基于高頻相移PQ-Sensor血凝傳感儀的研究*

扶 梅，司士輝*，陳金華，馮浪霞，張 潤(rùn)

(1.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410083；2.湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082)

血液循環(huán)是人體內(nèi)部物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕緩剑?dāng)其處于高凝狀態(tài)時(shí)，會(huì)伴隨冠心病、心肌梗塞、血栓栓塞等血液性疾病，直接危害生命健康[1]。血液粘度是反映血液粘滯性的指標(biāo)之一，體現(xiàn)了血液凝結(jié)狀態(tài)，其與纖維蛋白原的含量有關(guān)。因此，纖維蛋白原的測(cè)定能為許多疾病的預(yù)防、診斷、治療等提供重要依據(jù)[2]。

目前，凝血功能的測(cè)定大都以凝固法[3]為主，儀器通過(guò)監(jiān)測(cè)凝血因子引起的信號(hào)變化來(lái)反映血液凝固特性。基于不同響應(yīng)信號(hào)的變化，一些光學(xué)、電化學(xué)、聲學(xué)、磁性傳感器等已經(jīng)用于血凝檢測(cè)過(guò)程的研究[4-8]。壓電石英傳感器[9](Piezoelectric Quartz Sensor，PQ-Sensor)是一種新型、小型化剪切振蕩體聲波(BAW)聲學(xué)傳感測(cè)量?jī)x器，石英晶體在作厚度剪切振動(dòng)時(shí)，諧振參數(shù)對(duì)液體粘度變化敏感，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)凝血過(guò)程[10-11]。

常規(guī)壓電石英晶體傳感器的頻率表征系統(tǒng)由于存在固定時(shí)間無(wú)法精確監(jiān)測(cè)凝血瞬態(tài)過(guò)程，多次諧波及泛音頻率技術(shù)雖然可以提供良好的傳感性能，但是也受動(dòng)態(tài)分析的局限性，很難實(shí)現(xiàn)連續(xù)測(cè)量。而壓電石英晶體傳感器的固定頻率相位信號(hào)表征系統(tǒng)[12-14]能夠降低數(shù)據(jù)采集擬合時(shí)間，可以連續(xù)監(jiān)測(cè)響應(yīng)信號(hào)變化，可用于瞬態(tài)過(guò)程[15]研究。另外，壓電石英晶體的質(zhì)量靈敏度與其基頻有關(guān)，提高基頻可以顯著提高靈敏度。因此，考慮到上述兩方面的因素，本文開發(fā)了一種基于粘度傳感的高頻相移PQ-Sensor血凝傳感儀，研究了其在纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)溶液、定值質(zhì)控血漿、靜脈血漿中的凝血響應(yīng)。將儀器響應(yīng)信號(hào)與纖維蛋白原含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)，驗(yàn)證了其可行性、準(zhǔn)確性和實(shí)用性，為凝血功能的檢測(cè)提供了一定的指導(dǎo)意義。

1 PQ-Sensor血凝傳感儀的設(shè)計(jì)思路和實(shí)驗(yàn)方案

1.1 PQ-Sensor血凝傳感儀的設(shè)計(jì)思路

PQ-Sensor血凝傳感儀由傳感器、檢測(cè)片、控溫器等三部分組成，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。傳感器是PQ-Sensor血凝傳感儀的核心器件，能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)控制和檢測(cè)；檢測(cè)片是執(zhí)行傳感功能的敏感元件；控溫器采用PID調(diào)節(jié)用于凝血過(guò)程中溫度控制。通過(guò)這種模塊化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可集數(shù)據(jù)采集、顯示、儲(chǔ)存于一體，儀器小型便攜，有利于實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)。

圖1 PQ-Sensor血凝傳感儀的示意圖

1.2 PQ-Sensor血凝傳感儀的實(shí)驗(yàn)方案

纖維蛋白原是一種凝血功能蛋白質(zhì)，是凝血過(guò)程和血栓形成過(guò)程中的重要物質(zhì)，纖維蛋白原的含量測(cè)定也是凝血功能監(jiān)測(cè)的指標(biāo)之一[16]。本文的實(shí)驗(yàn)方案如圖2，利用PQ-Sensor血凝傳感儀分別對(duì)纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)定值血漿、靜脈血漿進(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)和對(duì)比實(shí)驗(yàn)的探究，對(duì)纖維蛋白原含量進(jìn)行即時(shí)定量檢測(cè)，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血功能的監(jiān)測(cè)與評(píng)估。

圖2 實(shí)驗(yàn)流程圖

2 PQ-Sensor血凝傳感儀的設(shè)計(jì)

2.1 傳感器的設(shè)計(jì)

圖3給出了傳感器的實(shí)物圖，其由Arduino Due微控制器、直接數(shù)字頻率合成器(DDS)、信號(hào)放大模塊、相敏檢波模塊、SD存儲(chǔ)卡和LED液晶顯示屏等組成，這些功能模塊共同構(gòu)建成PQ-Sensor血凝傳感儀的核心器件。其中，直接數(shù)字頻率合成器(DDS)是最重要的功能模塊，其包括相位累加器、相位-幅度變換器、數(shù)模轉(zhuǎn)換器、低通濾波器等，可以產(chǎn)生高度穩(wěn)定的頻率、相位和振幅可調(diào)的正弦信號(hào)，為系統(tǒng)提供高達(dá)400 MHz的激勵(lì)信號(hào)。

圖3 傳感器的實(shí)物圖

傳感器工作流程如圖4所示，采用LABVIEW軟件編程，在電腦上進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，通過(guò)Arduino Due微控制器輸入。Arduino Due微控制器采用被動(dòng)激勵(lì)相位測(cè)量的信號(hào)表征方法，控制DDS在一個(gè)固定的振幅和頻率點(diǎn)進(jìn)行掃頻激勵(lì)，產(chǎn)生正弦波信號(hào)。信號(hào)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)換、放大、濾波降噪等作用于檢測(cè)片，受壓電石英晶體表面負(fù)載影響，聲波的傳播發(fā)生變化。改變的信號(hào)經(jīng)濾波、衰減處理，經(jīng)相敏檢波器采集、鑒相調(diào)制，送入Arduino Due微控制器進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。最終，電阻抗信號(hào)經(jīng)過(guò)平滑和峰值計(jì)算，由LED液晶顯示屏在線記錄響應(yīng)信號(hào)與響應(yīng)時(shí)間，由SD存儲(chǔ)卡實(shí)時(shí)記錄數(shù)據(jù)變化，通過(guò)獲得的響應(yīng)信號(hào)來(lái)分析電極表面粘彈性變化。

圖4 傳感器的流程圖

與傳感器頻率響應(yīng)不同，該儀器由電阻抗信號(hào)擬合獲得的是與相位有關(guān)的響應(yīng)信號(hào)。與頻率響應(yīng)相比，相位響應(yīng)不易停振，性能更穩(wěn)定，且相位測(cè)量能夠進(jìn)行瞬態(tài)信號(hào)的監(jiān)測(cè)，可精確到微秒，因此可以進(jìn)行凝血過(guò)程的監(jiān)測(cè)。

2.2 檢測(cè)片的設(shè)計(jì)

檢測(cè)片是由一次性壓電石英晶體制備而成，是PQ-Sensor血凝傳感儀的重要傳感元件。如圖5，其有三層結(jié)構(gòu)，分別為基底層、中間層、頂層，基底層由壓電石英晶體和銅片電極組成；中間層主要通過(guò)鏤空設(shè)置形成腔室，包括進(jìn)樣室、反應(yīng)腔室、透氣孔；頂層依次圈出進(jìn)樣口、固定試劑區(qū)、透氣孔。固定試劑區(qū)位于壓電石英晶體正上方，在其上粘附固定材料，經(jīng)涂布、晾干、沉積一定量標(biāo)準(zhǔn)濃度的固定試劑。樣品通過(guò)鏤空進(jìn)樣口加入到檢測(cè)片中，基于毛細(xì)張力滲透到壓電石英晶體表面，與固定試劑充分接觸。

圖5 檢測(cè)片示意圖

本文使用未修飾的高頻(基本諧振頻率100 MHz)鍍鋁壓電石英晶體，在保證儀器性能的前提下減少了成本，降低了技術(shù)難度，提高了響應(yīng)靈敏度。采用無(wú)污染、導(dǎo)電性能好、材料附著力高的鋁箔片作為固定材料，使用凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)試劑(凝血酶溶液)作為固定試劑。制備過(guò)程中，將涂有固定試劑的一面朝下，蓋在中間層上，依次組裝成血凝檢測(cè)片。

3 實(shí)驗(yàn)分析

實(shí)驗(yàn)預(yù)處理 將壓電石英晶體經(jīng)乙醇、蒸餾水、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)反復(fù)清洗干凈，氮?dú)獯蹈蓚溆?。?.9%的氯化鈉溶液定量稀釋纖維蛋白原凍干粉，配制1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L的纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)溶液。選取10組纖維蛋白原含量為0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L、4.0 g/L、4.5 g/L、5.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)定值質(zhì)控血漿。在醫(yī)院中收集100份靜脈血，取血樣0.9 mL，加入0.1 mL 0.109 mol/L枸櫞酸鈉溶液，3 000 r/min離心10 min，收集上層血漿。將上述溶液分別置于干式恒溫儀37℃預(yù)熱備用。

3.1 標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)

用移液槍移取10μL不同含量的纖維蛋白原溶液加入到檢測(cè)片，觀察PQ-Sensor血凝傳感儀顯示屏上的響應(yīng)信號(hào)隨響應(yīng)時(shí)間變化。圖6為3 g/L纖維蛋白原的測(cè)定示意圖，圖6(a)為響應(yīng)信號(hào)-響應(yīng)時(shí)間動(dòng)態(tài)變化曲線，圖6(b)是纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)溶液與凝血酶標(biāo)準(zhǔn)試劑發(fā)生反應(yīng)后的凝聚態(tài)?？梢钥吹?，反應(yīng)過(guò)程中響應(yīng)信號(hào)隨響應(yīng)時(shí)間呈“階梯式”下降，減少的信號(hào)表明纖維蛋白原與凝血酶之間存在特異性反應(yīng)，反應(yīng)后在壓電石英晶體表面肉眼可見乳白色凝聚體。

圖6 3 g/L纖維蛋白原測(cè)定示意圖

導(dǎo)出SD存儲(chǔ)卡中的數(shù)據(jù)繪圖，獲得了圖7所示的凝血反應(yīng)圖。圖7(a)是3 g/L纖維蛋白原的響應(yīng)信號(hào)-響應(yīng)時(shí)間變化圖，開始的一段時(shí)間，圖像呈一條穩(wěn)定的直線，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)不變，響應(yīng)信號(hào)與激勵(lì)信號(hào)的信號(hào)差為0，說(shuō)明PQ-Sensor血凝傳感儀穩(wěn)定性較好。隨著纖維蛋白原與凝血酶的接觸，電極表面粘度增大，晶體的響應(yīng)信號(hào)開始下降，這標(biāo)志著凝血反應(yīng)的開始，對(duì)應(yīng)時(shí)間為t1。反應(yīng)前期，纖維蛋白原在凝血酶的作用下逐漸轉(zhuǎn)變成纖維蛋白單體，體系的粘度快速增加，晶體的響應(yīng)信號(hào)呈快速的指數(shù)下降。反應(yīng)中期，由于凝血酶溶液的消耗，同時(shí)伴隨生成的纖維蛋白單體交聯(lián)形成凝塊，體系粘度的增長(zhǎng)速度逐漸減緩，晶體的響應(yīng)信號(hào)也開始緩慢下降，tm是最大凝血速度時(shí)間點(diǎn)。反應(yīng)后期，纖維蛋白單體完全交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，體系粘度達(dá)到穩(wěn)定，儀器響應(yīng)信號(hào)不再變化，響應(yīng)信號(hào)差達(dá)到穩(wěn)定，這標(biāo)志著凝血反應(yīng)的結(jié)束，對(duì)應(yīng)的時(shí)間為t2。凝血酶時(shí)間(TT)就近似等于t2-t1＝(78-60)s＝18 s。

圖7 凝血反應(yīng)

圖7(b)是不同含量纖維蛋白原的響應(yīng)信號(hào)-響應(yīng)時(shí)間變化圖，圖7(c)是響應(yīng)信號(hào)差和纖維蛋白原含量關(guān)系圖。圖中可觀察到，儀器響應(yīng)信號(hào)差和纖維蛋白原的含量成線性相關(guān)，表明PQ-Sensor血凝傳感儀能夠監(jiān)測(cè)纖維蛋白原的含量和凝血酶時(shí)間，且實(shí)驗(yàn)中可以檢測(cè)到的纖維蛋白原的量為10μL，說(shuō)明儀器檢測(cè)限低、精度高，可用于“微滴”測(cè)量。理論上來(lái)說(shuō)，改變固定試劑的種類，還可監(jiān)測(cè)凝血四項(xiàng)的另外兩項(xiàng):凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)。更值得一提的是，通過(guò)使用不同類型的檢測(cè)片，該儀器還可實(shí)現(xiàn)其他物質(zhì)的粘度傳感。

3.2 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

為了得到儀器的特征檢測(cè)曲線，我們采用PQSensor血凝傳感儀測(cè)定十組不同含量的定值質(zhì)控血漿，通過(guò)獲得的響應(yīng)信號(hào)與維蛋白原含量作圖，得到如圖8的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)儀器進(jìn)行標(biāo)定。

圖8 儀器的標(biāo)定曲線

取10μL血漿分別加入到標(biāo)定后的PQ-Sensor血凝傳感儀和Sysmex凝血分析儀中，分別測(cè)定血漿纖維蛋白原(FIB)的含量。將100份血漿樣品得到的結(jié)果按纖維蛋白原的含量分為三組:低值組、正常組和高值組，分別比較兩種儀器的相關(guān)性。

如表1，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，三組數(shù)據(jù)的相關(guān)性系數(shù)R2>0.954，說(shuō)明PQ-Sensor血凝傳感儀與Sysmex凝血分析儀的檢測(cè)結(jié)果一致性好，同時(shí)表明該儀器檢測(cè)結(jié)果可靠，能實(shí)際應(yīng)用于血漿纖維蛋白原的測(cè)定。

表1 PQ-Sensor血凝傳感儀和Sysmex凝血分析儀的測(cè)定結(jié)果

4 總結(jié)

本文利用固定頻率及被動(dòng)激勵(lì)相位測(cè)量的原理，通過(guò)高頻設(shè)計(jì)提高靈敏度，開發(fā)了一個(gè)即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)的PQ-Sensor血凝傳感儀。利用該儀器對(duì)纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)定值血漿和靜脈血漿纖維蛋白原進(jìn)行測(cè)定，證明了其可行性、準(zhǔn)確性和實(shí)用性。該儀器具有便攜式、低成本、性能穩(wěn)定、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，集程序傳輸、信號(hào)采集、數(shù)據(jù)處理、功能檢測(cè)于一體，有望實(shí)現(xiàn)全血凝血四項(xiàng)的監(jiān)測(cè)，為社區(qū)、家庭等應(yīng)用場(chǎng)景下的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)和自我健康管理提供了重要的參考，具有廣闊的應(yīng)用前景和推廣使用價(jià)值。