“秦氏疼痛方”外敷治療后肢急性軟組織損傷大鼠模型的實驗研究

馮宇 王莉 張妹妹 董宇啟 何荻 李鶴

下肢創(chuàng)傷骨折后伴發(fā)的急性軟組織腫脹嚴重影響骨折的后續(xù)治療，而目前臨床上的常規(guī)方法效果欠佳。炎癥反應已被證實是創(chuàng)傷后軟組織腫脹等早期并發(fā)癥的重要病理生理基礎。本研究選取的外用中藥經驗方“秦氏疼痛方”(以下簡稱“疼痛方”)，由全國著名中醫(yī)秦亮甫教授提供處方，由上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院中醫(yī)科研制，擬通過研究其抗炎作用和機制，為“疼痛方”治療急性軟組織損傷提供更有力的基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑及儀器

“疼痛方”(粉劑)：方中豨薟草、馬齒莧、防己3種藥共為君藥，黃柏、黃連、生石膏為臣藥，大黃、芒硝、延胡索為佐藥；生理鹽水(浙江天瑞藥業(yè)有限公司，批號為113021103)；扶他林乳劑(北京諾華制藥有限公司，批準文號為國藥準字H19990291)。

SPF級健康、雄性、2月齡SD大鼠40只(上海斯萊克實驗動物有限公司)，體質量(251.91±11.08)g，飼養(yǎng)于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，使用許可證號為SYXK(滬)2013-0058。

大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒(SIEMENS，德國)；BCA蛋白定量試劑盒(THERMO，美國)；抗大鼠IκBα抗體及NF-κB p65抗體(CST，美國)。

組織研缽(上海艾雙商貿公司)；恒溫水浴箱(上海方瑞醫(yī)療器械廠)；低溫高速離心機(EPPENDORF，德國)；Cobas e601自動生化分析儀(Roche，德國)；BNII特定蛋白分析儀(SIEMENS，德國)；PCR儀(Perkin Elmer，美國)；Western-blot電泳設備(BIO-RAD，美國)；超純水儀(Thermo Fisher，美國)；標準規(guī)格酶標儀(ThermoFisher，美國)；超聲清洗器(Cole-Parmer，美國)；酶聯免疫檢測儀(BioTek，美國)；臺式水平離心機(EPPENDORF，美國)；臺式離心機(Coie-Parmer，美國)；渦旋振蕩儀(IKA MS2，德國)；實時定量PCR儀(Roche，美國)；多頭磁力加熱攪拌器(鄭州盛達儀器有限公司)；紫外/可見光光度計(NanoDrop，美國)；ELISA檢測試劑盒(R&D，美國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

成年雄性SD大鼠共40只，隨機分組，正常對照組(正常組)10只，另外30只制作急性軟組織壓榨傷大鼠模型后隨機分為模型對照組(模型組)10只、扶他林乳劑對照組(扶他林組)10只以及“疼痛方”治療組(疼痛方組)10只。

1.2.2 實驗動物麻醉與造模

硫化鈉(8%)麻醉成功后，使用自制軟組織損傷擊打器建立SD大鼠急性軟組織壓榨傷模型，軟組織壓榨傷模型制備參照文獻[1]的方法。造模后，肉眼觀察并查體。擊打后左后肢出現腫脹、青紫、瘀血，但無皮膚破損，單側左后肢跛行，無其他異常情況發(fā)生，確認造模成功。

1.2.3 實驗藥物的用藥途徑、方法

造模后6 h開始給藥。正常組、模型組給予常溫生理鹽水紗布濕敷，環(huán)繞覆蓋整個左后肢，每次濕敷2 h，間隔10 h后重復1次，共2～4次；扶他林組給予扶他林乳劑外涂于整個左后肢，厚度約3 mm，每次2 h，后用生理鹽水洗凈，間隔10 h重復1次，共2～4次；疼痛方組給予中藥“疼痛方”粉劑，用適量生理鹽水調成糊狀外敷于整個左后肢，厚度約3 mm，每次2 h，后用生理鹽水洗凈，間隔10 h重復1次，共2～4次。

1.2.4 取材與標本制備

本實驗分別于造模后24、48 h，各組取5只SD大鼠進行斷頸處死，在造模局部用手術尖刀快速輕柔割取少量肌肉組織(注意需要沿肌肉纖維走行方向割取，避免對組織標本過度擠壓、夾提、揉攪等)，置于液氮保存。

1.3 試驗指標檢測與方法

1.3.1 大鼠損傷部位組織勻漿的制備與相關炎癥因子表達評估

用電子分析天平稱取已割取的軟組織損傷局部肌肉組織標本，剪碎后勻漿，用低溫高速離心機離心，收集上清液，采用雙抗體夾心ELISA法定量測定IL-1β、IL-6、TNF-α。用酶標儀在450 nm波長下測定光密度(OD)值，通過標準曲線計算樣品濃度。

1.3.2 大鼠損傷部位組織RNA、蛋白的提取以及損傷修復相關基因、蛋白的表達評估

組織勻漿后采用Trizol法提取RNA，用分光光度計檢測總RNA濃度和OD值，定量PCR在ABI 7500實時定量PCR儀中檢測，以聚合酶SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行。PCR循環(huán)條件如下：94 ℃變性10 s→60 ℃退火20 s→72 ℃復性延伸30 s，40個循環(huán)。重復3次，取均值。采用2-ΔΔCT計算方法計算目的基因相對表達量。引物序列：IL-1β，TAGCAGCTTTCGACAGTGAGG(F)、CTCCAC GGGCAAGACATAGG(R)；IL-6，CCCACCAGGAACG AAAGTCA(F)、TGCCATTGCACAACTCTTTTC(R)；TNF-α，GTAGCCCACGTCGTAGCAAA(F)、AAATGGC AAATCGGCTGACG(R)；NF-κB p65，GCACCCCACC ATCAAGATCAAT(F)、TCTGGATGCGCTGGCTAATG(R)。

用RIPA裂解液提取組織蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。蛋白通過SDS-PAGE分離，轉移到PVDF膜，一抗(抗大鼠IκBα抗體及NF-κB p65抗體)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后，二抗室溫震蕩1 h，再次洗滌后，在Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)中掃描。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 損傷組織局部IL-1β表達水平

正常SD大鼠肌肉組織中IL-1β含量24 h和48 h檢測值分別為(2.13±0.11) pg/mL和(2.08±0.13) pg/mL。造模成功后，模型組SD大鼠肌肉組織中IL-1β含量24 h和48 h檢測值分別為(4.42±0.42) pg/mL和(3.91±0.26) pg/mL，顯著高于正常組大鼠(P<0.05)，且組內比較顯示，48 h時IL-1β的含量較24 h有所降低，提示組織損傷的自我修復作用，炎癥水平有所控制。扶他林組大鼠肌肉組織中IL-1β含量24 h和48 h檢測值分別為(3.26±0.41) pg/mL和(3.1±0.11) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示扶他林能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放。疼痛方組大鼠肌肉組織中IL-1β含量24 h和48 h檢測值分別為(2.97±0.26) pg/mL和(2.36±0.17) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示“疼痛方”能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放；同時也低于扶他林組IL-1β水平，提示“疼痛方”在控制炎癥因子釋放、對軟組織損傷的緩解作用方面一定程度上優(yōu)于扶他林(圖1)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖1 組織IL-1β水平的比較Fig.1 Comparison of IL-1β levels in tissue

2.2 損傷組織局部IL-6表達水平

正常SD大鼠肌肉組織中IL-6含量24 h和48 h檢測值分別為(3.11±0.46) pg/mL和(3.03±0.58) pg/mL。造模成功后，模型組SD大鼠肌肉組織中IL-6含量24 h和48 h檢測值分別為(49.63±4.37) pg/mL和(53.87±4.23) pg/mL，顯著高于正常組大鼠(P<0.05)，且組內比較顯示，48 h時IL-6的含量較24 h有所升高。扶他林組大鼠肌肉組織中IL-6含量24 h和48 h檢測值分別為(32.62±4.12) pg/mL和(38.21±4.20) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示扶他林能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放。疼痛方組大鼠肌肉組織中IL-6含量24 h和48 h檢測值分別為(29.67±3.16) pg/mL和(31.56±4.09) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示“疼痛方”能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放；同時也低于扶他林組IL-6水平，提示“疼痛方”在控制炎癥因子釋放、對軟組織損傷的緩解作用方面一定程度上優(yōu)于扶他林(圖2)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖2 組織IL-6表達水平的比較Fig.2 Comparison of IL-6 levels in tissue

2.3 損傷組織局部TNF-α表達水平

正常SD大鼠肌肉組織中TNF-α含量24 h和48 h檢測值分別為(23.38±1.17) pg/mL和(22.73±1.16) pg/mL，造模成功后，模型組SD大鼠肌肉組織中TNF-α含量24 h和48 h檢測值分別為(59.84±5.98) pg/mL和(63.18±5.79) pg/mL，顯著高于正常組大鼠(P<0.05)，且組內比較顯示，48 h時IL-6的含量較24 h有所升高。扶他林組大鼠肌肉組織中TNF-α的含量24 h和48 h檢測值分別為(31.57±1.59) pg/mL和(36.41±3.24) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示扶他林能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放。疼痛方組大鼠肌肉組織中TNF-α含量24 h和48 h檢測值分別為(28.35±1.66) pg/mL和(27.96±1.25) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示“疼痛方”能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放；同時也低于扶他林組TNF-α水平，提示疼痛方在控制炎癥因子釋放，對軟組織損傷的緩解作用方面一定程度上優(yōu)于扶他林(圖3)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖3 大鼠組織局部TNF-α水平的比較Fig.3 Comparison of TNF-α levels in tissue

2.4 組織急性損傷期局部特異性基因及蛋白表達水平改變

本研究中，將48 h時的肌肉組織勻漿，提取組織中RNA，利用RT-PCR定量檢測軟組織中mRNA含量，以反映損傷軟組織的各炎癥因子的基因表達水平。48 h時模型組SD大鼠肌肉組織中IL-1β、IL-6、TNF-a和NF-κB p65定量檢測顯示mRNA水平均不同程度高于其他各組，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。疼痛方組48 h時大鼠肌肉組織中IL-1β、IL-6、TNF-a和NF-κB p65基因表達量均顯著低于模型組(P<0.05)；同時除了NF-κB p65之外，也在一定程度上低于扶他林組mRNA水平，提示疼痛方能夠在分子基因水平抑制炎癥因子的合成釋放，降低炎癥水平，減少組織損傷，并在一定程度上優(yōu)于扶他林(圖4)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖4 組織急性損傷期局部特異性基因表達水平改變Fig.4 Changes in local specific gene expression levels during acute tissue injury

NF-κB是參與炎癥反應調控的關鍵性信號通路。其活性主要受上游IκBα磷酸化降解水平影響，被激活后釋放下游核蛋白亞基入核，結合特定DNA序列發(fā)揮促轉錄翻譯作用，其中以p65最為重要。本研究發(fā)現，模型組的IκBα蛋白水平顯著降低(P<0.05)，提示其磷酸化水平增高，降解增多。而扶他林組和疼痛方組的IκBα水平顯著高于模型組(P<0.05)，磷酸化進程被顯著抑制，提示“疼痛方”具有抑制IκBα磷酸化降解，進而抑制NF-κB活化的作用。此后，進一步觀察了NF-κB下游核蛋白p65的表達情況，發(fā)現扶他林乳劑和“疼痛方”確實能夠減少細胞核內p65的蛋白水平，提示p65釋放減少，轉錄入核水平降低。進一步證實了“疼痛方”與扶他林乳劑均具有抑制NF-κB信號通路的生物學作用(圖5)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖5 組織急性損傷期局部特異性蛋白表達水平改變Fig.5 Changes in local specific protein expression levels during acute tissue injury

3 討論

軟組織損傷(Soft tissue injury)是臨床多發(fā)病，是指因急性外傷或慢性勞損或其他原因導致的皮膚、肌肉、肌腱、關節(jié)囊及神經等組織的病理損傷，但不包括骨骼病變[2]。急性軟組織損傷通常由于外部打擊(如撞擊、碾壓)等引起，出現局部腫脹、淤青、疼痛、功能障礙等癥狀。其主要病理變化為創(chuàng)傷性無菌性炎癥，其主要特征在于局部組織壞死、毛細血管擴張、炎癥細胞浸潤、局部水腫和出血等。

目前，藥物對急性軟組織損傷的抗炎作用評估，絕大多數是使用動物急性軟組織鈍擊損傷模型[1,3-4]，具有造模成功率高、方法簡單、造模時間短等優(yōu)點[5]。盡管該模型的病因與臨床急性軟組織損傷的病因不同，但由于其病理學和臨床病理學表現相似，因此仍被認為是可靠的急性軟組織損傷模型。本研究中，我們使用自制軟組織損傷擊打器，建立成年雄性SD大鼠急性軟組織壓榨傷模型，以模擬臨床急性軟組織損傷的發(fā)生，并評估“疼痛方”對這種損傷的療效。另外，扶他林乳劑通常用于治療臨床上的急性和慢性軟組織損傷，因此我們使用扶他林乳劑作為陽性對照藥物來評估“疼痛方”治療急性軟組織損傷的療效。

急性軟組織損傷主要病理基礎為創(chuàng)傷性無菌性炎癥，其中炎癥細胞在其發(fā)病機制中起重要作用。創(chuàng)傷性損傷早期釋放自由基，其隨后破壞局部組織中的細胞。炎癥細胞釋放許多炎癥介質，包括IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等，可進一步加劇炎癥細胞的黏附聚集以及炎癥因子的釋放，同時激活新的炎癥反應。在復雜的炎性反應中，IL-1β是整個炎癥持續(xù)進展中一直存在的炎性因子， TNF-α是眾多炎性因子中最先釋放分泌的促炎前因子，可導致多種生化作用，如刺激集落刺激因子、血小板生長因子等細胞因子的產生和使T細胞產生IL-2等，從而形成瀑布式炎癥級聯反應[6-9]。IL-6促進嗜中性粒細胞活化和聚集，其水平可反映組織損傷的強度[10-12]。

近年來的研究已經證明，NF-κB在炎癥反應中具有關鍵和核心的調控作用，是調控轉錄多種炎性因子的中心環(huán)節(jié)和共同通路[13]。NF-κB的活化可以誘導促炎因子(如TNF-α、IL-6和IL-1β)、趨化因子、黏附分子(如ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1)以及一些與炎癥級聯放大相關的酶(如iNOS和COX-2)的基因表達，控制它們的生物合成，進而趨化大量的中性粒細胞等炎性細胞浸潤、聚集到炎癥部位，最終導致炎癥反應[14-15]?；罨腘F-κB是一個同源或者異源二聚體，均由NF-κB/Rel家族成員組成，具有與靶基因增強子的特定序列(5′-GGGACHTCC-3′)結合并促進轉錄的能力，而通常所說的NF-κB指的即是p65∶p50復合體。NF-κB激活的經典過程為其與抑制因子IκB家族成員結合，當上游信號導致IκB蛋白的磷酸化并降解時，NF-κB就被釋放出來并向核內遷移，激活靶基因的轉錄。已有研究證實，NF-κB信號通路參與了創(chuàng)傷后軟組織損傷的炎癥反應。炎性因子可激活多種細胞內信號分子，如NF-κB，從而觸發(fā)相關基因的表達。在急性軟組織損傷期間，炎癥細胞通過NF-κB途徑參與早期炎癥的各種促炎細胞因子和蛋白酶的分泌。在本項研究中，急性軟組織損傷模型組的NF-κB p65基因水平升高。而扶他林和“疼痛方”的治療均可降低NF-κB p65的基因表達水平，據此我們推測“疼痛方”可抑制組織的NF-κB信號通路，進一步的Western blot檢測結果同樣表明，“疼痛方”的作用可能與NF-κB信號通路的抑制有關。