低磷脅迫對烤煙根系有機酸含量及土壤磷酸酶活性的影響

肖如武，黃楚龍，宗釗輝，王 維，趙偉才，王 軍

（1.廣東中煙工業(yè)責任有限公司，廣東 廣州 510599；2.深圳煙草工業(yè)責任有限公司，廣東 深圳 518109；3.廣東省煙草南雄科學研究所/廣東省煙草育種與綜合利用工程技術研究中心，廣東 韶關 512400；4.華南農業(yè)大學農學院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】磷是煙草生長發(fā)育必需營養(yǎng)元素之一，是核酸、核苷酸、磷脂等物質的重要組成元素，參與烤煙光合作用與呼吸作用，對烤煙體內糖、蛋白質、脂肪的代謝具有重要的調控作用［1-2］。土壤有效磷含量低時，烤煙蛋白質合成受阻，代謝活動紊亂，表現(xiàn)為生長緩慢，植株矮小，調制后煙葉油分少，顯著影響煙葉產質量［3-4］。我國主要煙區(qū)土壤全磷含量在0.3～2.5 g/kg之間，能被烤煙直接吸收的有效磷占比不到5%［5-8］，不能滿足烤煙正常生長發(fā)育所需。生產上主要通過外施磷肥來解決土壤有效磷缺乏的問題，但由于土壤的固化與肥料的流失，磷肥利用率不到25%。為了提高產量，往往過量施用磷肥，加速了磷礦資源的枯竭，土壤磷素盈余越來越多，磷素流失的同時也引起水體富營養(yǎng)化的生態(tài)問題。因此，探討煙葉生產中磷素缺乏對烤煙根系有機酸含量與土壤磷酸酶活性的影響，對指導煙葉生產磷素施用具有重要意義。

【前人研究進展】根系是作物與土壤互作的器官，低磷脅迫下，根系合成與分泌根系分泌物能力加強，同時作物通過感受根系分泌物濃度的變化，反饋調節(jié)作物地下部與地上部的生長［9-10］。前人研究發(fā)現(xiàn)紫云英［11］、大豆［12］、堅果［13］等根系分泌物能有效活化土壤難溶性無機磷與有機磷，提高土壤與根際磷酸根離子含量進而促進植物對土壤磷素的吸收利用。有機酸是根系分泌物的主要成分，章愛群［14］進行有機酸對土壤難溶性無機磷的活化研究，發(fā)現(xiàn)有機酸含量與土壤難溶性無機磷活化效果以及磷酸根離子含量呈正相關，通過與難溶性磷酸鹽膠體中的正價金屬離子螯合，同時有機酸中的H+能酸化根際土壤，提高難容性磷酸鹽的溶解度，釋放磷酸根從而改善作物磷素營養(yǎng)。肖曉明等［15］研究發(fā)現(xiàn)澳洲堅果在減少50%正常施磷量條件下生長良好，主要原因是澳洲堅果的排根能分泌大量的酸性磷酸酶，通過活化外源dNTP、DNA、ADP和6-磷酸果糖等有機磷，釋放出磷酸根離子，實現(xiàn)對土壤磷營養(yǎng)的改良。沈宏等［16］在對不同作物低磷脅迫下的自我調節(jié)機制研究表明，在低磷脅迫下，作物通過提高根冠比、增加次生根數量、刺激根毛生長提高根系有機酸合成能力與酸性磷酸酶活性，適應低磷脅迫，提高磷肥利用率?？梢?，在低磷脅迫時，作物通過調節(jié)根系分泌物的合成和釋放，活化土壤難溶性無機磷與有機磷，提高磷素利用率。

【本研究切人點】當前部分作物（水稻、小麥、大豆等）在低磷脅迫下，對土壤難溶性磷活化、吸收機理研究已有相關報道。而關于烤煙低磷脅迫下，烤煙根系分泌物對土壤磷素的活化利用研究鮮有報道，因此開展低磷脅迫對烤煙根系分泌物與磷素利用研究十分必要?！緮M解決的關鍵問題】通過設置3個不同施磷水平，測定烤煙根系分泌的有機酸種類與磷酸酶活性，探索其與土壤難溶性磷的關系，為后續(xù)生產磷肥施用提高科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年在華南農業(yè)大學農場進行盆栽試驗，盆高34.5 cm，上口徑37.5 cm，底徑28.5 cm，盆栽用土取自華南農業(yè)大學農場試驗田0～20 cm耕作層土壤，田土曬干、敲碎，撿去雜物，過篩，每盆裝土20 kg。土壤類型為砂泥田土，土壤有機質2.87%、全氮1.73 g/kg、全磷0.44 g/kg、全鉀28.43 g/kg，速效氮89.32 mg/kg、速效磷18.37 mg/kg、速效鉀124.65 mg/kg。

供試烤煙品種為云煙87。

1.2 試驗方法

試驗設置3種不同施磷水平，用量分別為0 g/株（P1）、4 g/株（P2）、8 g/株（P3），各處理N施用量均為8 g/株，K2O施用量為20 g/株，氮、磷、鉀肥采用分析純硝酸銨、磷酸二氫鈉和硫酸鉀。每個處理20盆/株，按行距1.2 m、株距0.6 m進行擺盆，各處理隨機區(qū)組排列，避免因光照、通風等環(huán)境因素造成誤差。采用濕潤育苗的方法進行育苗，4葉1心時進行移栽，定時滴灌裝置補充水分，每天16：00～20：00進行澆水，滴灌速度0.5 L/h，根據天氣與烤煙水分需求，適當提高或降低滴灌速度，確保土壤全部浸濕。在盆底放置底座，避免烤煙根系扎入土。其他農事操作與病蟲害管理參考優(yōu)質煙葉生產管理要求進行。

在烤煙移栽后25、40、55、70、85 d測定土壤全磷與速效磷含量。在團棵期、旺長中期、現(xiàn)蕾期取樣，測定根系有機酸分泌物含量、烤煙磷含量與磷濃度，同時測定土壤磷酸酶活性。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 土壤理化特性 土壤理化性質的測定均參照《土壤農化分析》（鮑士旦，2013）中的有關方法。在烤煙移栽后25、40、55、70、85 d取盆栽土壤樣品，土壤全磷用氫氧化鈉熔融—鉬銻抗比色法測定，土壤有效磷用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定。土壤磷素表觀盈余量（g/株）＝施磷量－植株吸磷量。

1.3.2 根系有機酸組成與含量 準備直徑5 mm的層析濾紙片若干，用甲醇清洗3次，再用重蒸水清洗3次，在無菌條件下曬干備用。挑選3株生長一致的烤煙從盆缽中取出、洗凈泥士，將根系在去離子水中清洗數次，以除去表面的營養(yǎng)養(yǎng)分，然后將根系平放于鋪有濕濾紙的瓷盤中，在每個植株上選取生長相近的5～10個二級側根的根尖收集部位，在有機酸收集部位（根尖）的下方墊上2 cm×2 cm的塑料膠片，然后再在收集部位根組織的上下方各放1個預先處理好的層析濾紙片；其余根段用營養(yǎng)液浸濕的濾紙片覆蓋；最后用黑塑料布將整個根系罩住，在光照下收集2 h后，將每個植株不同部位的濾紙片放入2.50 mL Ependorf 管中，每10個濾紙片加300 mL重蒸水放入液氮中保存。測定前將其溶解，12 000 r/min離心10 min，取上清液用以高效液相色譜分析。

1.3.3 土壤磷酸酶活性 土壤磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，分別在酸性（醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH4.6）、中性（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH7.0）、堿性（硼酸-硼酸鈉緩沖液，pH9）環(huán)境中，使用土壤磷酸酶催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，通過計算24 h后1 g土壤中酚的生成量計算其活性。

1.3.4 烤煙磷含量 在下部葉采收前，把烤煙整株挖起用清水洗凈，分地上部與根系取樣，105℃殺青30 min后，70 ℃烘干至恒重，稱取各部分的干重。采用H2SO4-H2O2消煮，釩鉬黃比色法測定各部分全磷含量，據此計算煙株的吸磷量。土壤磷素表觀盈余量（g/株）＝施磷量－植株吸磷量。

1.3.5 烤煙農藝性狀 在烤煙不同時期，按照《煙草農藝性狀調查測量方法（YC/T142—2010）》測定成熟期烤煙農藝性狀。

2 結果與分析

2.1 施磷水平對土壤全磷和速效磷含量的影響

由圖1和圖2可知，土壤全磷和速效磷的含量存在差異，各處理速效磷含量在烤煙移栽40 d后達到最大值，P1、P2、P3處理分別為20.12、27.38、30.39 mg/kg，之后隨著烤煙生育進程的推進逐漸下降，烤煙生長后期P1處理的土壤有效磷降幅變小，說明烤煙能自發(fā)調節(jié)適應低磷脅迫，加強對土壤磷素的活化與利用，提高根系利用土壤磷的能力。各處理土壤全磷含量變化趨勢一致，均隨著烤煙生育進程呈下降趨勢，其中P3處理的土壤全磷含量高于P2、P1處理，至烤煙移栽后85 d比移栽后25 d 減少0.1 g/kg，土壤全磷減少量比P1、P2處理增加。由圖3可知，磷素表觀盈余量隨施磷量的增加逐漸增大，由磷虧缺轉變成磷盈余，其中P3處理每株土壤磷盈余量為6.40 g，而P1處理的土壤磷素盈余量為負值，說明不施磷處理下的土壤磷素處于虧缺狀態(tài)。

圖1 施磷水平對土壤全磷含量的影響Fig.1 Effects of phosphorus application levels on soil total phosphorus content

圖2 施磷水平對土壤速效磷含量的影響Fig.2 Effects of phosphorus application levels on soil available phosphorus content

圖3 施磷水平對土壤磷盈余量的影響Fig.3 Effects of phosphorus application levels on soil phosphoric acid surplus

2.2 施磷水平對烤煙根系分泌有機酸含量的影響

不同施磷水平處理下，烤煙根系分泌的有機酸種類及含量見表1。由表1可知，烤煙根系分泌的有機酸主要組成為乙酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸，其中蘋果酸的含量最高，在旺長中期達164.26 μg/g。隨著烤煙生育期進程，P1、P2處理烤煙根系有機酸含量總量呈先增長后緩慢下降趨勢，在旺長中期達最高，分別為220.16、131.63 μg/g，團棵期含量最低；P3處理烤煙根系有機酸含量呈上升趨勢，在現(xiàn)蕾期達最高值82.89 μg/g。不同施磷水平對烤煙根系分泌的有機酸含量影響顯著，在烤煙團棵期、旺長中期和現(xiàn)蕾期，P1處理烤煙根系有機酸總量比P3處理分別增加190.79%、240.22%、87.04%。各種有機酸中，不同施磷水平間蘋果酸差異最大、達4.43倍；不同施磷水平對檸檬酸、乳酸含量影響主要在旺長中期以后，對乙酸、蘋果酸、酒石酸影響主要在現(xiàn)蕾期前，各種有機酸不同施磷水平處理的變化趨勢與總量變化趨勢相似。

表1 施磷水平對根系分泌有機酸組成及含量（μg/g，F(xiàn)W）的影響Table 1 Effects of phosphorus application levels on the composition and content of organic acids secreted by roots

2.3 施磷水平對烤煙根際土壤磷酸酶活性的影響

土壤磷酸酶是催化含磷有機酯和酐水解的一類酶的總稱，它表征了土壤磷的狀況，根據酶促反應最適pH值將磷酸酶分為酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和中性磷酸酶。由圖4～圖6可知，P1、P2處理烤煙不同生育期土壤酸性磷酸酶活性高于中性和堿性磷酸酶活性；P1、P2、P3處理酸性磷酸酶活性均在烤煙旺長中期達到最大值，分別為156.12、118.91、62.76 μg/g·h。不同施磷水平間土壤酸性磷酸酶活性差異顯著，P1處理酸性磷酸酶活性在團棵期、旺長中期、現(xiàn)蕾期比P3處理分別高76%、155%、114%。從圖5、圖6還可發(fā)現(xiàn)，不同施磷水平土壤中性磷酸酶活性和堿性磷酸酶活性在烤煙團棵期、旺長中期差異不顯著，但在現(xiàn)蕾期，隨著施磷水平的增加，土壤中性磷酸酶活性、堿性磷酸酶活性顯著下降，與P3處理相比，P1處理土壤中性磷酸酶活性、堿性磷酸酶活性分別高44.56%、72.91%。

圖4 施磷水平對根際土壤酸性磷酸酶活性的影響Fig.4 Effects of phosphorus application levels on acid phosphatase activity in rhizosphere soil

圖5 施磷水平對根際土壤中性磷酸酶活性的影響Fig.5 Effects of phosphorus application levels on neutral phosphatase activity in rhizosphere soil

圖6 施磷水平對根際土壤堿性磷酸酶活性的影響Fig.6 Effects of phosphorus application levels on alkaline phosphatase activity in rhizosphere soil

2.4 烤煙根系有機酸分泌總量與磷酸酶活性的相關分析

由圖7可知，烤煙根系有機酸分泌總量與酸性磷酸活性呈顯著正相關、相關系數為0.924，與堿性磷酸酶、中性磷酸酶活性均呈正相關關系，但相關系數均小于0.2，相關性不顯著。這說明在缺磷條件下，烤煙有機酸的分泌總量增加能使得土壤酸性磷酸活性增強，進而使土壤速效磷含量得到提高，以此來降低營養(yǎng)脅迫帶來的危害，維持烤煙正常生長。

圖7 有機酸含量與磷酸酶活性的相關性分析Fig.7 Correlation analysis of organic acid content and phosphatase activity

2.5 施磷水平對成熟期烤煙磷含量和積累量的影響

由圖8、圖9可知，不同施磷處理烤煙地上部磷濃度、磷積累量均高于根系，隨著施磷量增加烤煙地上部與根系磷濃度、磷積累量均顯著提高，與磷施用量呈正相關關系。與P1處理相比，P3處理烤煙地上部磷濃度和磷積累量分別提高27.12%、54.10%，根系磷濃度和磷積累量分別提高48.84%、91.89%，根系的磷積累量和磷濃度提高幅度均大于地上部，表明磷素虧缺對根系影響 大于地上部，同時磷積累量變化幅度大于磷濃度，說明烤煙磷濃度小幅變化，對烤煙磷素積累有重要影響。

圖8 施磷水平對烤煙地上部和根系磷含量的影響Fig.8 Effects of phosphorus application levels on the phosphorus content in the shoots and roots of tobacco plants

圖9 施磷水平對烤煙地上部和根系磷積累量的影響Fig.9 Effects of phosphorus application levels on the phosphorus accumulation in the shoots and roots of tobacco plants

2.6 施磷水平對成熟期烤煙農藝性狀及干物質積累量的影響

由表2可知，不施磷肥處理下烤煙均能正常生長發(fā)育，這可能與試驗土壤有效磷與全磷含量較高有關，其中P3處理烤煙農藝性狀及干物質積累量均顯著高于P1處理，其地上部干物質積累量和根重分別提高29.6%、28.9%；P2處理烤煙株高、莖圍、根重與P1處理差異不顯著，但葉片數、最大葉面積以及地上部干物質積累量顯著高于P1處理，表明適當施磷有助于烤煙的生長發(fā)育。

表2 施磷水平對烤煙地上部和地下部生長發(fā)育的影響Table 2 Effects of phosphorus application levels on the growth and development of the shoots and roots of tobacco plants

3 討論

本研究中，不同施磷水平對于土壤全磷、有效磷含量與磷素盈余量有顯著影響，施磷條件下，土壤有效磷含量在短暫上升后呈下降趨勢，可能是磷化合物發(fā)生絡合反應與土壤顆粒對磷酸根離子的吸附固定，導致土壤中的有效磷較少。提高施磷水平，土壤有效磷含量增加，這與前人研究不同施磷對棉花［17］、玉米［18］、黃瓜［19］等作物土壤磷含量影響的結果相似。顧惠敏等［20］研究發(fā)現(xiàn)，不同質地棉田土壤有效磷隨著施磷量增加而增加，但增加幅度呈下降趨勢。付蓉等［21］認為，隨著施磷量增加，土壤磷素表觀盈余量逐漸增大，由磷虧缺轉變成磷盈余，這與本研究結果一致，在生產上當土壤磷元素盈余水平較高時，可以適當降低施磷水平。

前人研究表明，作物根系在感受低磷脅迫時，會誘導并分泌有機酸和磷酸酶等根系分泌物，蘋果酸等有機酸和酸性磷酸酶能通過絡合反應、降低土壤pH、水解磷化合物等途徑，弱化土壤對磷素的固化能力，提高作物對難溶性磷和有機磷的活化利用［22-23］。本研究中，與施磷處理相比，不施磷處理土壤有機酸含量和根際酸性磷酸酶活性顯著增加。肖曉明等［15］研究發(fā)現(xiàn)缺磷條件下澳洲堅果會大量分泌檸檬酸，蘭忠明等［11］研究發(fā)現(xiàn)紫云英在缺磷條件下根系分泌的有機酸以草酸為主，由此可見，低磷條件下不同作物根系分泌的有機酸存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)低磷處理下，烤煙根系分泌的有機酸以蘋果酸為主，占有機酸總量50%以上。在不同pH條件下不同種類磷酸酶活性不同，本研究中，低磷處理土壤酸性磷酸酶活性顯著高于其他兩種磷酸酶活性，且施磷水平越低酸性磷酸酶活性越強，但對堿性磷酸酶和中性磷酸酶活性影響差異不顯著。對有機酸含量與根際磷酸酶活性的相關性分析表明，酸性磷酸酶與有機酸含量呈正相關關系，有機酸含量增加，酸性磷酸酶活性加強，與展曉瑩等［24］研究結果相似，低磷條件下有機酸含量增加，土壤pH降低，酸性磷酸酶活性增加。在煙葉生產過程中，在磷元素利用水平低的酸性土壤中，可適當外源施入蘋果酸、乳酸、乙酸等有機酸，提高烤煙對土壤磷元素的利用率。

烤煙磷濃度與磷素積累量是烤煙磷營養(yǎng)吸收利用的直觀表現(xiàn)［25］。本研究中，隨著施磷水平的提高，烤煙地上部與根系磷素積累量和磷濃度均增加，且根系增幅大于地上部，說明提高施磷水平能提高烤煙磷素的吸收能力，磷素虧缺對烤煙根系影響大于地上部。不施磷肥烤煙能維持生長，說明烤煙可通過自我調節(jié)適應低磷脅迫，但烤煙生長發(fā)育緩慢，株高較矮，有效葉片數少，葉面積也較小。施磷處理農藝形狀顯著優(yōu)于不施磷肥處理，但P2與P3處理差異不顯著，其原因可能是適量供磷使烤煙形成良好的根系構型，有利于根對養(yǎng)分的吸收，改善根冠結構，提高凈光合速率，促進葉肉細胞分裂和柵欄組織伸長，增加葉片厚度，促進葉片擴展，提高單葉重和產量［26］，磷素供應過量，烤煙根系指標與葉片生理指標均有所下降，干物質積累性減少［4］。

4 結論

本研究結果表明，低磷脅迫能誘導烤煙根系分泌大量的有機酸（尤其是蘋果酸、乙酸）與酸性磷酸酶，在根際環(huán)境中有利于難溶性有機磷的活化與有機磷的水解，從而促進對土壤中磷素的吸收利用，以適應低磷脅迫。但不施磷肥對烤煙磷素的吸收與生長發(fā)育仍有明顯抑制作用，與正常施磷相比，磷素積累量與磷濃度下降明顯，成熟期各項農藝性狀表現(xiàn)均不如施磷處理，施用P2O54 g/株與P2O58 g/株烤煙農藝性狀差異不顯著，生產上為了降低成本與減少水體環(huán)境富營養(yǎng)化，可以適當降低施磷量。