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    基于網絡藥理學的宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的作用機制研究

    2021-09-29 09:27:32邱嘉菡張家旗鄺梓君
    中國醫(yī)藥導報 2021年22期
    關鍵詞:宮外孕丹參異位

    邱嘉菡 袁 爍 張家旗 鄺梓君

    1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦科,廣東廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,廣東廣州 510405

    異位妊娠是育齡期婦女的噩夢,近年來,隨著盆腔炎性疾病、人工流產、輔助生育技術等高危因素的增加,其發(fā)病率逐年增長。在異位妊娠中,輸卵管妊娠占比最多,約占95%,典型的臨床表現(xiàn)為停經、下腹疼痛及陰道流血。

    隨著醫(yī)學的進步和婦女健康意識的加強,使輸卵管妊娠在早期得到診斷已成為可能。目前西醫(yī)對輸卵管妊娠的治療有手術、藥物和期待治療3 種方式。其中甲氨蝶呤是藥物治療最常用藥物。甲氨蝶呤是一種抗葉酸類腫瘤藥,臨床上常見的不良反應有骨髓抑制、胃腸道反應、黏膜損傷,以及肝臟毒性、腎臟毒性、心臟毒性、感染等[1],其中有報道指出肝功能損傷發(fā)生了高達51.6%[2],面對西醫(yī)藥物治療嚴重的毒副作用,筆者所工作的廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,經過十余年的臨床研究,形成了“輸卵管妊娠的中西醫(yī)結合診療方案”,有報道指出中藥治療異位妊娠的成功率達97.6%[3],為中醫(yī)藥治療輸卵管妊娠開辟了新天地。

    中醫(yī)理論認為輸卵管妊娠的“本”是少腹血瘀證[4]。早在20 世紀60 年代山西醫(yī)學院率先開啟了中西醫(yī)結合非手術治療宮外孕,研制了宮外孕Ⅰ號方,宮外孕Ⅱ號方。其中宮外孕Ⅰ號方由桃仁、丹參、赤芍3 味藥物組成,其中以丹參為君藥,白芍、桃仁為臣藥,共奏化瘀消癥、活血殺胚之功,本方藥味雖然極其精簡,但臨床效果明確[5]。臨床藥理研究證實,宮外孕Ⅰ號方能促進腹腔凝血塊的吸收,對實驗動物的凝血時間[6]及淋巴回流均有一定影響。上述資料的來源均為20 世紀70 至80 年代的文獻,研究焦點也多集中在血液流變學上。經過數(shù)十年的時間,現(xiàn)代醫(yī)學的進步不止體現(xiàn)在臨床,同時也體現(xiàn)在細胞、動物實驗等科研相關的生物技術水平上。筆者所在的醫(yī)院在臨床上將宮外孕Ⅰ號方化裁的湯劑,應用于治療早期異位妊娠有著“效廉驗便”的優(yōu)勢[7],同時能避免西藥的某些副作用和手術的痛苦;而且對患者生育能力的保護又是治療方案的另一優(yōu)勢。臨床上也有不少對該化裁湯劑進行實驗室研究[8-11],但對其基礎湯劑——宮外孕Ⅰ號方的研究在近年來卻鮮少報道,本研究利用網絡藥理學方法探討宮外孕Ⅰ號方通過何種成分,利用機體的哪些靶點,最終達到治療異位妊娠的目的。

    1 資料與方法

    1.1 中藥活性成分的篩選和靶點

    將宮外孕Ⅰ號方各中藥的中文名稱“丹參”“桃仁”“赤芍”作為關鍵詞輸入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺[12](traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP),在中國知網、維普、萬方網站搜索近5 年(2015 年1 月至2020 年1 月)發(fā)表的文獻報道查找未在TCMSP 中檢索到的中藥成分進行整理補充。獲取所有中藥成分以后,錄入TCMSP 以匹配信息,將“口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18[13]”作為篩選條件。將上述活性成分輸入Uniprot 網站進行規(guī)范并轉換成藥物有效成分的作用靶點,匯總去除重復值,得出有效基因靶點。

    1.2 構建宮外孕Ⅰ號方的“活性成分-靶點”網絡

    宮外孕Ⅰ號方“活性成分-靶點”網絡主要通過軟件Cytoscape 3.8.0 來構建與分析,其中藥物成分或靶點用“節(jié)點”(node)表示,成分及靶點之間關系用“邊”(edge)表示。

    1.3 異位妊娠相關靶點檢索

    將“異位妊娠”輸入中國知網翻譯,得出“ectopic pregnancy”的譯名,以“ectopic pregnancy”作為關鍵詞,在Genecards[14]、Disgenet[15]兩個疾病基因數(shù)據(jù)庫進行檢索與篩選,將得到的靶點匯總并去除重復值,在中國知網、維普、萬方網站搜索近5 年(2015 年1 月至2020 年1 月)發(fā)表的文獻報道查找未預測到的已知治療靶點,并將所得靶點錄入Uniprot數(shù)據(jù)庫對其名稱進行標準化命名。

    1.4 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點獲取及構建靶蛋白蛋白質-蛋白質相互作用(proteinprotein interaction,PPI)網絡

    1.4.1 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點獲取 將“1.1”中取得的藥物有效成分的作用靶點及“1.3”中取得的疾病治療靶點匯總取交集,經過篩選查重,最終得到宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點。

    1.4.2 建構宮外孕I 號方治療異位妊娠靶蛋白PPI網絡 將最終篩選出來的宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點導入Cytoscape 3.8.0 軟件中的bisogenet 插件獲取靶蛋白的相互作用關系。使用BisoGenet 數(shù)據(jù)庫對篩選出的基因靶點構建相互作用關系網絡,可得到宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的PPI 網絡圖,將所得圖導入Cytoscape 3.8.0 軟件,繪制出PPI 網絡圖。

    1.5 分子對接評估結合潛力

    選擇蛋白和化合物網絡度值各前3 名的蛋白和活性成分進行分子對接。從RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫中選取相應靶蛋白并下載其3D 結構,在TCMSP 中獲取活性成分的分子結構。利用Autodock Tolls 軟件對蛋白進行去水、加全氫及設置受體,對核心活性成分則進行加全氫、自動分布電荷、設置為配體,進行分子對接。分子對接過程中,受體與配體的親和力越好,其結合能越低,一般認為,結合能≤-1.2 kcal/mol,則對接結果良好,最后用Pymol 軟件對其進行可視化處理。

    1.6 關鍵靶點富集分析

    將最終得到的核心靶點導入DAVID[16]數(shù)據(jù)庫,進行兩種富集分析:①GO 分類富集分析,包括:生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組分(cell component,CC)。由于富集靶標越多,與治療異位妊娠相關性越高,所呈現(xiàn)的P 值便會越小,本課題組在分析富集結果時,選取P <0.01的富集數(shù)據(jù),由小到大進行排序,將符合上述標準GO富集分析使用微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO 富集的BP、CC、MF 三合一柱狀圖。②KEGG 通路富集分析。得到通路富集結果后,選取COUNT 數(shù)目排名前20 位的KEGG 通路,使用微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制氣泡圖,并將上述通路數(shù)據(jù)的基因名及通路名稱使用Cytoscape 3.8.0 軟件繪制通路關系圖。

    2 結果

    2.1 宮外孕Ⅰ號方活性成分篩選

    以檢索TCMSP 并根據(jù)OB 和DL 值初步篩選得到宮外孕Ⅰ號方活性成分共243 個,丹參137 個,桃仁52 個,赤芍54 個,其中桃仁和赤芍共有成分1 個,丹參和赤芍共有成分1 個,丹參和桃仁共有成分1 個,其中Degree(DC)值排名前3 的成分是β-谷甾醇、芹菜素、二氫異丹參酮Ⅰ。在中國知網、維普、萬方網站搜索近5 年相關文獻未查找到未納入的有效成分。將上述活性成分輸入Uniprot 網站得出丹參有2161 個有效靶點,桃仁有470 個有效靶點,赤芍有297 個有效靶點,去除重復值,得出有效基因靶點共159 個。方中OB 值排名前5 位的有效成分見表1。

    表1 宮外孕Ⅰ號方部分活性成分

    2.2 宮外孕Ⅰ號方活性成分-有效靶點網絡構建

    宮外孕Ⅰ號方活性成分-有效靶點網絡具體關系見圖1。圖中內部綠色節(jié)點呈矩形排列者代表有效基因靶點;外圈呈圓形排列者代表藥物有效成分:內層紫色六邊形代表桃仁有效成分,中層綠色六邊形代表赤芍有效成分,外層兩圈紅色六邊形代表丹參有效成分;圖片最下方淡黃色六邊形代表共有有效成分:A1 代表桃仁和赤芍共有有效成分,A2 代表丹參和桃仁共有有效成分,A3 代表丹參和赤芍共有有效成分;圖片最上方橙色圓形代表藥物名稱:赤芍、丹參、桃仁。整個網絡圖共包含338 個節(jié)點,3087 條邊。宮外孕Ⅰ號方中多個有效成分對應同一靶點,多個靶點對應同一有效成分。

    圖1 宮外孕Ⅰ號方有效靶點網絡圖(見內文第7 頁)

    2.3 異位妊娠相關靶點檢索

    在Genecards 數(shù)據(jù)庫中查找出5396 個靶點,由于靶點數(shù)量較多,因此通過SCORE 的中位數(shù)進行篩選,第一次中位數(shù)為1.19,第二次中位數(shù)為2.96。經過兩次取SCORE 中位數(shù)后共篩選出1360 個靶點;在Disgenet 數(shù)據(jù)庫中查找到49 個靶點;在中國知網、維普、萬方網站搜索近5 年相關文獻未查找到未納入的有效治療靶點。最終將所取得的上述所有靶點匯總去除重復值,并將所得靶點錄入Uniprot 數(shù)據(jù)庫對其名稱進行標準化命名,最終得到疾病靶點共1362 個。

    2.4 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點與PPI 網絡構建

    2.4.1 宮外孕I 號方治療異位妊娠的靶點 得到宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點:ADRB2、AR、CHEK1、ESR1、ESR2、MAPK14、NOS2、PGR、PTGS1、PTGS2、SCN5A、F2、PPARG、F10、NOS3、CDK2、ACHE、BCL2、JUN、NR3C1、PON1、HTR2A、NR3C2、ADRB1、MAOA、PLAU、CAT、GSTM1、GSTP1、MMP2、VEGFA、IL-6、TNF、CYCS、MPO、TP53、CDK1、ADH1B、BCHE、SRC、CDK4、EGFR、HMOX1、IFNG、IL-2、INSR、MAPK1、MMP1、RB1、XDH、F7、CDK6、INS、NQO1、CTSB、IL-1B、MAPK8、MMP3、SELE、DRD2、CYP1A2、CYP3A4、EDNRA、ITGB3、VCAM1,共65 個交集靶點。見圖2。

    圖2 宮外孕Ⅰ號方活性成分靶點與異位妊娠靶點的匹配維恩圖

    2.4.2 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的PPI 網絡構建該PPI 網絡圖(圖3)共包含3 個小圖,左側圖為通過原始交集靶點作出的網絡圖,包括4613 個節(jié)點,167258 條邊,經過計算得出DC、Betweenness Centrality、Closeness Centrality 的中位數(shù)分別為48、6.74E-05、0.44,以此為條件截取出中間圖;中間圖包括931 個節(jié)點,41 403 條邊,經過計算得出DC、Betweenness Centrality、Closeness Centrality 的中位數(shù)分別為162、0.000565、0.47,以此為條件截取出右側圖;中間圖包括220 個節(jié)點,5932 條邊,圖中節(jié)點越大,代表DC 值越大,則代表與治療相關性越密切。DC 值排名在前5 位的靶蛋白:NTRK1、TP53、EGFR、APP、ESR1。

    圖3 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠核心靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

    2.5 分子對接分析結果

    對PPI 網絡中DC 值排名前3 的蛋白和活性成分進行分子對接,結果見表1[對接結果只保留每對分子對接的最低結合能(kcal/mol)]。分子對接結果顯示宮外孕Ⅰ號方核心成分與異位妊娠靶點具有較好結合活性。選擇最低結合能的分子對接繪制對接模式圖。見圖4。

    圖4 分子對接結果圖

    2.6 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠通路富集分析

    將PPI 網絡中的220 個核心靶點基因導入DAVID 數(shù)據(jù)庫,進行GO 富集分析及KEGG 通路富集分析。

    表2 宮外孕Ⅰ號方異位妊娠靶點與核心成分分子對接的最低結合能(kcal/mol)

    2.6.1 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的GO 富集分析GO 富集分析結果顯示,220 個相關靶點基因其中有207 個核心靶點基因參與富集,共得到518 個富集結果,其中包括MF 為174 項,主要涉及蛋白結合、泛素蛋白連接酶結合、酶結合等;CC 為126 項,主要涉及細胞核液、細胞核、細胞胞質溶膠等;BP 為218 項,主要涉及病毒過程、上調RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄、抑制細胞凋亡等。選擇P 值最小排名前20 位的富集結果見圖5。

    圖5 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的GO 富集分析

    2.6.2 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的KEGG 通路富集分析 KEGG 分析結果:220 個相關靶點基因,其中有181 個核心靶點基因參與111 條信號通路過程。篩選得到COUNT 數(shù)目排名前20 位的通路見圖6。

    圖6 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的KEGG通路富集分析(見內文第8頁)

    將基因數(shù)目排名前20 位相關基因及通路導入Cytoscape 3.8.0 繪制的相關基因及通路關系圖,見圖7。進行KEGG 富集通路分析后發(fā)現(xiàn),腫瘤通路、病毒致癌作用信號通路、乙肝信號通路、PI3K-AKT 信號通路、腫瘤中微小RNA 作用信號通路、細胞周期信號通路等信號通路與宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點關系密切。相關基因數(shù)最高的兩條通路作圖見圖8~9。

    圖7 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的“靶點-通路”網絡圖

    圖8 腫瘤通路的相關基因

    圖9 病毒致癌通路的相關基因

    3 討論

    山西醫(yī)學院研制宮外孕Ⅰ號方為目前中藥治療異位妊娠的最常用的方劑之一,由丹參、赤芍、桃仁3 味中藥組成,藥味簡單,組方精妙,在臨床應用多年療效顯著。

    本研究基于網絡藥理學,探討宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的作用機制,共收集活性成分243 個,其中丹參的活性成分最多;宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的作用靶點共65 個,提示宮外孕Ⅰ號方可以利用不同有效成分通過多個靶點蛋白治療異位妊娠。PPI 網絡圖提示宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的作用機制錯綜復雜,核心靶點涉及的范圍可以分為細胞增殖及其周期、泛素化及惡性腫瘤相關指標,GO 和KEGG 富集分析結果顯示,宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠涉及不同的生物過程及不同的信號通路,如腫瘤信號通路、PI3K-Akt 信號通路、細胞周期、MAPK 信號通路、FoxO 信號通路等。

    異位妊娠指的是受精卵在子宮體腔以外的部位著床發(fā)育。在正常妊娠中,受精卵必須在一個極短的“窗口期”完成定位、黏附、穿透三部曲才能繼續(xù)發(fā)育。牢固的黏附是著床的先決條件,而在黏附之后,滋養(yǎng)層細胞便開始迅速增殖,同時發(fā)生遷移和侵蝕,分化形成合體滋養(yǎng)層和細胞滋養(yǎng)層,同時分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)[17]。受精卵在異位的著床點雖然不能最終發(fā)育成熟,但其早期的著床過程與正常妊娠相一致。臨床上疑診或確診異位妊娠的時候,受精卵已經完成黏附,滋養(yǎng)細胞正處于快速增殖分裂,向周圍組織迅速遷移侵蝕,并同時分泌HCG。綜觀目前藥物治療異位妊娠,大多從抑制滋養(yǎng)細胞的增殖,最終調控其細胞周期;控制滋養(yǎng)細胞的遷移及侵蝕[18]等方面著手。

    根據(jù)上述機制,分析本次網絡藥理PPI 核心蛋白結果,發(fā)現(xiàn)宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠DC 值排名前30 的核心蛋白與調控細胞增殖凋亡及其周期、調節(jié)細胞遷移及侵蝕有密切關系。如①TP53 為細胞周期研究領域中的明星分子,目前有研究表明p53 的高表達可能導致滋養(yǎng)細胞增殖[19];細胞實驗研究表明miR-520 可能通過激活內質網應激誘導滋養(yǎng)細胞發(fā)生凋亡[20]。②體外細胞實驗同樣證實miR-137 可以影響滋養(yǎng)細胞的增殖活性及其遷移能力[21]。分析P 值排名前20 位的KEGG 通路可以發(fā)現(xiàn)宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的主要通路可以分為以下三大類:①調節(jié)滋養(yǎng)細胞的增殖、侵襲及凋亡:目前的實驗室研究表明,通過調控PI3K-AKT 信號通路[22-23]、FoxO 信號通路[24-25]、MAPK 信號通路[26-30],下調滋養(yǎng)細胞的增殖速度,抑制其遷移及侵襲、促進細胞凋亡?;谏鲜鼋Y論,本課題組推測對于治療異位妊娠同樣可以通過抑制上述通路的功能,達到控制滋養(yǎng)細胞的有絲分裂,抑制滋養(yǎng)細胞增殖,縮短其細胞周期,最終導致滋養(yǎng)細胞凋亡,從而治療異位妊娠。②與腫瘤相關性:在本次網絡藥理研究中發(fā)現(xiàn),KEGG 富集的結果有很多與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關的信號通路。受精卵在著床可以分泌早孕因子,以防止免疫排斥。這種免疫行為與惡性腫瘤中的免疫逃逸[31-32]行為相類似。本課題組在回顧文獻中也發(fā)現(xiàn)目前有不少對滋養(yǎng)細胞的研究也以惡性腫瘤獲得性特征作為切入點[10,33-36],因此本課題組推測日后研究宮外孕Ⅰ號方對異位妊娠的作用可以借鑒腫瘤相關通路來完成。

    綜上所述,宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的主要成分可能是β-谷甾醇、芹菜素、二氫異丹參酮Ⅰ等,宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠主要通過NTRK1 等蛋白通過腫瘤信號通路、PI3K-Akt 信號通路、細胞周期、MAPK 信號通路、FoxO 信號通路等影響蛋白結合、細胞核質、病毒過程等生物行為。本次網絡藥理實驗同時發(fā)現(xiàn)了部分核心靶點分子及富集所得通路尚未被深入研究,同時在文獻回顧中發(fā)現(xiàn)目前此類研究的對象集中在包括流產、子癇、妊娠期糖尿病等病理妊娠的滋養(yǎng)細胞或體外宮內妊娠滋養(yǎng)細胞株,多以基因敲除、分子檢測等作為干預手段。本文通訊作者目前已經成功對輸卵管妊娠的絨毛組織進行體外培養(yǎng)[37-38],并使用宮外孕Ⅰ號方的加味湯劑對其進行實驗研究,證實該湯劑能夠阻斷細胞的黏附運動,抑制細胞的侵襲,減輕滋養(yǎng)細胞對輸卵管著床部位的過度浸潤,上調其凋亡率,最終達到治療異位妊娠的目的[9,18,39]。但目前對于復方成分中不同藥物的藥量及相互作用分析仍缺乏系統(tǒng)研究模型,此后,我們可以進一步建立研究模型以實驗的方式來明確之間的區(qū)別。

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