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2021-09-30 02:56:32陸菲吳玉麗范貝劉珍珍梁鵬飛李薇查定軍
聽力學(xué)及言語疾病雜志 2021年5期
陸菲 吳玉麗 范貝 劉珍珍 梁鵬飛 李薇 查定軍
腱糖蛋白家族是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種多功能、表達(dá)模式各異的糖蛋白家族[1]，由N-末端頭區(qū)、半胱氨酸域、表皮生長因子(EGF)重復(fù)序列、Ⅲ型纖維連接蛋白(FN-Ⅲ)樣重復(fù)結(jié)構(gòu)、C-末端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)組成[2]。家族成員包括腱糖蛋白-C(tenascin-C)、腱糖蛋白-R(tenascin-R)、腱糖蛋白-X(tenascin-X)及腱糖蛋白-W(tenascin-W，TN-W)。Tenascin-W 由TNN基因編碼，搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，在人類該基因稱為TNN，位于常染色體1q23-24。在鼠類稱為Tnn，在魚類為Tnw。研究發(fā)現(xiàn)TN-W蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多由神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)[3]。在人體多數(shù)正常的組織中，TN-W幾乎不表達(dá)，而在腫瘤組織中顯著表達(dá)[4]。此外，研究發(fā)現(xiàn)TN-W可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[5,6]、促進(jìn)血管生成[7]及腫瘤的轉(zhuǎn)移[8]，這使得TN-W有可能成為腫瘤間質(zhì)標(biāo)記物和抗癌治療的新靶點(diǎn)。
TN-C 和TN-W可通過N-末端的二硫鍵形成六臂體結(jié)構(gòu)[1]，二者結(jié)構(gòu)在腱糖蛋白家族中最接近，推測其功能相似。TN-C蛋白中某些結(jié)構(gòu)的功能已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，因而TN-W蛋白潛在的功能可通過目前已發(fā)表的研究結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。TN-W、TN-C的FN-Ⅲ樣結(jié)構(gòu)均包含整合素結(jié)合位點(diǎn)，可以結(jié)合并激活toll樣受體4(TLR4)[9]，且EGF重復(fù)序列幾乎相同，后者被證實(shí)可以激活EGF受體[10]。二者可以與Wnt3a結(jié)合，可能通過調(diào)節(jié)Wnt經(jīng)典通路發(fā)揮作用[11]。
已有對耳聾家系的研究證實(shí)TNC基因的突變可引起常染色體顯性遺傳性聾，該基因定位于常染色體9q31.3-q34.3，編碼TN-C ，其突變引起的耳聾為漸進(jìn)性聽力下降[12]。研究表明TN-C在毒性損傷所致的鳥類前庭器官感覺受體的修復(fù)中發(fā)揮作用[13]，推測其突變可能引起耳蝸內(nèi)修復(fù)功能的異常。前期工作已證實(shí)Tnn基因在小鼠耳蝸中有表達(dá)，且主要定位于螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons, SGNs)[14]，本研究分析Tnn基因敲除后對小鼠聽覺功能的影響，初步探討其在聽覺系統(tǒng)中的作用。
1 材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)用C57BL/6野生型(wild-type，WT)小鼠來源于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物房，C57BL/6Tnn基因敲除(knock-out, KO)小鼠委托北京百奧賽圖公司構(gòu)建，設(shè)計(jì)敲除Tnn基因外顯子2-4，sgRNAs分別設(shè)計(jì)在內(nèi)含子1-2和內(nèi)含子4-5之間的非保守區(qū)中，f1雜合子小鼠與cre-deleter小鼠交配，得到Tnn雜合全敲小鼠(Tnn+/-)，將其飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)SPF級動(dòng)物房。取出生后1 m、2 m、3 m各階段WT和Tnn+/-小鼠各8只用于聽力檢測，另分別取3只野生型P2 m、P3 m小鼠耳蝸制作冰凍切片用于免疫熒光染色。
1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑 水合氯醛購自上海山浦化工有限公司，2×Taq Mastermix、DNA marker(MD2000)購自中國天根生化科技公司，PCR儀及凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，DPOAE及ABR檢測儀購自美國TDT公司。Tnn抗體、免疫熒光二抗抗體購自美國Invitrogen公司，Ⅲ型β-tubulin抗體購自美國Gene Tex公司，DAPI購自北京Solarbio公司。驢血清購自西安晶彩生物科技公司，TnnKO小鼠鑒定引物由擎科澤西生物科技公司合成。免疫熒光抗體稀釋液購自上海碧云天生物技術(shù)公司。
1.3免疫熒光檢測tenascin-W 基于前期已發(fā)表的結(jié)果[16]，tenascin-W在1 m小鼠耳蝸中主要表達(dá)于SGNs。此次實(shí)驗(yàn)對出生后2月、3月(2 m、3 m)小鼠耳蝸進(jìn)行取材，方法同前期研究[16]。采用免疫熒光的方法檢測小鼠耳蝸中的tenascin-W的表達(dá)情況，Ⅲ型β-tubulin標(biāo)記SGNs。Triton打孔，驢血清37 ℃封閉30 min，一抗4℃孵育3d，二抗4℃孵育1 d，DAPI染核10 min。同時(shí)設(shè)置PBS空白對照組。
1.4TnnKO小鼠基因型鑒定 將百奧賽圖構(gòu)建的Tnn+/-小鼠放置于空軍軍醫(yī)大學(xué)SPF級動(dòng)物房進(jìn)行繁殖、擴(kuò)群，Tnn+/-雄鼠與Tnn+/-雌鼠進(jìn)行交配，新生小鼠于出生后第3天至第7天進(jìn)行編號，并剪取約2 mm鼠尾進(jìn)行鑒定。根據(jù)公司提供的方法及引物進(jìn)行小鼠基因型的驗(yàn)證及鑒定，鑒定引物設(shè)計(jì)如下(表1)。
表1 鼠尾鑒定PCR引物設(shè)計(jì)序列
鑒定方法如下：剪取鼠尾2 mm放入PCR管中，每管加入180 μl 50 mM的NaOH于PCR儀消化90 min；離心后每管加入20 μl的1 M Tris-HCl，渦輪震蕩1 min；配置25 μl PCR反應(yīng)體系，ddH2O 9.8 μl，2×Taq Mastermix 12.5 μl，正向引物(Forward Primer，F(xiàn)P)0.1 μl，反向引物(Reverse Primer,RP)0.1 μl，DNA模板2.5 μl；PCR反應(yīng)條件設(shè)置：94 ℃預(yù)變性4 min 30 s，PCR反應(yīng)采用三步法，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次。PCR反應(yīng)完成后將樣品離心，于1%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳儀設(shè)置150 V恒壓，20 min后于凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影。
1.5聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測 對不同月齡(1 m、2 m、3 m)的Tnn+/-小鼠與WT小鼠分別進(jìn)行短聲(click)和短純音ABR檢測并進(jìn)行比較，每個(gè)階段每組至少測8只小鼠。5%水合氯醛于小鼠腹腔注射麻醉后置于雙側(cè)隔聲屏蔽室恒溫板上，參考電極置于顱中線前囟處正中皮下，記錄電極置于測試耳耳后皮下，接地電極置于鼠尾根部皮下。以交替短聲和短純音刺激進(jìn)行檢測，由MF1 1172耳機(jī)輸出，聽覺檢測儀器濾波范圍100～3 000 Hz，疊加1 024次，由功放喇叭輸出，耳機(jī)距小鼠外耳道口1 cm。刺激聲強(qiáng)度為90 dB SPL的短聲(頻率21次/秒)和短純音(檢測頻率4、8、16、24、32 kHz)開始，以10 dB步幅遞減，以能正常引出波Ⅰ的最小刺激強(qiáng)度為受試耳的ABR閾值。
2 結(jié)果
2.1Tnn基因在2 m、3 m的WT小鼠耳蝸中的表達(dá) 高倍鏡下(×60)觀察2 m、3 m小鼠耳蝸SG，用DAPI染核，Ⅲ型β-tubulin抗體特異性標(biāo)記SGNs顯示目的蛋白與核熒光顯示部位不重合，Tnn主要表達(dá)于SGNs胞體的胞漿中，PBS空白對照均未顯示目的蛋白紅色熒光(圖1)。
圖1 耳蝸冰凍切片熒光染色 顯示P2 m、P3 mWT小鼠 螺旋神經(jīng)節(jié)中tenascin-W與Ⅲ型β-tubulin共定位(×60);藍(lán)色熒光為DA-PI,紅色熒光為目的蛋白tenascin-W,綠色熒光為Ⅲ型β-tubulin,control為不加tenascin-W抗體的PBS空白對照。bar=20 μm
2.2TnnKO小鼠鑒定結(jié)果 因長度為4 433 bp的引物擴(kuò)增不出，加入Tnn-Mut-5’-F及Tnn-Mut-5’-R這對引物擴(kuò)增出530的片段即表示含有Tnn突變型等位基因(Mut)。由Tnn-WT-5’-F及Tnn-WT-5’-R引物擴(kuò)增出308 bp片段即表示含有野生型等位基因(表2)。Tnn+/-雄鼠與雌鼠進(jìn)行交配，經(jīng)過一段時(shí)間繁殖，新生小鼠中未鑒定出Tnn-/-小鼠，只繁殖出野生型Tnn+/+及全敲雜合Tnn+/-小鼠。
表2 Tnn 突變小鼠鑒定結(jié)果
對Tnn+/-雄鼠與Tnn+/-雌鼠交配后的孕鼠，取胚胎期的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，在胚胎期小鼠中仍未鑒定到Tnn-/-小鼠(圖2)。
圖2 Tnn KO小鼠鼠尾鑒定 電泳結(jié)果出現(xiàn)308 bp條帶提示含有野生型等位基因,出現(xiàn)530 bp條帶提示含Tnn突變型等位基因。圖左側(cè)條帶為小鼠鼠尾鑒定為野生型(+/+),圖中間條帶為鑒定結(jié)果為Tnn雜合全敲小鼠(+/-),圖右側(cè)條帶為marker。
2.3Tnn+/-小鼠ABR閾值檢測結(jié)果 隨著小鼠鼠齡的增長，Tnn+/-小鼠與WT型小鼠相比，其click-ABR閾值逐漸升高，在1月、2月齡時(shí)閾值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在3月齡小鼠，各頻率反應(yīng)閾均有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3)。Tnn+/-小鼠的短純音ABR閾值亦升高，在3月齡時(shí)與WT型小鼠相比在4、8、16、24、32 kHz處差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。
表3 野生型和Tnn+/-小鼠不同月齡click-ABR閾值比較
表4 不同月齡WT小鼠和Tnn+/-小鼠各頻率短純音ABR閾值比較
3 討論
本課題組前期已驗(yàn)證Tnn在不同天齡小鼠(P1、P3、P7、P14、P28)耳蝸中的表達(dá)及定位[14]，提示tenascin-W在P1至P28的小鼠耳蝸均有表達(dá)，在P7及小于P7小鼠目的蛋白彌漫表達(dá)于蝸管結(jié)構(gòu)，包括血管紋、Corti器及螺旋神經(jīng)節(jié)；P14、P28時(shí)在Corti器不表達(dá)，而在螺旋神經(jīng)節(jié)熒光強(qiáng)度仍較強(qiáng)，不同發(fā)育時(shí)期血管紋處均檢測到tenascin-W，且有下降趨勢。本研究顯示Tnn基因在2 m、3 m小鼠耳蝸中有表達(dá)，且主要定位于SGNs中，不與DAPI共染，與前期研究結(jié)果一致，亦佐證了文獻(xiàn)報(bào)道的Tnn多由神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)[3]。
目前尚無關(guān)于Tnn基因敲除小鼠的特征描述，有研究表明Tnn在腎、腦、脾、小腸、肝臟、骨膜等重要部位均有表達(dá)[1,3]，推測Tnn在小鼠的正常生長發(fā)育中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過Tnn+/-小鼠的繁殖未得到Tnn-/-小鼠，可能是由于Tnn在小鼠重要部位表達(dá)，其表達(dá)缺失可導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡或胚胎不發(fā)育；故選用Tnn+/-小鼠進(jìn)行后續(xù)聽覺功能的研究，觀察Tnn表達(dá)量的下降對聽覺的影響。結(jié)果顯示，Tnn+/-小鼠聽力與野生型相比，表現(xiàn)為進(jìn)行性的聽力下降，且在3 m時(shí)，click ABR和短純音ABR反應(yīng)閾值均升高，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證實(shí)Tnn的異常表達(dá)可影響小鼠聽覺功能。
Tenascin-C是一個(gè)經(jīng)典的黏附調(diào)節(jié)蛋白[2]。黏附調(diào)節(jié)功能可影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖及分化。體外研究顯示細(xì)胞可與tenascin-C結(jié)合，但一般不會形成擴(kuò)散及黏著斑。細(xì)胞在加入了纖連蛋白的培養(yǎng)基上會形成黏著斑，但當(dāng)加入tenascin-C時(shí)就會失去這種粘連。Tenascin-W也有作為黏附調(diào)節(jié)蛋白的潛力。例如，成肌細(xì)胞來源的成骨小鼠細(xì)胞系C2C12在纖連蛋白培養(yǎng)基中會擴(kuò)散并形成黏著斑，但在加入tenascin-W的培養(yǎng)基中，C2C12維持星形或圓形的形態(tài)，不形成黏著斑或應(yīng)力纖維；并且C2C12在加入了tenascin-W的纖連蛋白培養(yǎng)基或是纖連蛋白與tenascin-W的混合培養(yǎng)基中，細(xì)胞都會維持星形的形狀[15]。文獻(xiàn)報(bào)道tenascin-W的表達(dá)量的改變可以引起C2C12細(xì)胞(小鼠成肌細(xì)胞)黏附功能的異常[1]，tenascin-W表達(dá)異常可能與細(xì)胞黏附功能異常相關(guān)。由此推測Tnn表達(dá)量下降引起細(xì)胞黏附功能異常，導(dǎo)致小鼠聽力進(jìn)行性下降。
有研究通過原位雜交證實(shí)Tnn在小鼠海馬體神經(jīng)元中表達(dá)，影響海馬體神經(jīng)元的神經(jīng)突生長及神經(jīng)元遷移[1]，提示Tnn在神經(jīng)元發(fā)育中的潛在作用。SGNs是特異的雙極神經(jīng)元及聽覺系統(tǒng)的初級神經(jīng)元，伸出樹突與毛細(xì)胞基底部形成突觸連接，可激發(fā)產(chǎn)生動(dòng)作電位，將毛細(xì)胞的聽覺信號傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[18]。推測Tnn表達(dá)異常或可影響SGNs神經(jīng)突的向外生長及細(xì)胞遷移，導(dǎo)致聽覺信號的傳入受阻，引起聽功能受損。
本研究證實(shí)Tnn在聽覺系統(tǒng)中表達(dá)且具有重要作用，其異常表達(dá)可引起小鼠聽力下降，但機(jī)制需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，未來可通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白組學(xué)進(jìn)行相關(guān)通路的篩選，對其致聾機(jī)制進(jìn)行更深入、更精準(zhǔn)的研究。
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TN-C 和TN-W可通過N-末端的二硫鍵形成六臂體結(jié)構(gòu)[1]，二者結(jié)構(gòu)在腱糖蛋白家族中最接近，推測其功能相似。TN-C蛋白中某些結(jié)構(gòu)的功能已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，因而TN-W蛋白潛在的功能可通過目前已發(fā)表的研究結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。TN-W、TN-C的FN-Ⅲ樣結(jié)構(gòu)均包含整合素結(jié)合位點(diǎn)，可以結(jié)合并激活toll樣受體4(TLR4)[9]，且EGF重復(fù)序列幾乎相同，后者被證實(shí)可以激活EGF受體[10]。二者可以與Wnt3a結(jié)合，可能通過調(diào)節(jié)Wnt經(jīng)典通路發(fā)揮作用[11]。
已有對耳聾家系的研究證實(shí)TNC基因的突變可引起常染色體顯性遺傳性聾，該基因定位于常染色體9q31.3-q34.3，編碼TN-C ，其突變引起的耳聾為漸進(jìn)性聽力下降[12]。研究表明TN-C在毒性損傷所致的鳥類前庭器官感覺受體的修復(fù)中發(fā)揮作用[13]，推測其突變可能引起耳蝸內(nèi)修復(fù)功能的異常。前期工作已證實(shí)Tnn基因在小鼠耳蝸中有表達(dá)，且主要定位于螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons, SGNs)[14]，本研究分析Tnn基因敲除后對小鼠聽覺功能的影響，初步探討其在聽覺系統(tǒng)中的作用。
1 材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)用C57BL/6野生型(wild-type，WT)小鼠來源于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物房，C57BL/6Tnn基因敲除(knock-out, KO)小鼠委托北京百奧賽圖公司構(gòu)建，設(shè)計(jì)敲除Tnn基因外顯子2-4，sgRNAs分別設(shè)計(jì)在內(nèi)含子1-2和內(nèi)含子4-5之間的非保守區(qū)中，f1雜合子小鼠與cre-deleter小鼠交配，得到Tnn雜合全敲小鼠(Tnn+/-)，將其飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)SPF級動(dòng)物房。取出生后1 m、2 m、3 m各階段WT和Tnn+/-小鼠各8只用于聽力檢測，另分別取3只野生型P2 m、P3 m小鼠耳蝸制作冰凍切片用于免疫熒光染色。
1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑 水合氯醛購自上海山浦化工有限公司，2×Taq Mastermix、DNA marker(MD2000)購自中國天根生化科技公司，PCR儀及凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，DPOAE及ABR檢測儀購自美國TDT公司。Tnn抗體、免疫熒光二抗抗體購自美國Invitrogen公司，Ⅲ型β-tubulin抗體購自美國Gene Tex公司，DAPI購自北京Solarbio公司。驢血清購自西安晶彩生物科技公司，TnnKO小鼠鑒定引物由擎科澤西生物科技公司合成。免疫熒光抗體稀釋液購自上海碧云天生物技術(shù)公司。
1.3免疫熒光檢測tenascin-W 基于前期已發(fā)表的結(jié)果[16]，tenascin-W在1 m小鼠耳蝸中主要表達(dá)于SGNs。此次實(shí)驗(yàn)對出生后2月、3月(2 m、3 m)小鼠耳蝸進(jìn)行取材，方法同前期研究[16]。采用免疫熒光的方法檢測小鼠耳蝸中的tenascin-W的表達(dá)情況，Ⅲ型β-tubulin標(biāo)記SGNs。Triton打孔，驢血清37 ℃封閉30 min，一抗4℃孵育3d，二抗4℃孵育1 d，DAPI染核10 min。同時(shí)設(shè)置PBS空白對照組。
1.4TnnKO小鼠基因型鑒定 將百奧賽圖構(gòu)建的Tnn+/-小鼠放置于空軍軍醫(yī)大學(xué)SPF級動(dòng)物房進(jìn)行繁殖、擴(kuò)群，Tnn+/-雄鼠與Tnn+/-雌鼠進(jìn)行交配，新生小鼠于出生后第3天至第7天進(jìn)行編號，并剪取約2 mm鼠尾進(jìn)行鑒定。根據(jù)公司提供的方法及引物進(jìn)行小鼠基因型的驗(yàn)證及鑒定，鑒定引物設(shè)計(jì)如下(表1)。
表1 鼠尾鑒定PCR引物設(shè)計(jì)序列
鑒定方法如下：剪取鼠尾2 mm放入PCR管中，每管加入180 μl 50 mM的NaOH于PCR儀消化90 min；離心后每管加入20 μl的1 M Tris-HCl，渦輪震蕩1 min；配置25 μl PCR反應(yīng)體系，ddH2O 9.8 μl，2×Taq Mastermix 12.5 μl，正向引物(Forward Primer，F(xiàn)P)0.1 μl，反向引物(Reverse Primer,RP)0.1 μl，DNA模板2.5 μl；PCR反應(yīng)條件設(shè)置：94 ℃預(yù)變性4 min 30 s，PCR反應(yīng)采用三步法，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次。PCR反應(yīng)完成后將樣品離心，于1%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳儀設(shè)置150 V恒壓，20 min后于凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影。
1.5聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測 對不同月齡(1 m、2 m、3 m)的Tnn+/-小鼠與WT小鼠分別進(jìn)行短聲(click)和短純音ABR檢測并進(jìn)行比較，每個(gè)階段每組至少測8只小鼠。5%水合氯醛于小鼠腹腔注射麻醉后置于雙側(cè)隔聲屏蔽室恒溫板上，參考電極置于顱中線前囟處正中皮下，記錄電極置于測試耳耳后皮下，接地電極置于鼠尾根部皮下。以交替短聲和短純音刺激進(jìn)行檢測，由MF1 1172耳機(jī)輸出，聽覺檢測儀器濾波范圍100～3 000 Hz，疊加1 024次，由功放喇叭輸出，耳機(jī)距小鼠外耳道口1 cm。刺激聲強(qiáng)度為90 dB SPL的短聲(頻率21次/秒)和短純音(檢測頻率4、8、16、24、32 kHz)開始，以10 dB步幅遞減，以能正常引出波Ⅰ的最小刺激強(qiáng)度為受試耳的ABR閾值。
2 結(jié)果
2.1Tnn基因在2 m、3 m的WT小鼠耳蝸中的表達(dá) 高倍鏡下(×60)觀察2 m、3 m小鼠耳蝸SG，用DAPI染核，Ⅲ型β-tubulin抗體特異性標(biāo)記SGNs顯示目的蛋白與核熒光顯示部位不重合，Tnn主要表達(dá)于SGNs胞體的胞漿中，PBS空白對照均未顯示目的蛋白紅色熒光(圖1)。
圖1 耳蝸冰凍切片熒光染色 顯示P2 m、P3 mWT小鼠 螺旋神經(jīng)節(jié)中tenascin-W與Ⅲ型β-tubulin共定位(×60);藍(lán)色熒光為DA-PI,紅色熒光為目的蛋白tenascin-W,綠色熒光為Ⅲ型β-tubulin,control為不加tenascin-W抗體的PBS空白對照。bar=20 μm
2.2TnnKO小鼠鑒定結(jié)果 因長度為4 433 bp的引物擴(kuò)增不出，加入Tnn-Mut-5’-F及Tnn-Mut-5’-R這對引物擴(kuò)增出530的片段即表示含有Tnn突變型等位基因(Mut)。由Tnn-WT-5’-F及Tnn-WT-5’-R引物擴(kuò)增出308 bp片段即表示含有野生型等位基因(表2)。Tnn+/-雄鼠與雌鼠進(jìn)行交配，經(jīng)過一段時(shí)間繁殖，新生小鼠中未鑒定出Tnn-/-小鼠，只繁殖出野生型Tnn+/+及全敲雜合Tnn+/-小鼠。
表2 Tnn 突變小鼠鑒定結(jié)果
對Tnn+/-雄鼠與Tnn+/-雌鼠交配后的孕鼠，取胚胎期的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，在胚胎期小鼠中仍未鑒定到Tnn-/-小鼠(圖2)。
圖2 Tnn KO小鼠鼠尾鑒定 電泳結(jié)果出現(xiàn)308 bp條帶提示含有野生型等位基因,出現(xiàn)530 bp條帶提示含Tnn突變型等位基因。圖左側(cè)條帶為小鼠鼠尾鑒定為野生型(+/+),圖中間條帶為鑒定結(jié)果為Tnn雜合全敲小鼠(+/-),圖右側(cè)條帶為marker。
2.3Tnn+/-小鼠ABR閾值檢測結(jié)果 隨著小鼠鼠齡的增長，Tnn+/-小鼠與WT型小鼠相比，其click-ABR閾值逐漸升高，在1月、2月齡時(shí)閾值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在3月齡小鼠，各頻率反應(yīng)閾均有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3)。Tnn+/-小鼠的短純音ABR閾值亦升高，在3月齡時(shí)與WT型小鼠相比在4、8、16、24、32 kHz處差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。
表3 野生型和Tnn+/-小鼠不同月齡click-ABR閾值比較
表4 不同月齡WT小鼠和Tnn+/-小鼠各頻率短純音ABR閾值比較
3 討論
本課題組前期已驗(yàn)證Tnn在不同天齡小鼠(P1、P3、P7、P14、P28)耳蝸中的表達(dá)及定位[14]，提示tenascin-W在P1至P28的小鼠耳蝸均有表達(dá)，在P7及小于P7小鼠目的蛋白彌漫表達(dá)于蝸管結(jié)構(gòu)，包括血管紋、Corti器及螺旋神經(jīng)節(jié)；P14、P28時(shí)在Corti器不表達(dá)，而在螺旋神經(jīng)節(jié)熒光強(qiáng)度仍較強(qiáng)，不同發(fā)育時(shí)期血管紋處均檢測到tenascin-W，且有下降趨勢。本研究顯示Tnn基因在2 m、3 m小鼠耳蝸中有表達(dá)，且主要定位于SGNs中，不與DAPI共染，與前期研究結(jié)果一致，亦佐證了文獻(xiàn)報(bào)道的Tnn多由神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)[3]。
目前尚無關(guān)于Tnn基因敲除小鼠的特征描述，有研究表明Tnn在腎、腦、脾、小腸、肝臟、骨膜等重要部位均有表達(dá)[1,3]，推測Tnn在小鼠的正常生長發(fā)育中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過Tnn+/-小鼠的繁殖未得到Tnn-/-小鼠，可能是由于Tnn在小鼠重要部位表達(dá)，其表達(dá)缺失可導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡或胚胎不發(fā)育；故選用Tnn+/-小鼠進(jìn)行后續(xù)聽覺功能的研究，觀察Tnn表達(dá)量的下降對聽覺的影響。結(jié)果顯示，Tnn+/-小鼠聽力與野生型相比，表現(xiàn)為進(jìn)行性的聽力下降，且在3 m時(shí)，click ABR和短純音ABR反應(yīng)閾值均升高，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證實(shí)Tnn的異常表達(dá)可影響小鼠聽覺功能。
Tenascin-C是一個(gè)經(jīng)典的黏附調(diào)節(jié)蛋白[2]。黏附調(diào)節(jié)功能可影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖及分化。體外研究顯示細(xì)胞可與tenascin-C結(jié)合，但一般不會形成擴(kuò)散及黏著斑。細(xì)胞在加入了纖連蛋白的培養(yǎng)基上會形成黏著斑，但當(dāng)加入tenascin-C時(shí)就會失去這種粘連。Tenascin-W也有作為黏附調(diào)節(jié)蛋白的潛力。例如，成肌細(xì)胞來源的成骨小鼠細(xì)胞系C2C12在纖連蛋白培養(yǎng)基中會擴(kuò)散并形成黏著斑，但在加入tenascin-W的培養(yǎng)基中，C2C12維持星形或圓形的形態(tài)，不形成黏著斑或應(yīng)力纖維；并且C2C12在加入了tenascin-W的纖連蛋白培養(yǎng)基或是纖連蛋白與tenascin-W的混合培養(yǎng)基中，細(xì)胞都會維持星形的形狀[15]。文獻(xiàn)報(bào)道tenascin-W的表達(dá)量的改變可以引起C2C12細(xì)胞(小鼠成肌細(xì)胞)黏附功能的異常[1]，tenascin-W表達(dá)異常可能與細(xì)胞黏附功能異常相關(guān)。由此推測Tnn表達(dá)量下降引起細(xì)胞黏附功能異常，導(dǎo)致小鼠聽力進(jìn)行性下降。
有研究通過原位雜交證實(shí)Tnn在小鼠海馬體神經(jīng)元中表達(dá)，影響海馬體神經(jīng)元的神經(jīng)突生長及神經(jīng)元遷移[1]，提示Tnn在神經(jīng)元發(fā)育中的潛在作用。SGNs是特異的雙極神經(jīng)元及聽覺系統(tǒng)的初級神經(jīng)元，伸出樹突與毛細(xì)胞基底部形成突觸連接，可激發(fā)產(chǎn)生動(dòng)作電位，將毛細(xì)胞的聽覺信號傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[18]。推測Tnn表達(dá)異常或可影響SGNs神經(jīng)突的向外生長及細(xì)胞遷移，導(dǎo)致聽覺信號的傳入受阻，引起聽功能受損。
本研究證實(shí)Tnn在聽覺系統(tǒng)中表達(dá)且具有重要作用，其異常表達(dá)可引起小鼠聽力下降，但機(jī)制需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，未來可通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白組學(xué)進(jìn)行相關(guān)通路的篩選，對其致聾機(jī)制進(jìn)行更深入、更精準(zhǔn)的研究。
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