石墨烯泡沫支架緩釋netrin-1促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的研究

廉潔 秦金保 祝聯(lián)

糖尿病患者創(chuàng)面難以愈合是臨床常見且較為棘手的問題。若得不到及時(shí)有效的治療，會(huì)出現(xiàn)進(jìn)一步的創(chuàng)傷性感染、骨髓炎等[1]。糖尿病血管病變是其主要原因，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括高血糖導(dǎo)致糖基化終產(chǎn)物的形成、氧化應(yīng)激反應(yīng)等。

研究表明，再生支架是促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)的可行方法。明膠-甲基丙烯胺(GelMA)結(jié)合了天然和合成水凝膠的特點(diǎn)，已被證實(shí)是一種很有前途的三維組織構(gòu)建支架材料[2]。然而，由于GelMA的生物力學(xué)性能和抗菌性能較差，其在創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。石墨烯具有優(yōu)異的力學(xué)性能、熱學(xué)性能、導(dǎo)電性和生物相容性，以石墨烯為基質(zhì)的支架可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、相互作用和細(xì)胞遷移，如人胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等[3]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯泡沫能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的遷移、增殖和分化[4]。研究表明，石墨烯在體內(nèi)通過中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶溶解，經(jīng)腎臟排泄清除，具有良好的生物降解性[5]。

血管再生是糖尿病創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)鍵。神經(jīng)軸突導(dǎo)向生長(zhǎng)因子-1(netrin-1)被認(rèn)為是一種有前途的促血管再生的細(xì)胞因子。研究顯示，netrin-1 通過下游分子通路增加NO的生成，減少氧自由基的產(chǎn)生，防止內(nèi)皮功能受損，并能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移，促進(jìn)血管生成[6]。

我們之前利用化學(xué)氣相沉積(CVD)法制備石墨烯泡沫支架并填充水凝膠GelMA，利用藻酸鹽對(duì)水凝膠進(jìn)行滲透，并通過雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)改善凝膠的力學(xué)性能，同時(shí)負(fù)載netrin-1，使其滲透到雜化水凝膠中達(dá)到緩釋目的[4]。本研究中，我們對(duì)搭載netrin-1的石墨烯泡沫水凝膠支架在糖尿病大鼠創(chuàng)面中的療效進(jìn)行研究，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只6～8周齡GK大鼠，體質(zhì)量約200 g，雌雄不限；10只雄性BALB/c裸鼠，6周齡(南京君科生物工程有限公司)。

實(shí)驗(yàn)材料：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系，內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(上海中喬新舟生物科技有限公司)；兔抗細(xì)胞角蛋白(CK19)多克隆抗體(Santa Cruz，美國)；磷酸緩沖液，Matrigel凝膠，Gelatin(Sigma，美國)；鎳網(wǎng)(常州康威醫(yī)療器械有限公司)；CCK8試劑(Abcam，英國)。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(hUVECs)的復(fù)蘇和傳代

快速在37 ℃水浴槽中解凍hUVEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至生物安全柜。在15 mL離心管中添加9 mL內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，逐滴加入hUVEC細(xì)胞，輕柔混勻，1 500 r/min離心5 min。棄上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，接種至培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2和95%濕度條件下培養(yǎng)細(xì)胞，次日更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，進(jìn)行傳代。

1.3 皮膚支架的制備及生物相容性檢測(cè)

制備方法參考文獻(xiàn)[4]。首先合成石墨烯/鎳網(wǎng)片，接著合成GelMA和雜化水凝膠前體溶液，最后通過紫外照射和離子化促進(jìn)水凝膠支架的快速固化。4 ℃時(shí)，將合成的石墨烯泡沫水凝膠皮膚支架置于含100 ng/mL netrin-1的PBS溶液中15 min，使水凝膠成分充分吸收netrin-1，形成具有緩釋功能的netrin-1+石墨烯泡沫水凝膠皮膚支架。

雄性BALB/c裸鼠10只，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組將直徑1 cm的支架植入裸鼠背部，對(duì)照組小鼠注射相同體積的PBS溶液。術(shù)后2周切取支架及周圍皮膚進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)觀察損傷及炎癥情況(圖1)。

圖1 石墨烯泡沫水凝膠支架大體觀察(左，標(biāo)尺=500 μm)和裸鼠皮下植入術(shù)(右，標(biāo)尺=500 μm)Fig.1 Gross observation of graphene foam gel scaffold (Left, scale bar=500 μm) and subcutaneous implantation of scaffold in nude mice (Right, scale bar=500 μm)

1.4 支架材料的細(xì)胞毒性檢測(cè)

將石墨烯泡沫水凝膠支架和荷載netrin-1的石墨烯泡沫水凝膠支架分別剪成直徑≤5 mm的片狀顆粒，4 ℃浸泡于DMEM溶液24 h，分別收集提取兩種浸出液，以DMEM為對(duì)照組，分別與100 μL的hUVECs共孵育于96孔板中。24 h、48 h和72 h后采用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞光密度值。

1.5 大鼠皮膚缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)

選用30只GK大鼠，建立糖尿病大鼠皮膚缺損模型后分為3組：空白對(duì)照組(n=10)、支架組(n=10)和支架+netrin-1組(n=10)。支架+netrin-1組：大鼠背部手術(shù)，形成直徑10 mm全層皮膚缺損，將負(fù)載netrin-1的支架材料移植覆蓋于創(chuàng)面，材料上覆蓋硅膠膜，并縫合固定于創(chuàng)面周圍皮膚，避免移位；支架組：將單獨(dú)的支架材料移植覆蓋于創(chuàng)面；空白對(duì)照組：不給予創(chuàng)面特殊處理。術(shù)后第3、7、14天觀察各組動(dòng)物的創(chuàng)面愈合情況。術(shù)后第7、14天每組分別取材5只大鼠，HE染色觀察組織學(xué)變化，Masson染色觀察膠原合成情況，CK19免疫組化染色觀察上皮細(xì)胞生成情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 石墨烯水凝膠皮膚支架具有良好的生物相容性和低生物毒性

HE染色顯示支架材料周圍組織在細(xì)胞密度、支架降解以及膠原形成和排列方面與對(duì)照組無明顯差異。植入支架的小鼠皮膚未見明顯的組織損傷和炎癥改變，說明該支架具有良好的生物相容性。CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，24 h時(shí)3組細(xì)胞增殖無明顯差異；48 h時(shí)支架組和支架+netrin-1組的細(xì)胞增殖明顯優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)，且這2組間未見明顯差異；72 h時(shí)支架+netrin-1組細(xì)胞增殖明顯優(yōu)于其他兩組(P<0.05)，而支架組和對(duì)照組之間無明顯差異。說明支架具有較低的生物毒性(圖2、3)。

A：對(duì)照組；B：實(shí)驗(yàn)組A: Control group; B: Experimental group圖2 支架材料植入裸鼠皮膚2周后HE染色(標(biāo)尺=200 μm)Fig.2 HE staining was performed 2 weeks after the scaffold was implanted into the skin of nude mice (scale bar=200 μm)

圖3 石墨烯泡沫水凝膠支架材料的生物毒性檢測(cè)(**： P<0.01)Fig.3 Toxicity test of graphene foam hydrogel scaffold (**: P<0.01)

2.2 Netirn-1/石墨烯水凝膠支架通過增加血管生成，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合

術(shù)后第3天時(shí)，各組之間創(chuàng)面大小無明顯差異，表面覆蓋分泌物，其中支架+netrin-1組的創(chuàng)面較其他組基底更紅潤，表面分泌物較少。術(shù)后第7天時(shí)，所有創(chuàng)面均已結(jié)痂，支架組和支架+netrin-1組出現(xiàn)部分上皮化，其中支架+netrin-1組上皮化程度明顯優(yōu)于支架組。術(shù)后第14天時(shí)，支架組和支架+netrin-1組的水凝膠脫落，支架+netrin-1組創(chuàng)面面積最小，皮膚縫隙關(guān)閉較其他組更好，空白對(duì)照組仍殘余部分痂皮未脫落(圖4)。

圖4 各組創(chuàng)面第3、7、14天時(shí)的大體觀察(標(biāo)尺=50 μm)Fig.4 Gross observation of wound in each group 3, 7 and 14 days after implantation (scale bar=50 μm)

HE染色顯示，術(shù)后第3、7天時(shí)，支架+netrin-1組的上皮化程度和真皮再生的厚度均明顯優(yōu)于其他組，炎癥反應(yīng)和瘢痕殘留均較其他組減輕(圖5)。

圖5 各組創(chuàng)面第7、14天時(shí)的H&E染色(標(biāo)尺=50 μm)Fig.5 HE staining of wound in each group 7 and 14 days after implantation (scale bar=50 μm)

Masson染色顯示，術(shù)后第7、14天時(shí)，支架+netrin-1組的真皮膠原沉積量明顯大于另外2組，提示netrin-1可能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的膠原合成和增加了細(xì)胞外基質(zhì)沉積(圖6)。

圖6 各組創(chuàng)面第7、14天時(shí)的Masson染色(標(biāo)尺=200 μm)Fig.6 Masson staining of wound in each group 7 and 14 days after implantation (scale bar=200 μm)

CK19指細(xì)胞角蛋白19片段，是上皮細(xì)胞的特征性蛋白組分，在多種正常上皮組織中存在。為了進(jìn)一步驗(yàn)證創(chuàng)面上皮化的程度，我們進(jìn)行了CK19的免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，支架+netrin-1組表皮厚度明顯大于其他2組，支架組的上皮厚度明顯大于對(duì)照組，提示石墨烯泡沫水凝膠支架或者netrin-1可能促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的遷移和增殖，有利于創(chuàng)面愈合(圖7)。

圖7 各組創(chuàng)面第7、14天時(shí)CK19免疫組化染色(標(biāo)尺=200 μm)Fig.7 CK19 immunohistochemical staining of wound in each group 7 and 14 days after implantation (scale bar=200 μm)

3 討論

目前已報(bào)道的用于糖尿病創(chuàng)面皮膚修復(fù)的支架材料，包括天然和人工合成支架，存在黏附性差、韌性不足及生物相容性不高等缺點(diǎn)，在臨床中通常不被推薦使用[7]。石墨烯的優(yōu)異機(jī)械性能使其在蝕刻鎳后仍能保持其形狀，起到增強(qiáng)支架形態(tài)作用。石墨烯支架的韌性與皮膚相似，彌補(bǔ)了單純水凝膠支架力學(xué)性能較差的缺點(diǎn)，并且石墨烯水凝膠支架的緩釋特性適宜搭載促進(jìn)愈合的生物因子應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)。有研究將氧化石墨烯與經(jīng)過改性的膠原-殼聚糖復(fù)合膜結(jié)合制備復(fù)合生物膜，其上負(fù)載堿性FGF，用于修復(fù)創(chuàng)面。這種新型藥物傳送系統(tǒng)，可避免藥物在體外和體內(nèi)應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)突釋，過早喪失生物活性，可明顯促進(jìn)皮膚缺損修復(fù)[8]。

近年來，干細(xì)胞和血管營養(yǎng)因子被用于提高皮膚再生的效率。netrin-1是一種神經(jīng)軸突導(dǎo)向生長(zhǎng)因子，其結(jié)構(gòu)高度保守，目前已知的家庭成員有netrin-1～4，其受體主要有結(jié)腸癌缺失蛋白(DCC)和不協(xié)調(diào)蛋白5(UNC5)。在糖尿病相關(guān)研究中，netrin-1的功能比較突出，可通過DCC-ERK1/2通路增加NO的生成，減少氧自由基的產(chǎn)生，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的功能；另外，由于內(nèi)皮細(xì)胞成管與VEGF相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)，不同濃度的netrin-1 可以激活或抑制VEGF信號(hào)通路。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，netrin-1的作用具有濃度依賴性，在100 ng/mL的緩釋濃度下，netrin-1可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成管和RSC96神經(jīng)細(xì)胞的遷移[4]。

本研究以石墨烯水凝膠支架負(fù)載netrin-1修復(fù)糖尿病創(chuàng)面，石墨烯泡沫支架具有抗炎作用，水凝膠可以緩釋netrin-1促進(jìn)血管形成，這兩者都是糖尿病創(chuàng)面修復(fù)的重要因素。研究結(jié)果顯示，石墨烯的生物相容性高且細(xì)胞毒性較低；進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，netirn-1/石墨烯泡沫水凝膠支架治療后，創(chuàng)面組織中血管密度和細(xì)胞外基質(zhì)增加，上皮化程度高。因此，netirn-1/石墨烯水凝膠支架可通過血管再生和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的愈合。