，提高菌株發(fā)酵產(chǎn)L-Cys的能力。

2.2.2.1 甜菜堿的添加

甜菜堿是一種生物堿，化學(xué)名稱為1-羧基-N,N,N-三甲氨基乙內(nèi)酯，化學(xué)結(jié)構(gòu)與氨基酸相似，屬于季銨堿類物質(zhì)，且廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)。據(jù)報(bào)道，甜菜堿可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，保護(hù)細(xì)胞[26]。

發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，甜菜堿的添加對(duì)發(fā)酵來說有一定的作用。在添加2 g/L的甜菜堿之后，產(chǎn)量能夠達(dá)到7.12 g/L，相比于不添加的產(chǎn)量6.13 g/L來說，提高了16.2%。由于L-Cys具有一定細(xì)胞毒性，甜菜堿的添加可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓從而保護(hù)細(xì)胞，使更多的菌株在平臺(tái)期進(jìn)行L-Cys合成(添加甜菜堿的發(fā)酵過程中菌株OD600達(dá)到20的時(shí)間在30 h左右，相比于不添加甜菜堿的60 h提前了30 h左右)，進(jìn)而提高了L-Cys發(fā)酵產(chǎn)量。

a-不添加甜菜堿；b-添加甜菜堿圖3 外源添加2 g/L的甜菜堿對(duì)發(fā)酵的影響Fig.3 The effects of 2 g/L betaine addition on L-Cys fermentation

2.2.2.2 氨基酸的添加

氨基酸發(fā)酵過程中的多種菌株均為營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，因此氨基酸的外源添加有時(shí)候能夠起到加強(qiáng)主路代謝，增強(qiáng)產(chǎn)物合成的作用。有研究表明，添加其他必需氨基酸對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物氨基酸的發(fā)酵會(huì)有促進(jìn)作用[27]。

如圖4所示，通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)罐上添加1 g/L蛋氨酸、1 g/L蘇氨酸以及1 g/L異亮氨酸后，L-Cys發(fā)酵產(chǎn)量能達(dá)到10.25 g/L，與不添加氨基酸相比(7.12 g/L)提高了43.9 %。從發(fā)酵結(jié)果可以看出，添加氨基酸有效提高了發(fā)酵過程中菌體的OD600，在培養(yǎng)基自身具有氨基酸時(shí)，菌株會(huì)攝取環(huán)境中的氨基酸代替自身合成，結(jié)余的物質(zhì)、能量可能用于細(xì)菌生長(zhǎng)，因此平臺(tái)期OD600有一定程度的提高，在這種情況下，菌株更多的利用自身代謝進(jìn)行產(chǎn)物發(fā)酵，從而提升發(fā)酵產(chǎn)量[28]。

a-不添加3種氨基酸；b-添加3種氨基酸圖4 外源添加1 g/L蛋氨酸，1 g/L蘇氨酸，1 g/L異亮氨酸對(duì)L-Cys發(fā)酵的影響Fig.4 The effects of adding 1 g/L methionine, 1 g/L threonine, and 1 g/L isoleucine together on L-Cys fermentation

2.3 優(yōu)化前后相關(guān)參數(shù)的對(duì)比

文章中主要采用了響應(yīng)面的培養(yǎng)基優(yōu)化方法，以及發(fā)酵罐中外源添加的發(fā)酵策略，從一開始的發(fā)酵48 h產(chǎn)量為1.43 g/L，優(yōu)化到發(fā)酵罐最終放大的結(jié)果為47 h產(chǎn)10.25 g/LL-Cys。對(duì)其中相關(guān)參數(shù)計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的硫轉(zhuǎn)化效率，糖酸轉(zhuǎn)化率以及單位時(shí)間產(chǎn)量均有所提升。且優(yōu)化培養(yǎng)基成分后，丙酮酸和乙酸含量均下降。其中，丙酮酸為關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物，一方面，其為糖酵解途徑產(chǎn)物，維持細(xì)胞的正常代謝生長(zhǎng)，另一方面，在保證細(xì)胞正常代謝情況下，丙酮酸積累的下降有利于碳源流向L-Cys合成，從而有利于L-Cys生產(chǎn)。乙酸作為大腸桿菌生產(chǎn)中最常見的副產(chǎn)物，其濃度過高會(huì)抑制細(xì)胞的正常代謝，優(yōu)化后乙酸含量下降，降低了乙酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。相關(guān)參數(shù)輔助說明了優(yōu)化發(fā)酵條件后，使得更多的碳源和硫源流向L-Cys的合成，從而提高L-Cys的產(chǎn)量。具體參數(shù)變化見表4。

表4 優(yōu)化前后的L-Cys發(fā)酵結(jié)果Table 4 The results of L-Cys production before and after optimization

3 結(jié)論

在本研究中，利用響應(yīng)面分析方法，確定培養(yǎng)基成分為葡萄糖(42.69 g/L)、硫酸銨(7.77 g/L)、酵母粉(6.53 g/L)、硫代硫酸鈉(6.22 g/L)、蛋白胨(1 g/L)、KH2PO4(1 g/L)、Na2HPO4·10H2O (2.5 g/L)、金屬鹽溶液(1 mL/L)，維生素B1(5 mg/L)，CaCO3(10 g/L)，初始pH 7.0。優(yōu)化后搖瓶發(fā)酵L-Cys的產(chǎn)量較優(yōu)化前有大幅提高，達(dá)到3.85 g/L，較優(yōu)化前的1.43 g/L提高了169%；在2 L的發(fā)酵罐上，結(jié)合不同的外源添加策略，最終L-Cys產(chǎn)量在47 h最高，達(dá)到10.25 g/L，為實(shí)現(xiàn)L-Cys的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。