葡萄種質(zhì)資源鑒評(píng)研究進(jìn)展

朱磊，武欣，劉云清，于昕楚，李新月，臧延青，湯華成

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心；3.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心）

葡萄（Vitis vinifera）屬于葡萄科（Vitaceae L.）葡萄屬（Vitis.Linn.）木質(zhì)藤木植物，是世界上最古老的果樹樹種之一，栽培價(jià)值高[1]，可實(shí)現(xiàn)連年豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)[2]。葡萄種質(zhì)資源也叫葡萄遺傳資源，指凡攜帶有不同種質(zhì)（基因）的各種栽培植物及其近緣種和野生種，在葡萄生產(chǎn)和育種上有利用價(jià)值植物的總稱[3]。世界葡萄種質(zhì)資源極為豐富，按其形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)可分為兩大類：真葡萄亞屬（Euvitis Planch）和圓葉葡萄亞屬（Muscadinia Planch），共70 余種[4]。已知世界葡萄品種可達(dá)16 000 個(gè)以上，中國(guó)種質(zhì)資源圃中約有3 000個(gè)以上[5-6]，近年來(lái)，我國(guó)對(duì)葡萄種質(zhì)資源的重視度不斷提高，尤其是我國(guó)的野生種質(zhì)資源[7]。我國(guó)葡萄科技工作者對(duì)葡萄種質(zhì)資源在調(diào)查、保存、鑒評(píng)、利用及創(chuàng)新方面的研究已經(jīng)取得顯著的進(jìn)展和成果[8]。

1 葡萄種質(zhì)資源的種類

1.1 真葡萄亞屬

世界上絕大部分葡萄品種屬于真葡萄亞屬，包括北美種群、東亞種群和歐亞種群[4]，染色體數(shù)為38 條[9]，枝條無(wú)皮孔，枝蔓節(jié)部有橫隔[10]，種子大多為梨形[11]。

北美種群主要包括美洲葡萄（V.labrusca）、沙地葡萄（V.Rupestris Scheele）和河岸葡萄（V.riparia）等30 余種，種間差異較大。美洲北部葡萄具有很好的抗寒性，北美洲東南部地區(qū)是葡萄根瘤蚜和霜霉病等真菌病害的發(fā)源地，當(dāng)?shù)氐钠咸岩惨虼诉M(jìn)化形成了抗病性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。美洲葡萄具有明顯的“狐臭味”（foxy），主要用于鮮食和制汁，而且葡萄汁的香味具有很好的穩(wěn)定性[12]。河岸葡萄的果實(shí)偏酸，有青草味，不宜鮮食，可用作抗根瘤蚜砧木和抗寒砧木育種的親本[12]，以改良?xì)W洲葡萄的抗性[13]，近年來(lái)，我國(guó)也利用河岸葡萄和我國(guó)的野生山葡萄培育出優(yōu)良抗寒砧木品種，如“鄭寒1 號(hào)”[14]。

東亞種群有40 余種，我國(guó)擁有29 個(gè)種，是東亞種群葡萄資源最豐富的國(guó)家，其中生長(zhǎng)于我國(guó)秦嶺、秦山以南的毛葡萄（V.heyneana Roem.et Schult）分布最為廣泛。廣西羅城是我國(guó)的毛葡萄原產(chǎn)地[15]，我國(guó)對(duì)于毛葡萄的研究也比較深入。以毛葡萄為親本，與優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄雜交，培育釀酒葡萄新品種，已成為我國(guó)氣候濕熱的南方地區(qū)的發(fā)展趨勢(shì)，如毛歐雜交品種“凌豐”，抗病性強(qiáng)、坐果率高，適合釀制高品質(zhì)的甜型葡萄酒[16]；“NW196”，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗病性強(qiáng)，在南方可實(shí)現(xiàn)一年兩熟[17]。山葡萄（V.amurensis Rupr.），主要生長(zhǎng)在中國(guó)東北地區(qū)，冬天氣候異常寒冷，因此該地篩選出的葡萄具有生長(zhǎng)期短，抗寒性極強(qiáng)等特點(diǎn)。我國(guó)山葡萄資源圃中現(xiàn)存400 余份種質(zhì)，其中342份為野生葡萄種質(zhì)資源，我國(guó)是山葡萄種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家[18]。山葡萄釀制的葡萄酒酸甜適口，因其果粒小、皮厚，所以花色苷、單寧和白藜蘆醇的含量十分豐富。山葡萄酒中白藜蘆醇的含量可達(dá)5.86 mg·L-1，為“赤霞珠”的兩倍多。我國(guó)利用山葡萄釀酒已有近百年的歷史，山葡萄酒已成為我國(guó)特有的產(chǎn)品，已選育出“長(zhǎng) 白9 號(hào)”“左山一”“左 山二”“雙 慶”“雙 優(yōu)”“左紅一”“左優(yōu)紅”等一系列優(yōu)質(zhì)釀酒山葡萄品種。刺葡萄（V.davidii Foe¨x），生長(zhǎng)在中國(guó)湖南、浙江、江西等地，該種長(zhǎng)期生長(zhǎng)在高溫潮濕，通風(fēng)性差的森林中，因而進(jìn)化形成了對(duì)高溫、高濕、黑痘病、白腐病和炭疽病抗性強(qiáng)的特點(diǎn)[19]。東亞種群葡萄的果穗、果粒普遍偏小，糖含量低且酸含量高，單寧含量高，大多不適合鮮食，但我國(guó)的野生刺葡萄果粒較大，平均粒重為1.84 g，可用于鮮食，如江西省玉山縣的“塘尾”，湖南省溆浦縣的“雪峰”，均被當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶作為鮮食葡萄品種進(jìn)行銷售[8]。

目前歐亞種群僅存一個(gè)種，即歐亞種（V.vinifera L.），包括“赤霞珠”（“Cabernet Sauvignon”）、無(wú)核白（“Thompson Seedless”）、“美樂(lè)”（“Merlot”）等優(yōu)良品種。歐亞種葡萄果穗大，豐產(chǎn)，含糖量高，適合釀酒與鮮食?？购敌暂^強(qiáng)，但抗寒性較弱，抗病性差，尤其是對(duì)于真菌性病害[20]。歐亞種葡萄一般只含有花色素的單糖苷[21-22]，這也是區(qū)分歐亞種與其他種群遺傳背景的方法之一，不過(guò)近年來(lái)已有研究發(fā)現(xiàn)歐亞種葡萄中也存在花色素的雙糖苷[23]。目前，歐亞種群葡萄已廣泛分布于世界各地，其栽培價(jià)值高于其他各種群。我國(guó)種植的歐亞種葡萄，是通過(guò)絲綢之路傳入新疆，進(jìn)而逐漸引入內(nèi)地，并成為我們普遍食用與栽培的葡萄品種[24]。引入新的抗性基因，改善歐亞種葡萄抗逆性差的弊端，是目前葡萄科技工作者的研究熱點(diǎn)。

1.2 圓葉葡萄亞屬

圓葉葡萄亞屬有3 個(gè)種，為圓葉葡萄（V.rotundifolia Michx.）、鳥葡萄（V.munsoniana Simpson）和墨西哥葡萄（V.popenoei Fennel）[4]。染色體數(shù)為40 條，枝條有皮孔，枝蔓節(jié)部無(wú)橫隔[9]，卷須不分枝[25]。圓葉葡萄原產(chǎn)于美國(guó)東南部，抗?jié)駸?、抗病蟲害能力強(qiáng)，果實(shí)具有特殊的芳香氣味，顏色較其他種群葡萄更豐富，有綠色、銅色、黑色、紅色等，種子一般呈卵圓形[10]，皮厚，出汁率低[11]。圓葉葡萄除富含白藜蘆醇、槲皮素、山奈酚等次生代謝產(chǎn)物外，還含有其他葡萄缺乏的鞣酸及其衍生物、花色素的雙糖苷等天然多酚類物質(zhì)[26]，具有較強(qiáng)的抗癌功效。

2 葡萄品種分子鑒定

目前，對(duì)于葡萄種質(zhì)資源的鑒定及分類的研究已經(jīng)從形態(tài)學(xué)過(guò)渡到分子生物學(xué)，在種質(zhì)資源研究領(lǐng)域，分子標(biāo)記應(yīng)用在兩個(gè)方面，其一為建立指紋圖譜，進(jìn)行葡萄品種的鑒別，其二為分析種質(zhì)間的遺傳多樣性，研究品種間的親緣關(guān)系。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（Inter Simple Sequence Repeat，ISSR）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP）以及近年來(lái)逐漸興起的目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（Start Codon Targeted Polymorphism，SCo T）等標(biāo)記方法對(duì)葡萄種質(zhì)資源在品種鑒定、系譜關(guān)系確認(rèn)以及遺傳多樣性分析等方面已得到廣泛的應(yīng)用[27-30]。申海林等[31]對(duì)20 份葡萄材料進(jìn)行SSR分析，將其分為四大類，并證明歐亞種和美洲種的親緣關(guān)系比較接近，且他們與山葡萄的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。徐豐等[32]利用SRAP 對(duì)21 份刺葡萄進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，得出其樣本間遺傳多樣性不豐富，樣本純度較高，并相應(yīng)推測(cè)葡萄材料的親本。Shinde等[33]成功地利用AFLP 技術(shù)將“無(wú)核白雞心”及其無(wú)性變異品種“Manjari Naveen”進(jìn)行區(qū)分。劉偉等[5]對(duì)21 份不同類型的葡萄材料進(jìn)行遺傳多樣性SSR 分析，將其分為兩個(gè)類群，對(duì)葡萄種質(zhì)的遺傳差異性進(jìn)行了解析，并揭示其親緣關(guān)系。孫杰等[34]利用ISSR 遺傳多樣性分析技術(shù)分析了30 份葡萄材料，將其分為兩大類，并證明了30 個(gè)品種間遺傳多樣性較為豐富。SCo T 分子標(biāo)記可以獲得與性狀聯(lián)系密切的目的基因，以區(qū)分遺傳距離較近的材料，并且操作簡(jiǎn)便，多態(tài)性高[35]。Yue 等[36]利用SCo T 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)51份葡萄種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和變異分析，結(jié)果表明，36 條SCo T 引物擴(kuò)增出豐富的多態(tài)位點(diǎn)，UPGMA 聚類法將51 份材料分為三大類，并表明“醉金香”輻射誘變后的種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。

3 葡萄種質(zhì)資源評(píng)價(jià)項(xiàng)目及方法

3.1 形態(tài)特征和生物學(xué)特征

葡萄的形態(tài)特征和生物學(xué)特性主要由遺傳因素決定，不同種群/種間差異顯著，并且同一種群/種的表現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定。不過(guò)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然生長(zhǎng)或人工栽培，種間、種內(nèi)乃至品種間均表現(xiàn)出一定的多樣性。同時(shí)，葡萄的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征的差異性也受樹齡、生態(tài)環(huán)境等因素的影響[8]。

形態(tài)特征一般評(píng)價(jià)葡萄的葉、卷須、花序和花、果穗和果粒等，生物學(xué)特征一般包括新梢與葉片的生長(zhǎng)、結(jié)果習(xí)性、物候期等方面[8]。葡萄屬栽培種質(zhì)大部分為兩性花，少數(shù)為雌能花，野生種質(zhì)絕大部分為雌雄異株，但目前我國(guó)已在東亞種群中選育出兩性花山葡萄“雙慶”、刺葡萄“塘尾”，可為正常授粉受精提供保證，利于雜交[4]。不同品種葡萄的花序結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)發(fā)育情況不盡相同。許瀛之等[2]調(diào)查分析了葡萄種質(zhì)資源的花序情況，發(fā)現(xiàn)我國(guó)野生葡萄開花最早，如變?nèi)~葡萄（V.piasezkii），歐美雜種（V.labrusca and V.vinifera）開花較早，歐亞種較晚，歐亞種花序類形多為松散型，花序著生初節(jié)位大部分在4 和5，結(jié)實(shí)系數(shù)為1，而歐美雜種花序類型多為緊湊型，初節(jié)位分布在3 和4，結(jié)實(shí)系數(shù)為1 或2。葡萄的穗形一般可分為圓錐形、圓柱形和分支形，而圓錐形和圓柱形又可分別細(xì)分為長(zhǎng)圓錐形和短圓錐形、長(zhǎng)圓柱形和短圓柱形。魯雅楠等[37]調(diào)查并評(píng)價(jià)了234 份葡萄材料的果穗穗形，發(fā)現(xiàn)被調(diào)查的葡萄中以圓錐形居多，釀酒葡萄以短圓錐形為主，鮮食品種以長(zhǎng)圓錐形為主，并篩選出“天秀”等穗形優(yōu)良的品種。葡萄種質(zhì)的單果質(zhì)量差異顯著，從小于1～15 g 不等，江雨[38]對(duì)中國(guó)野生葡萄果粒特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)除刺葡萄、毛葡萄和腺枝葡萄（V.adenoclada）外，中國(guó)野生葡萄的單果粒重（0.26～0.68 g）顯著小于赤霞珠的平均單果粒重（1.15 g）。

3.2 品質(zhì)特征

品質(zhì)特性是葡萄種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，通常是對(duì)葡萄材料的果皮厚度、果肉顏色與質(zhì)地、出汁率以及果實(shí)內(nèi)含物等的測(cè)定。

葡萄果實(shí)的糖酸含量及比例很大程度上決定了葡萄及葡萄酒的品質(zhì)與風(fēng)味。葡萄的可滴定酸度（TA）可采用自動(dòng)電位滴定法和手動(dòng)酸堿滴定法，目前廣泛使用的自動(dòng)電位滴定法無(wú)需人為觀察顏色變化，儀器自動(dòng)記錄電位值，極大的減小了偶然誤差，操作簡(jiǎn)單，精確度高[39]。陳珂等[40]采用電位滴定法，以0.1 mol·L-1NaOH 對(duì)多種果形葡萄果實(shí)的可滴定酸度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)橢圓、長(zhǎng)橢圓、圓形和束腰形等果形的可滴定酸含量偏低，而可溶性固形物含量較高，總體風(fēng)味較好。另外，高效液相色譜法（HPLC）也是目前較為常用的測(cè)定酸含量的方法，張國(guó)軍[41]采用HPLC 技術(shù)對(duì)不同類型葡萄的酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，美河雜交品種（V.labrusca×V.riparia Michx.）的總酸及有機(jī)酸的含量顯著高于歐亞種和歐美雜交品種。

可溶性總糖（SS）含量的測(cè)定方法比較多，主要包括比色法和液相色譜等。比色法包括蒽酮比色法、苯酚硫酸法和鐵氰化鉀法，其中蒽酮比色法，靈敏度高、顯色穩(wěn)定、誤差??；苯酚—硫酸法簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，操作簡(jiǎn)便，但測(cè)定結(jié)果易受低聚糖的干擾，為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在測(cè)定前應(yīng)先除雜；鐵氰化鉀比色法是利用樣品中的轉(zhuǎn)化糖在堿性條件下將鐵氰化鉀還原，并計(jì)算得出含糖量，此法滴定終點(diǎn)明顯，精密度高，采用這一方法時(shí)，須嚴(yán)格控制水解溫度和時(shí)間，水解后立即冷卻，以防單糖損失[42]，潘學(xué)軍等[43]采用該法測(cè)定了貴州省三個(gè)野生種葡萄（包括毛葡萄、刺葡萄和腺枝葡萄）并與對(duì)照葡萄歐美雜種“水晶”的可溶性總糖含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，可溶性總糖含量為：歐美雜種>刺葡萄和腺枝葡萄>毛葡萄。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器聯(lián)用法（HPLC-ELSD）已被證明在檢測(cè)可溶性總糖方面具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)[44]，江雨等[45]利用高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)我國(guó)野生葡萄的糖酸含量和組分進(jìn)行測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)野生葡萄的總糖含量顯著低于赤霞珠，而總酸含量顯著高于赤霞珠，證明了中國(guó)野生葡萄普遍低糖高酸。除此之外，目前新興的流動(dòng)注射分析（FIA）檢測(cè)技術(shù)測(cè)定可溶性總糖也可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)進(jìn)樣，并且分析速度快，精度高，在試樣少、批量大時(shí)宜采用此法。

3.3 酚類物質(zhì)和抗氧化活性

酚類物質(zhì)也屬于葡萄的品質(zhì)特性，具有較強(qiáng)的清除自由基，抗氧化的能力，有益于心血管疾病及癌癥的預(yù)防[46-47]，準(zhǔn)確測(cè)定酚類物質(zhì)的組成和含量對(duì)評(píng)價(jià)葡萄及葡萄酒的品質(zhì)和保健功能具有重要意義。酚類物質(zhì)的研究包括總酚類含量、單體酚檢測(cè)分析及其抗氧化能力分析。

3.3.1 酚類含量和組成

總酚（TP）的測(cè)定方法有很多，按其原理主要分為三大類，包括氧化還原法、色譜分析法、蛋白質(zhì)沉淀法（表1）。目前定量分析總酚含量最常用的方法是氧化還原法中的福林酚法（F-C 法）。Lorenzo 等[52]采用F-C 法測(cè)定了不同葡萄品種總酚含量，結(jié)果顯示紅色鮮食葡萄的總酚含量普遍低于紅色釀酒葡萄，但有些白色鮮食葡萄（如“Exalta”）的總酚含量高于紅色鮮食葡萄。色譜分析的兩種方法，氣相色譜法和高效液相色譜法，前處理較為繁瑣，需要萃取分離或提取，這一過(guò)程中會(huì)造成損失使得結(jié)果顯著偏低，此外，高效液相色譜法測(cè)總酚需要備齊所有種類的多酚標(biāo)樣，以上兩種方法均更適合單體化合物的定性分析。目前，我國(guó)對(duì)于采用蛋白質(zhì)沉淀法測(cè)總酚的研究比較少，張振文等[53]認(rèn)為該法只適用于紅葡萄酒縮合單寧的測(cè)定。

表1 酚類化合物測(cè)定方法[48-51]Table 1 Methods for determination of phenolic compounds

單體酚的測(cè)定包括黃酮醇、黃烷-3-醇、酚酸、芪類化合物以及花色苷的組成及含量，可采用HPLC技術(shù)進(jìn)行測(cè)定分析。Koyama 等[54]采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）法分析了野生東亞種群桑葉葡萄（V.ficifolia）和紫葛葡萄（V.coignetiae）與二者的雜交種的酚類化合物，研究表明，野生葡萄及其雜交種葡萄果皮和種子中的原花青素含量普遍低于歐亞種。孫磊等[55]采用相同的方法分析了部分中國(guó)野生葡萄果皮的花色苷組分與含量，并與歐亞種葡萄進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果顯示，大部分中國(guó)野生葡萄果皮中總花色苷含量顯著高于歐亞種，花色苷類型以雙葡萄糖苷為主，花葵素（Pg）類花色苷含量相對(duì)較高。不過(guò)HPLC-UV 法測(cè)定花色苷組分會(huì)受到因雜質(zhì)而產(chǎn)生的干擾峰的影響，因而降低對(duì)花色苷組分定性分析的準(zhǔn)確性，而更為先進(jìn)的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)的質(zhì)譜則可以給出花色苷的分子離子峰和相應(yīng)的糖苷碎片峰的m/z，從而提高了精確度。Liang 等[56-57]連續(xù)兩年分別采用HPLC-MS 法和高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）法對(duì)344 個(gè)歐洲葡萄品種的成熟果實(shí)中的酚類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，共檢測(cè)出36 種多酚類化合物，包括16 種花色苷，發(fā)現(xiàn)除羥基肉桂酸以外，釀酒葡萄中的多酚類化合物含量均高于鮮食葡萄，并發(fā)現(xiàn)葡萄果實(shí)顏色僅與花色苷總含量有關(guān)。隨后又采用相同的方法分析了16 個(gè)野生種147 個(gè)葡萄品種成熟果實(shí)中的酚類物質(zhì)，檢測(cè)出48 種多酚類化合物，包括28 種花色苷，發(fā)現(xiàn)在野生種葡萄中，有60%以上的花色苷未被?；?，并證明了野生種葡萄的酚類化合物含量顯著高于歐洲種。

3.3.2 抗氧化活性

目前，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)于葡萄抗氧化活性的研究方法可分為體外評(píng)價(jià)和體內(nèi)評(píng)價(jià)兩大類（表2）。體外評(píng)價(jià)中的DPPH 自由基清除法和ABTS 自由基清除法快捷、靈敏，國(guó)外很早前就對(duì)這兩種方法發(fā)表過(guò)相關(guān)的研究報(bào)道[63]。另外，氧自由基清除能力（ORAC）、總氧自由基清除能力（TOAC）以及過(guò)氧化氫自由基清除能力（PSC）也是目前常用的自由基清除方法。通過(guò)測(cè)定抗氧化劑的還原能力，也可以快速實(shí)現(xiàn)對(duì)抗氧化活性的評(píng)價(jià)，如鐵離子還原力（FRAP）和銅離子還原力（CUPRAC），是目前廣泛應(yīng)用的方法。不過(guò)，由于目前對(duì)于抗氧化活性的評(píng)價(jià)沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，所以研究人員一般采用至少兩種不同的方法共同評(píng)價(jià)被測(cè)物質(zhì)的抗氧化能力[60]。許長(zhǎng)謀[64]選用DPPH、ABTS、FRAP 三種方法對(duì)東亞和美洲種群以及歐亞種群的18 個(gè)葡萄品種的果皮和種子的抗氧化性能進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，葡萄籽中抗氧化能力為：“赤霞珠”>圓葉葡萄>歐美雜種>歐亞與東亞雜種>東亞種群，而對(duì)于葡萄皮，不同品種間抗氧化活性差異遠(yuǎn)不如葡萄籽中的差異。

表2 抗氧化活性評(píng)價(jià)方法[58-62]Table 2 Methods evaluation of antioxidant activity

體外化學(xué)分析法可以快速評(píng)價(jià)酚類物質(zhì)的抗氧化活性，但由于人體對(duì)于抗氧化活性的作用機(jī)理十分復(fù)雜，包括利用率和吸收代謝等影響因素，所以無(wú)法客觀反映其抗氧化能力的真實(shí)生理作用效果，這類方法適合大量活性物質(zhì)的初篩。Wolfe 等[61]在2007年提出了細(xì)胞內(nèi)測(cè)定抗氧化活性（CAA），這一方法在化學(xué)分析法的基礎(chǔ)上模擬生物機(jī)體的內(nèi)部環(huán)境，可以更準(zhǔn)確的表示其生理特性，適合快速篩選活性物質(zhì)，同時(shí)證明了紅葡萄的抗氧化活性較強(qiáng)。另外，CAA 在抗氧化劑方面的開發(fā)也有重要的貢獻(xiàn)[65]。

體內(nèi)評(píng)價(jià)主要是以動(dòng)物生理系統(tǒng)為媒介的一種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，這一方法的測(cè)定結(jié)果真實(shí)有效，相比于體外評(píng)價(jià)，體內(nèi)評(píng)價(jià)可以將生物體內(nèi)復(fù)雜的代謝與抗氧化活性聯(lián)系起來(lái)，能夠全面的評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力，但實(shí)驗(yàn)成本高、周期長(zhǎng)[58]，因此并不適合葡萄種質(zhì)資源大批量的抗氧化活性評(píng)價(jià)。

3.4 抗寒性

越冬凍害是發(fā)生在葡萄栽培中的一個(gè)普遍的問(wèn)題，研究葡萄抗寒性并培育抗寒新品種是葡萄工作者近幾十年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一?？购钥蓮亩鄠€(gè)方面進(jìn)行鑒定，目前廣泛采用的方法有田間鑒定、電導(dǎo)法、恢復(fù)生長(zhǎng)法、組織褐變法、綜合評(píng)價(jià)法和差異熱分析法（表3）。賀普超等[67]采用電導(dǎo)法、恢復(fù)生長(zhǎng)法和組織變褐法對(duì)不同品種的野生葡萄的抗寒性進(jìn)行了兩年的測(cè)定，證明了我國(guó)大部分野生葡萄種的抗寒性強(qiáng)于歐洲種，且不同種系的葡萄抗寒性與其地理分布的氣候類型直接相關(guān)。楊豫等[68]采用電導(dǎo)法和過(guò)冷卻點(diǎn)、結(jié)冰點(diǎn)相結(jié)合的方法對(duì)不同品種釀酒葡萄根系的抗寒性進(jìn)行測(cè)定，證明了葡萄根系的抗寒性與其可溶性蛋白質(zhì)含量具有的很好的相關(guān)性。陳仁偉等[69]利用差熱分析法對(duì)釀酒葡萄不同部位的抗寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示抗寒能力強(qiáng)弱依次為：枝條>主根>副根，且主根的抗寒性顯著高于副根。

表3 葡萄抗寒性鑒定方法[66]Table 3 Methods for identifying the cold resistance of grapes

3.5 抗病性

葡萄易發(fā)生白粉?。≒odwer mildew，Uncinula necator Burr.）、霜霉病 [Downey mildew，Plasmopara viticola（Berk.&Curtis.）Berl &de Toni]、黑痘?。⊿phacelomo ampelinum de Bray.）、白腐病[White rot，Coniothyrium diplodiella（Speg.）Sacc.]、炭疽病[Glomerella cingulata（ston.）Spauld.et Schrenk]等真菌性病害，而葡萄不同種/品種的抗病性均有所差異，葡萄抗病性鑒定方法主要分為田間自然鑒定、田間接種鑒定和室內(nèi)離體接種鑒定法（表4）。白粉病遍布于全球的葡萄種植地，不同葡萄種的抗病性有所不同，有研究報(bào)道，美洲葡萄、沙地葡萄、冬葡萄（V.berlandieri）、河岸葡萄等北美種群以及圓葉葡萄抗白粉病能力極強(qiáng)[71]，而歐洲種葡萄易感白粉病，需噴藥防治[72]。對(duì)于葡萄白粉病抗性的遺傳，有部分學(xué)者認(rèn)為是由單基因控制的，表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳[73-74]，另一種說(shuō)法是多基因控制，表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳[75-76]。霜霉病也是一種全球性葡萄疾病，1834 年首次發(fā)現(xiàn)于北美洲的野生葡萄上[77]，據(jù)研究表明，我國(guó)的秋葡萄（V.romanetii）、復(fù)葉葡萄（V.piasezkii）[78]、瘤枝葡萄（V.davidii（Roman.）Foexvar.Cyanocarpa（Gagn）Sarg）、華 北葡萄（V.bryoniaefolia Beg.）、華東葡萄（V.pseudoreticulata）等[79]高抗霜霉病，而河岸葡萄以及我國(guó)的野生山葡萄、刺葡萄、毛葡萄等不抗霜霉病[80]。Zhao 等[81]采用離體接種鑒定法對(duì)120 份種質(zhì)資源的抗霜霉病能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)圓葉葡萄對(duì)霜霉病免疫，歐亞種葡萄高感霜霉病。黑痘病起源于歐洲，隨著歐亞種葡萄引進(jìn)到世界各地，黑痘病也遍布全球[8]。王躍近等[82]采用田間自然鑒定法對(duì)我國(guó)野生種葡萄黑痘病的抗性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)我國(guó)野生種葡萄抗黑痘病能力強(qiáng)。林玲等[83]研究了我國(guó)不同葡萄品種抗黑痘病的能力，證明野生毛葡萄抗黑痘病能力最強(qiáng)，毛歐雜交后代也對(duì)黑痘病表現(xiàn)出高抗。

表4 葡萄抗病性鑒定方法[70]Table 4 Methods for identifying disease resistance of grapes

4 小結(jié)

通過(guò)近幾十年來(lái)科技工作者對(duì)葡萄種質(zhì)資源的調(diào)查研究，每年不斷有新的品種被育出。不過(guò)，目前我國(guó)葡萄種質(zhì)資源的鑒評(píng)工作仍存在幾點(diǎn)值得關(guān)注的問(wèn)題：（1）由于葡萄資源極為豐富，基因庫(kù)極為龐大，而且葡萄種間雜交復(fù)雜多樣，未來(lái)的葡萄資源遠(yuǎn)不止目前所掌握的數(shù)量，還需在種質(zhì)資源的調(diào)查、收集、保存、鑒定以及引種葡萄在當(dāng)?shù)氐钠焚|(zhì)表現(xiàn)和商品價(jià)值等方面投入更多的關(guān)注。（2）構(gòu)建品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)和全國(guó)統(tǒng)一查詢平臺(tái)，不僅能快速鑒定葡萄品種，也可有效保護(hù)葡萄育成品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)和育種者的權(quán)益。（3）在分子鑒定方面發(fā)掘功能性基因，對(duì)葡萄育種提供幫助。（4）目前，葡萄品質(zhì)評(píng)價(jià)還較多停留于果實(shí)性狀、糖、酸等表觀生理指標(biāo)的測(cè)定與分析，對(duì)葡萄品質(zhì)特性進(jìn)行科學(xué)合理的綜合評(píng)價(jià)，加強(qiáng)評(píng)價(jià)與利用相結(jié)合，以生產(chǎn)具有地域特色的葡萄制品是未來(lái)的研究重點(diǎn)。