香灰菌和毛韌革菌碳水化合物活性酶基因和次生代謝物合成基因的比較分析

薛治峰 張樹竹 劉金濤 姬夢琳 田青霖 薛笑然 陳本佳 楊立凡 田霄

摘要香灰菌（ Annulohypoxylonstygium）和毛韌革菌（ Stereumhirsutum）分別是銀耳和金耳的伴生菌，對銀耳和金耳的栽培、品質(zhì)和產(chǎn)量起著關(guān)鍵作用。本研究對香灰菌和毛韌革菌的基因組進(jìn)行了碳水化合物活性酶（CAZymes）基因、細(xì)胞壁降解酶基因、次生代謝物相關(guān)基因注釋和比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）香灰菌和毛韌革菌CAZymes基因數(shù)量分別為525和519，其中 GH、AA家族的基因數(shù)量最多;（2）香灰菌和毛韌革菌細(xì)胞壁降解酶數(shù)量分別為495和467，主要涉及纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠、淀粉和菊粉降解相關(guān)酶類;（3）毛韌革菌纖維素酶和木質(zhì)素酶編碼基因數(shù)量多于香灰菌，而半纖維素酶編碼基因數(shù)量少于香灰菌;（4）香灰菌和毛韌革菌次生代謝物合成相關(guān)基因數(shù)量分別為1458和547個(gè)，合成產(chǎn)物主要為萜類、聚酮類、非核糖體多肽合成酶類次生代謝物質(zhì)。以上結(jié)果表明，香灰菌相較于毛韌革菌木質(zhì)纖維素降解相關(guān)細(xì)胞壁降解酶數(shù)量更多，可能具有更強(qiáng)的木質(zhì)纖維素降解能力，能夠適應(yīng)更多種類的木質(zhì)纖維素基料，2種伴生菌對基質(zhì)中木質(zhì)纖維素成分具有一定偏好性。另外，香灰菌和毛韌革菌均能合成多種不同的次生代謝物，特別是香灰菌合成的次生代謝物種類明顯多于毛韌革菌，可能增加了銀耳和金耳的食藥用價(jià)值。本研究挖掘了銀耳和金耳伴生菌的營養(yǎng)吸收和食藥用活性相關(guān)基因，為銀耳和金耳的人工栽培和品質(zhì)改良提供一定分子遺傳基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞香灰菌;毛韌革菌;碳水化合物活性酶;細(xì)胞壁降解酶;次生代謝物合成相關(guān)基因

中圖分類號(hào) S567.34;Q933 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.12.016

Comparative Analysis of Genes Encoding Carbohydrate Active Enzyme and GenesRelated to Secondary Metabolite Synthesis in Annulohypoxylonstygium and Stereumhirsutum

XUE? Zhifeng1） ZHANG? Shuzhu1） LIU? Jintao1） JI? Menglin1） TIAN? Qinglin1） XUE? Xiaoran1） CHEN? Benjia1） YANG? Lifan1） TIAN? Xiao2）

（1 College of Agriculture/Resource Plant Research Institute， Yunnan University， Kunming， Yunnan 650000， China;

2 Kunming Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan 650000， China）

Abstract? Annulohypoxylonstygium? and Stereumhirsutum? are? companion? fungi? and play? a key role in the cultivation， quality and yield of Tremella aurantialba and Tremella fuciformis. In order to explore the genetic basis of the? environmental adaptability of the two? fungi and provide theoretical basis? for? strain optimization? and? substrate? improvement，? carbohydrate? active? enzymes （CAZymes） genes，? cell? wall degrading? enzyme? genes （CWDEs），? and? secondary? metabolite-related? genes? were? annotated? and comparatively? analyzed? on? the? genomes? of A. stygium? and? S. hirsutum. The? results? showed? that? theCAZymes genes of A. stygium and S. hirsutum were 525 and 519 in number， respectively， of which the genes in the GH and AA family were the most. The CWDEs were 495 and 467， respectively， capable of degrading cellulose， hemicellulose， pectin， starch and inulin. The genes encoding cellulase and ligninase are more in S. hirsutum than in A. stygium， and the genes encoding hemicellulase is less in S. hirsutum than in A. stygium. The? secondary metabolite? synthesis genes of A. stygium? and S. hirsutum were 1458 and 547，? respectively. The? synthesized? products? were? mainly? terpenes，? polyketides，? non-ribosomal polypeptide synthetase and other secondary metabolites. The above results indicate that A. stygium has a stronger? carbon? source utilization? capacity than S. hirsutum，? and? can? degrade the? carbon? source? of the substrate more thoroughly. The two companion fungi have a certain preference for the content and type of? lignocellulose. In? addition，? both A. stygium? and? S. hirsutum? can? synthesize? a? variety? of? different secondary? metabolites. In? particular，? the? types? of secondary? metabolites? synthesized? by A. stygium? are significantly? more? than? those? of S. hirsutum，? which? increases? the? value? of food? and? medicine? of the fruiting bodies of T. aurantialba and T. fuciformis. This study has unearthed the genes related to nutrient absorption? and? edible? and medicinal? activity? of the? companion? fungi，? and provided? a? certain molecular genetic basis for the artificial cultivation and quality improvement of T. aurantialba and T. fuciformis.?? Keywords? Annulohypoxylonstygium ; Stereumhirsutum ; CAZymes ; CWDEs ; secondary metabolite synthesis related gene

銀耳 （ Tremella aurantialba） 和金耳（ Tremella fuciformis）是銀耳屬（ Tremella）的食藥用真菌，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。銀耳或金耳的栽培基質(zhì)主要以碳源（木質(zhì)纖維素）為主，氮源、無機(jī)鹽和維生素等物質(zhì)含量較少[2-3]。單獨(dú)的銀耳或金耳菌絲不能在以木質(zhì)纖維素為主的基質(zhì)中形成子實(shí)體并完成其生活史，必須依靠香灰菌或毛韌革菌伴生進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)交換和傳遞[4]。而香灰菌或毛韌革菌在伴生或單獨(dú)存在的情況下均能在基質(zhì)上正常生長，說明兩者均具有強(qiáng)大的碳源利用能力，是銀耳或金耳制種和栽培的重要影響因素[5]。大型真菌利用次生代謝響應(yīng)外界環(huán)境變化，且部分次生代謝物具有抗菌、抗癌、抗氧化，以及治療糖尿病等藥理活性[6]。研究表明，香灰菌的代謝產(chǎn)物對銀耳菌絲的穩(wěn)定生長具有重要的促進(jìn)作用[7]。香灰菌和毛韌革菌基因組序列的公布[8-9]，為探究2種伴生菌營養(yǎng)吸收、次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑，以及伴生菌與銀耳或金耳的共生機(jī)制和環(huán)境適應(yīng)性提供新的方向。

碳水化合物活性酶（ carbonhydrate-active enzymes，CAZymes）是真菌吸收碳源營養(yǎng)和適應(yīng)環(huán)境的重要工具，CAZymes的種類及數(shù)量與真菌的營養(yǎng)偏好性和生活方式密切相關(guān)[10]。CAZymes根據(jù)催化活性分為輔助活性（auxiliary activities，AA）、碳水化合物結(jié)合域（carbohydrate-binding modules，CBM）、碳水化合物酯酶（ carbohydrate esterases， CE）、糖苷水解酶 （glycoside hy‐drolases， GH）、糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyl trans ‐ferases， GT）和多糖裂解酶（polysaccharide lyases， PL）家族[11]。寄生或共生真菌分泌的細(xì)胞壁降解酶 （cell wall degrading enzymes， CWDEs）屬于CAZymes，能夠幫助真菌分解植物細(xì)胞壁，釋放小分子碳水化合物供其生長[12]。目前基因組進(jìn)化研究表明，食藥用菌木質(zhì)纖維素相關(guān)降解酶系的多樣性與其生態(tài)類型具有顯著關(guān)聯(lián)性，食藥用菌基因組中木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶數(shù)量呈現(xiàn)以下規(guī)律：草腐真菌>白腐真菌>褐腐真菌>共生營養(yǎng)真菌[13]，然而香灰菌和毛韌革菌目前尚未有 CWDEs 基因數(shù)量和種類的全基因組分析。因此，明確毛韌革菌和香灰菌的CAZymes和 CWDEs 編碼基因種類，從基因組水平理解2種伴生菌碳源環(huán)境適應(yīng)性的遺傳基礎(chǔ)，可為銀耳和金耳菌種優(yōu)化和基質(zhì)改良提供理論依據(jù)。

食藥用菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物是農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、香料等產(chǎn)業(yè)天然產(chǎn)物的理想來源，具有結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的特點(diǎn)，包括萜類、甾體、類固醇、酚酸、脂肪酸、聚炔烴等[14]。真菌次生代謝產(chǎn)物主要是由聚酮合成酶（polyketide syn ‐thase， PKS）和非核糖體多肽合成酶（nonribo‐somal peptide synthetase， NRPS），以及氫化酶、氧化酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等共同調(diào)控合成[15]。然而目前銀耳和金耳及其伴生菌的次生代謝物研究還尚少，通過基因組挖掘香灰菌和毛韌革菌次生代謝產(chǎn)物的種類及其生物合成途徑，可為探究金耳和銀耳菌絲復(fù)合體的藥理活性和化學(xué)防御機(jī)制提供新思路，也可為銀耳和金耳的發(fā)酵加工和產(chǎn)品研制提供參考。

本研究通過香灰菌和毛韌革菌基因組數(shù)據(jù)挖掘和比較分析，明確香灰菌和毛韌革菌CAZymes、 CWDEs 和次生代謝物合成相關(guān)基因的種類和組成，為銀耳和金耳的栽培條件改良和活性物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化提供遺傳基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

香灰菌和毛韌革菌的基因組數(shù)據(jù)由美國國家生物信息中心 （The National Center for Bio ‐ technology Information， NCBI）數(shù)據(jù)庫下載。香灰菌基因組大小為38.68 Mbp， Contig N50為713963 bp，基因數(shù)為11880，基因組 ID 為 PRJ ‐ NA454572。毛韌革菌基因組大小為46.51 Mbp， Contig N50為245271 bp，基因數(shù)為14072，基因組 ID 為 PRJNA52843。隨后利用GeneMark-ES 軟件對基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測，得到對應(yīng)基因組gtf、cds和 pep文件[13]。

1.2方法

1.2.1 CAZymes注釋

利用 Carbohydrate-Active enZYmes Database （CAZy） 數(shù)據(jù)庫[16]? 和 Database for automated carbohydrate active enzyme annotation （dbCAN）注釋工具（https：//bcb. unl. edu/dbCAN2/）[17] 對香灰菌和毛韌革菌的基因組進(jìn)行CAZymes比對和注釋，采用 HMMER 方法，參數(shù)為 E-Value<1e-15， coverage>0.35。

1.2.2細(xì)胞壁降解酶分析方法

根據(jù)CAZymes-based ranking of fungi （ CBRF）網(wǎng)站[18] 對細(xì)胞壁降解酶的分類標(biāo)準(zhǔn)，將纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶和菊粉酶所在的CAZymes家族，結(jié)合dbCAN注釋信息，對香灰菌和毛韌革菌細(xì)胞壁降解酶進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)。

1.2.3次生代謝產(chǎn)物合成基因的預(yù)測

利用微生物次級(jí)代謝物合成基因簇注釋數(shù)據(jù)庫antiSMASH 5.0（https：//antismash.second‐ arymetabolites.org）對香灰菌和毛韌革菌次生代謝物合成基因簇進(jìn)行注釋。選擇 Known Cluster Blast、Cluster Blast、SubCluster Blast、Ac ‐tive Site Finder、MIBiG cluster comparison、RREFinder、Cluster Pfam分析和Pfam-based GO注釋，均采用默認(rèn)參數(shù)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 Excel 2020和 GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并繪制相關(guān)圖表。

2結(jié)果與分析

2.1 CAZymes基因的注釋和分析

結(jié)合CAZy數(shù)據(jù)庫和dbCAN工具的注釋，香灰菌CAZymes基因數(shù)量為525個(gè)，占全基因組基因總數(shù)的4.42%。香灰菌CAZymes基因分屬于116個(gè)亞家族，包括144個(gè) AA、3個(gè) CBM、39個(gè) CE、243個(gè) GH、85個(gè) GT和11個(gè) PL基因，分屬于14個(gè) AA、2個(gè) CBM、10個(gè) CE、57個(gè) GH、28個(gè) GT 和5個(gè) PL 亞家族（圖1-A）。毛韌革菌CAZymes基因數(shù)量為519個(gè)，占全基因組基因總數(shù)的3.69%。毛韌革菌CAZymes基因分屬于116個(gè)亞家族，包括126個(gè) AA、1個(gè) CBM、30個(gè) CE、275個(gè) GH、68個(gè) GT和19個(gè) PL基因，分屬于11個(gè) AA、1個(gè) CBM、10個(gè) CE、58個(gè) GH、29個(gè) GT 和7個(gè) PL 亞家族（圖1-A）。2種伴生菌 CA ‐ Zymes家族根據(jù)基因種類從多到少排列均為 GH>GT > AA>CE>PL>CBM;基因數(shù)量從高到低排列均為 GH>AA>GT>CE>PL>CBM （圖1-B）。香灰菌和毛韌革菌 GH 家族基因數(shù)量分別占CAZymes基因總數(shù)的46.3%和53.0%（圖1-B），其中香灰菌 GH3亞家族基因數(shù)量最多，而毛韌革菌 GH16亞家族基因數(shù)量最多。香灰菌和毛韌革菌 AA 家族基因數(shù)量分別占CAZymes基因總數(shù)的27.4%和24.2%（圖1-B），其中香灰菌 AA7亞家族基因數(shù)量最多，而毛韌革菌 AA3亞家族基因數(shù)量最多。

對2種伴生菌CAZymes基因比較分析發(fā)現(xiàn)，香灰菌 AA、CBM 家族的基因種類和數(shù)量多于毛韌革菌，而毛韌革菌 GH 和 PL 家族的基因種類和數(shù)量多于香灰菌（圖1）。香灰菌 CE 家族種類與毛韌革菌相同，但基因數(shù)量多于毛韌革菌（圖1）。毛韌革菌 GT 家族種類少于香灰菌，但基因數(shù)量多于香灰菌（圖1）。香灰菌和毛韌革菌具有不同的CAZymes家族基因，香灰菌特有CAZymes家族基因來源于 AA11、 AA12、 AA13、 CBM67、 CE3、 GH25、 GH36、 GH45、 GH54、 GH64、 GH67、 GH94、 GH132、 GT34、 GT62、GT109、PL3、PL20亞家族;毛韌革菌特有CAZymes家族基因來源于 GH9、GH12、GH23、GH27、 GH44、? GH85、? GH88、? GH109、? GH135、? GH140、 GH152、GT28、GT48、GT49、PL8、PL14、PL35和 PL38亞家族。另外，2種伴生菌CAZymes基因數(shù)量在 AA1、AA7、AA9、CE1、CE5、CE16、GT1、GH2、 GH16、GH28、GH43和 GH76亞家族中存在較大差異（圖1-A）。以上結(jié)果說明，香灰菌和毛韌革菌對碳源利用主要依靠 GH 和 AA 家族基因，并且2種伴生菌對碳源的利用能力存在一定差異。

2.2 CWDEs 基因的預(yù)測

對 CWDEs 的降解底物和所屬CAZymes家族分析

發(fā)現(xiàn)，香灰菌共有495個(gè) CWDE基因，包括36種 CWDEs，分屬于30個(gè) GH、11個(gè) AA、8個(gè) CE、4個(gè) PL、1個(gè) CBM 和1個(gè) GT家族（表1）。毛韌革菌共有467個(gè) CWDE基因，包括35種 CWDEs，分屬于30個(gè) GH家族、9個(gè) AA 家族、7個(gè) CE家族、3個(gè) PL家族、1個(gè) CBM 家族和1個(gè) GT 家族（表1）。香灰菌 CWDEs 數(shù)量由高到低均為半纖維素酶>纖維素酶>木質(zhì)素酶>果膠酶>淀粉酶>菊粉酶;毛韌革菌 CWDEs 數(shù)量由高到低均為纖維素酶>半纖維素酶>木質(zhì)素酶>果膠酶>淀粉酶>菊粉酶（圖2）。毛韌革菌纖維素酶和木質(zhì)素酶數(shù)量明顯多于香灰菌，而半纖維素酶明顯少于香灰菌。2種伴生菌在果膠酶、淀粉酶和菊粉酶編碼基因數(shù)量上無明顯差異（圖2）。以上結(jié)果說明，香灰菌或毛韌革菌 CWDEs 以纖維素、半纖維素、木質(zhì)素為主，同時(shí)也具有一定數(shù)量的果膠酶，以及少量淀粉酶和菊粉酶，因此，2 種伴生菌除了可以利用木質(zhì)纖維素外，還可以利用果膠和淀粉成分。香灰菌 CWDEs 基因數(shù)量多于毛韌革菌，且木質(zhì)纖維素 CWDEs 基因數(shù)量多于毛韌革菌，說明香灰菌相較于毛韌革菌可能具有較強(qiáng)的木質(zhì)纖維素降解能力，能夠?qū)m應(yīng)更多種類的木質(zhì)纖維素。另外，毛韌革菌纖維素酶和木質(zhì)素酶的數(shù)量多于香灰菌，香灰菌半纖維素酶的數(shù)量多于毛韌革菌，說明香灰菌和毛韌革菌對木質(zhì)纖維素成分具有一定偏好性，推測香灰菌偏好半纖維素含量豐富的栽培基料，而毛韌革菌偏好纖維素和木質(zhì)素含量豐富的栽培基料。

2.3次生代謝物合成基因的注釋和分析

通過antiSMASH數(shù)據(jù)庫注釋，香灰菌共鑒定出1458個(gè)次生代謝物合成相關(guān)基因（圖3），占全基因組基因總數(shù)的12.3%，可分類到33個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成基因簇（表2），合成產(chǎn)物為14種非核糖體多肽合成酶（Nrps，Nrps-like）、11種 I型聚酮類（ T1pks）、4種萜類（Terpene）、1種 III 型聚酮類（ T3pks）、1種非核糖體多肽合成酶- I 型聚酮類（Nrps-T1pks）、1種β-內(nèi)酯（ Beta-lactone）和1種吲哚（Indole）。其中，聚酮類次生代謝產(chǎn)物類似化合物為甜菜酮 （ Betaenone）、安卡黃素（Ankaflavin）、紅曲霉素（monasci）、茄吡酮（Solanapyrone）、Shanorellin、Burnettramic acid A、伏馬菌素（ Fumonisin）、神經(jīng)孢菌素 A （Neurosporin A）、Heronamide;非核糖體多肽合成酶類次生代謝產(chǎn)物類似化合物為Dimethylcoprogen、Aspirochlorine、Oxaleimide C、Wort ‐manamide;萜類次生代謝產(chǎn)物類似化合物為角鯊烯素 S1（Squalestatin S1）。毛韌革菌共鑒定出547個(gè)次生代謝物合成相關(guān)基因（圖3），占全基因組基因總數(shù)的3.89%，可分類到12個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成基因簇（表3），合成產(chǎn)物為6種萜類（ Ter ‐pene）、2種 I 型聚酮類（ T1pks）、2種非核糖體多肽合成酶 （Nrps-like）、1種鐵載體 （Sidero‐phore）和1種反式?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域聚酮化合物合酶（ TransAT-PKS）。其中 T1PKS類次生代謝產(chǎn)物類似化合物為鐮刀菌酸 （ Fusarin）和黑色素（Melanin）。上述結(jié)果表明，香灰菌合成的次生代謝物種類明顯多于毛韌革菌，說明銀耳的伴生菌對其菌絲子實(shí)體的食藥用價(jià)值可能更加重要。

3討論與結(jié)論

銀耳和金耳人工栽培的產(chǎn)量和品質(zhì)形成的關(guān)鍵影響因素是其對基質(zhì)原料的利用能力大小[19-20]，2種食用菌的段木栽培和袋料栽培基質(zhì)主料都是以木質(zhì)纖維素為主。單一型的銀耳和金耳沒有分解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的能力，必須依靠與親和性的伴生菌混合培養(yǎng)才能正常出菇[4]。因此，香灰菌或毛韌革菌基因組中CAZymes的種類和組成在一定程度上能反映出銀耳或金耳對培養(yǎng)基質(zhì)中各種組分的利用規(guī)律。本研究發(fā)現(xiàn)，香灰菌和毛韌革菌CAZymes基因數(shù)量相近，其中 GH 和 AA 家族的CAZymes基因數(shù)量最多。這與豬塊菌（Choiro‐myces venosus）、普通羊肚菌（Morchella coni ‐ ca）、灰擬鬼傘（Coprinopsis cinerea）等食藥用菌基因組分析結(jié)果相似[13]。目前已知食藥用菌基因組中至少26個(gè) GHs亞家族的CAZymes基因可以參與植物木質(zhì)纖維素的降解，而 AA 亞家族在已知的食藥用菌基因組中也廣泛存在，參與木質(zhì)素和相關(guān)芳香化合物的降解和轉(zhuǎn)化[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，香灰菌和毛韌革菌的 CWDEs 主要以纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶為主。木質(zhì)纖維素降解相關(guān) CWDEs 由21種酶類組成，其中內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纖維二糖脫氫酶、內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、漆酶、芳醇氧化酶、多糖單加氧酶的數(shù)量較多。香灰菌或毛韌革菌還具有一定數(shù)量的果膠酶和少量淀粉酶，說明2種伴生菌還可利用植物細(xì)胞壁中膠層和細(xì)胞內(nèi)淀粉。目前在伴生菌與銀耳或金耳混合培養(yǎng)研究中可檢測到纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶、木聚糖酶、漆酶、淀粉酶、果膠酶和蛋白酶等一系列胞外酶的表達(dá)[22-23]，說明木質(zhì)纖維素降解成為小分子糖的過程復(fù)雜，需要這一系列酶的協(xié)同作用。

人工栽培中銀耳相較于金耳生長更加穩(wěn)定，栽培技術(shù)更加成熟[24]。出菇不整齊、生物轉(zhuǎn)化率低是金耳袋料栽培的主要問題，嚴(yán)重影響金耳袋料栽培的推廣和規(guī)模化生產(chǎn)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，香灰菌木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的 CWDEs數(shù)量多于毛韌革菌，說明香灰菌的木質(zhì)纖維素利用效率更高，且能適應(yīng)多種木質(zhì)纖維素。已有研究表明，銀耳除了可以利用常規(guī)的木屑、棉籽殼，還能利用油菜秸稈、玉米秸稈、菌草等多種栽培主料[26-29]。而金耳栽培主料目前以木屑、棉籽殼和玉米芯為主[30]。本研究還發(fā)現(xiàn)，香灰菌半纖維素酶的編碼基因數(shù)量更多，而毛韌革菌纖維素酶和木質(zhì)素酶的編碼基因數(shù)量更多，說明香灰菌和毛韌革菌對木質(zhì)纖維素的偏好性有一定差異。已有研究表明，基質(zhì)中木質(zhì)纖維素組成、結(jié)構(gòu)和各成分的比例不同，直接影響銀耳和金耳子實(shí)體形成的快慢、產(chǎn)量和質(zhì)地，最終影響其營養(yǎng)成分和風(fēng)味特征[19， 31]。不同纖維素含量培養(yǎng)料也會(huì)造成平菇營養(yǎng)成分的顯著差異[32]。因此，銀耳和金耳在袋料栽培基質(zhì)配方優(yōu)化時(shí)，應(yīng)注意木質(zhì)纖維素的組成和含量，可考慮銀耳選用富含半纖維素的主料，而金耳選用富含纖維素和木質(zhì)素的主料。

目前銀耳和金耳的食藥用研究主要集中在多糖物質(zhì)[33-34]，伴生菌對銀耳或金耳的藥用活性價(jià)值，特別是其次生代謝物活性和應(yīng)用的研究還較少。本研究發(fā)現(xiàn)，香灰菌和毛韌革菌基因組中含有多種次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，其產(chǎn)物主要屬于非核糖體多肽合成酶類、萜類和聚酮類。非核糖體肽合成酶合成的非核糖體肽是抗生素、免疫抑制劑的重要化合物來源，具有抗菌、殺蟲、抗膽固醇和抗癌等活性[35]。萜類化合物是由異戊二烯單位組成的碳?xì)浠衔?，大型真菌中分離的單萜、倍半萜、二萜和三萜類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖等藥理活性[36]。聚酮類化合物是由聚酮合酶催化合成的天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫抑制、抗菌活性、抗炎癥和抗寄生蟲等生物活性[37]。

香灰菌和毛韌革菌合成次生代謝產(chǎn)物種類具有明顯差異，說明2種伴生菌的生物活性和藥理成分具有一定區(qū)別;同時(shí)，香灰菌合成的次生代謝產(chǎn)物數(shù)量多于毛韌革菌，說明香灰菌對銀耳生物活性和藥理價(jià)值的貢獻(xiàn)高于毛韌革菌對金耳。根據(jù)已鑒定出的次生代謝物類型和類似的化合物生物活性，可將2種伴生菌次生代謝物的功能分為以下4類：（1）響應(yīng)環(huán)境變化的化學(xué)防御物質(zhì)。香灰菌能夠合成Dimethylcoprogen和神經(jīng)孢菌素 A （Neurosporin A）。Dimethylcoprogen屬于異羥肟酸鹽類鐵載體，能夠幫助真菌競爭環(huán)境中的鐵元素[38];神經(jīng)孢菌素 A （Neurosporin A）在粗糙脈孢菌中可以調(diào)控食真菌動(dòng)物的食物偏好性[39]。毛韌革菌能夠合成黑色素 （Melanin）。黑色素（Melanin）在真菌細(xì)胞壁中的積累，可以保護(hù)菌體免受紫外線等環(huán)境壓力的影響[40]。明確伴生菌次生代謝物對銀耳或金耳的環(huán)境適應(yīng)性作用，能夠?yàn)榘樯c銀耳屬食用菌互作研究提供新思路。（2）食藥用活性物質(zhì)。香灰菌能夠合成安卡黃素（Ankaflavin）、紅曲霉素（monasci）、Aspiro‐ chlorine、Burnettramic acid A、角鯊烯素 S1（Squalestatin S1）、β-內(nèi)酯（ Beta-lactone）和吲哚（Indole）。安卡黃素（Ankaflavin）和紅曲霉素（monasci）是曲霉屬真菌產(chǎn)生的天然聚酮類化合物色素，具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、細(xì)胞毒性、殺線蟲和抗炎活性等效用[41];Aspirochlorine是曲霉中發(fā)現(xiàn)的一種高選擇性和高活力的真菌蛋白質(zhì)合成抑制物質(zhì)[42]; Bur ‐nettramic acid A是在曲霉屬中發(fā)現(xiàn)的一類新型抗生素，具有抗菌、抗真菌、抗病毒等活性[43];角鯊烯素 S1（Squalestatin S1）是一種新型萜烯類化合物，具有治療高膽固醇和廣譜抗真菌的特性[44];吲哚及其衍生物具有抗癌，降血壓等功效[45];β-內(nèi)酯中的β-丙內(nèi)酯可作為血漿、疫苗的殺菌消毒劑[46]。毛韌革菌能夠合成 Trans-AT 聚酮化合物，Trans-AT 聚酮化合物目前主要作為抗生素進(jìn)行醫(yī)學(xué)應(yīng)用[47]。（3）植物病原真菌毒素。香灰菌能夠合成甜菜酮（ Betaenone）、茄吡酮（Solanapyrone）和伏馬菌素（ Fumonisin）。甜菜酮是從甜菜莖點(diǎn)霉菌（ Phomabetae）中分離出來的一種植物毒素，可導(dǎo)致甜菜枯萎[48];伏馬菌素（ Fumonisin）是從定殖于小麥、玉米等谷物作物中的鐮刀菌屬（ Fusarium sp.）中分離的一種聚酮類真菌毒素，對哺乳動(dòng)物具有急性毒性和致癌性[49];茄吡酮（Solanapyrone）是多種植物病原真菌的致病因子，能夠選擇性抑制哺乳動(dòng)物 DNA 聚合酶活性[50]。毛韌革菌可形成鐮刀菌酸（ Fusa‐rin），該毒素是鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種非寄主選擇性聚酮類毒素，能夠破壞植物細(xì)胞的代謝機(jī)能，還對哺乳動(dòng)物具有致癌性[51]。在進(jìn)行銀耳或金耳活性成分發(fā)酵研究時(shí)，需考慮降低對人體具有潛在危害的次生代謝產(chǎn)物含量，優(yōu)化相關(guān)發(fā)酵條件，保證食品安全。（4）未知功能。香灰菌和毛韌革菌基因組還有大部分的未知功能次生代謝物合成基因簇，其合成產(chǎn)物具體類型和功能目前還無法與已有的食藥用菌次生代謝產(chǎn)物的生物活性研究結(jié)果進(jìn)行匹配。例如毛韌革菌目前已分離出112種次生代謝產(chǎn)物，包括倍半萜類、甾醇類、苯甲酸酯類、苯丙氨酸衍生物以及一些雜環(huán)化合物等，但這些代謝產(chǎn)物生物合成途徑的研究較少[52]。因此本研究對香灰菌和毛韌革菌的次生代謝物合成相關(guān)基因簇的分析，有望為理解香灰菌和毛韌革菌的生物活性物質(zhì)合成機(jī)制和挖掘新型生物活性物質(zhì)提供依據(jù)。

本研究通過挖掘香灰菌和毛韌革菌基因組，對2種伴生菌CAZymes、CWDEs 和次生代謝物合成基因進(jìn)行了比較分析，明確了2種伴生菌對銀耳和金耳營養(yǎng)吸收及食藥用活性相關(guān)分子遺傳基礎(chǔ)，為伴生菌與2種食用菌互作機(jī)制研究提供了參考。

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