微生物發(fā)酵秸稈日糧對湖羊育肥性能及其腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

葉以哲，夏宗群，婁佑武，王榮民，管業(yè)坤，戴征煌，張國生，姜樹林，丁君輝*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動物疫病防控制劑工程研究中心，江西 南昌 330045；2.江西省畜牧技術(shù)推廣站，江西 南昌 330046）

【研究意義】目前，我國肉羊的市場需求呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢，湖羊以其肉質(zhì)細(xì)膩、高蛋白、低膽固醇、低脂肪等特點(diǎn)，受到了廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的喜愛；同時，養(yǎng)殖湖羊具有較好的經(jīng)濟(jì)效益，近年來養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大[1]。江西省是農(nóng)業(yè)大省，有著十分豐富的農(nóng)作物秸稈資源。秸稈主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)，部分營養(yǎng)物質(zhì)能夠被草食畜禽所利用，特別是經(jīng)微生物發(fā)酵處理后，能降解其中的粗纖維類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)閯游镆紫盏男》肿宇惢衔铮徊菔硠游镙^好的利用，提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值和改善飼料適口性[2]。江西省地處長江中下游南岸，屬中亞熱帶濕潤氣候，有優(yōu)越的光、熱、水、土資源，花生種植得天獨(dú)厚?；ㄉ墙魇≈饕慕?jīng)濟(jì)作物和油料作物，總產(chǎn)占全省油料總產(chǎn)的37.5%左右[3]。因此，江西省花生秸稈資源非常豐富。然而，用于畜禽養(yǎng)殖的秸稈利用率不足10%?；ㄉ斩捹|(zhì)地松軟且富含各種營養(yǎng)物質(zhì)，其中含有高水平的粗蛋白[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】潘月紅等[5]發(fā)現(xiàn)花生秸稈中還富含各種礦物質(zhì)，可以彌補(bǔ)日糧中礦物質(zhì)的不足，應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)具有廣闊的前景。過往的研究表明，飼料中適量添加花生秸稈有利于瘤胃健康，提高羔羊生長性能，降低飼養(yǎng)成本[6-8]。但花生秸稈適口性差、難以消化，用于畜禽養(yǎng)殖利用率不足10%，多數(shù)秸稈丟棄或焚燒，對環(huán)境產(chǎn)生了一定的污染?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】微生物發(fā)酵飼料具有提高飼料適口性和消化率以及促進(jìn)腸道的微生態(tài)平衡等作用。研究表明，給湖羊飼喂微生物發(fā)酵的飼料可以顯著增強(qiáng)其食欲、增加采食量、提升生長性能，且能改善其肉品質(zhì)，提高肌肉中的蛋白質(zhì)含量，降低脂肪含量[9-12]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】試驗(yàn)旨在探討斷奶湖羊育肥日糧中添加經(jīng)微生物發(fā)酵處理的花生秸稈或精料補(bǔ)充料對其育肥性能的影響，以進(jìn)一步促進(jìn)花生秸稈在畜禽養(yǎng)殖中的利用，從而達(dá)到降低飼養(yǎng)成本，提高飼料利用效率，進(jìn)而為解決人畜爭糧造成的糧食安全和農(nóng)作物廢棄物產(chǎn)生環(huán)境污染等問題探索一條物質(zhì)循環(huán)利用新途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時間與地點(diǎn)

試驗(yàn)從2019年11月至2020年1月，于江西億合農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖場進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇健康無病、月齡一致、體質(zhì)量相近的36 只湖羊公羊，根據(jù)飼喂日糧不同隨機(jī)分成3 組進(jìn)行舍飼育肥，分組詳見表1。

表1 試驗(yàn)羊育肥分組Tab.1 Groups of experimental fattening sheep

1.3 試驗(yàn)日糧

1.3.1 精料補(bǔ)充料及其發(fā)酵 精料補(bǔ)充料采用市售鄭州六品農(nóng)牧有限公司生產(chǎn)的育肥羊配合飼料。發(fā)酵步驟：準(zhǔn)確稱取精料補(bǔ)充料，添加1.2%生物菌劑（來源于南昌益菌康飼料科技有限公司生產(chǎn)，主要成分枯草芽孢桿菌（有效活菌≥1.0×106），糞腸球菌（≥2.0×107），釀酒酵母（≥1.0×106），植物乳桿菌（≥2.0×107），混勻后靜置發(fā)酵30 min后進(jìn)行飼喂。

1.3.2 花生秸稈發(fā)酵 準(zhǔn)備花生秸稈300 kg，生物菌劑（同1.3.1）6 kg，步驟：先取100 g 花生秸稈檢測其含水量（經(jīng)測定含水量為9.9%），再采用均勻?yàn)⑺绞剑ㄟ厼⑦呌描F鍬翻動，使水分與花生秸稈混合充分），調(diào)節(jié)花生秸稈含水量至50%～60%，通過計(jì)算，共需加水約287.5 kg。再次將花生秸稈翻動混勻，邊翻動邊灑菌劑，充分混勻。再以30 cm 為層高，分層撒施菌劑，分層踩實(shí)，最后蓋薄膜，四周壓實(shí)密封，厭氧發(fā)酵14 d后開始飼喂并采樣送檢。

1.3.3 日糧營養(yǎng)成分 試驗(yàn)日糧主要營養(yǎng)成分見表2。

表2 試驗(yàn)日糧Tab.2 Daily feeding of test

1.4 飼養(yǎng)管理

預(yù)試期按常規(guī)進(jìn)行防疫注射、驅(qū)蟲，期間各組以試驗(yàn)日糧逐漸替代原飼喂日糧，每5 d 替換1/3 原日糧，直至完全飼喂試驗(yàn)日糧即開始正試期。正試期54 d。試驗(yàn)采取全舍飼強(qiáng)度育肥方式，定量喂食、自由飲水。早晚各補(bǔ)飼1 次，飼喂量參照“NY/T816 肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)”（精料量：各組肉羊精料喂量保持一致，試驗(yàn)開始時每只羊630 g/d，隨后前31 d 日喂量每隔6 d 增加100 g/只，后23 d 日喂量以820 g/只定量飼喂；粗飼料喂量：各組根據(jù)采食情況適時調(diào)整，全期精粗比大約控制在6∶4，發(fā)酵花生秸稈含水量50%～60%，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)折算成普通花生秸稈后稱取飼喂，各組全期日糧干物質(zhì)采食量保持一致），其余均按正常生產(chǎn)操作規(guī)程進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長性能測定指標(biāo)及方法 每天觀察羊只采食情況，并做好記錄。每日清晨準(zhǔn)確稱取日糧飼喂，喂料前清除各組飼槽余料進(jìn)行稱量，統(tǒng)計(jì)各組羊前一日的精料及粗飼料日采食量，做好記錄；試驗(yàn)第1天、31天、54天時，各組肉羊空腹12 h進(jìn)行個體稱量，并計(jì)算各組每只羊的平均日采食量、日增重，料肉比等，同時記錄試驗(yàn)過程中試驗(yàn)羊的發(fā)病以及死亡情況。

1.5.2 腸道微生物16S rRNA 測定 試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選擇6只羊，采取其糞便樣本，送往上海生工生物公司進(jìn)行16S rDNA高通量測序，根據(jù)反饋的數(shù)據(jù)，比較分析各試驗(yàn)組之間腸道微生物群落的差異。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Usearch、R、Krona 等軟件進(jìn)行繪圖，使用STAMP 軟件進(jìn)行差異性分析，采用Fisher exact test、Welch’s t-test、T-test方法進(jìn)行檢驗(yàn)，最后將檢驗(yàn)得到的P值采用FDR做Multiple test correction 得到q值，結(jié)果以P＜0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵日糧對湖羊生長性能的作用

由表3可見，各組精料日采食量在各階段基本一致；粗飼料日采食量在各階段均以C組最高，折合干物質(zhì)采食量各階段均以C 組最低，全期來看，C 組粗飼料采食量比A 組和B 組分別高了65.13%和66.62%，折合干物質(zhì)采食量比A 組和B 組分別低7.45%和7.25%；各組在各階段平均日增重差異不顯著，均以A組最低，其中前期以B組最高，比A組高5.93%（P＞0.05），后期及全期則以C組最高，分別比A組高19.48%及8.33%（P＞0.05），另外，較之前期，A 組和B 組后期日增重降低明顯，而C 組后期日增重降幅相對較?。桓鹘M料肉比在各階段均以C 組最低，A 組最高，C 組在前期、后期及全期料肉比分別比A 組低11.93%、19.15%及14.61%。

表3 生長性能指標(biāo)Tab.3 Growth performance indexes

2.2 不同發(fā)酵日糧對湖羊腸道微生物組成的影響

2.2.1 羊腸道微生物多樣性分析 根據(jù)16S rDNA 高通量測序的結(jié)果，對3 個分組的腸道微生物α 多樣性進(jìn)行分析，如表4 所示，Shannon 和Simpson 指數(shù)表明，3 個分組的腸道菌群多樣性均無顯著性差異。ACE 和Chao1 指數(shù)的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A 組的菌群豐度顯著高于C 組，而A 組與B 組，B 組與C 組之間的菌群豐度并無顯著性差異。同時使用主成分分析PCoA 分析法進(jìn)行β多樣性分析，結(jié)果如圖1所示，不同分組的樣品相互之間并沒有完全重疊，說明飼喂發(fā)酵的精料補(bǔ)充料或花生秸稈均可以改變?nèi)庋蚰c道菌群結(jié)構(gòu)。

表4 Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)Tab.4 Alpha diversity statistics chart

圖1 不同分組羊腸道微生物β多樣性分析Fig.1 Analysis of β diversity of gut microbes in different experimental groups

2.2.2 基于門分類水平的物種分析 根據(jù)測序結(jié)果，在微生物的門水平對樣品進(jìn)行分析，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，觀測樣品在門水平上的群落結(jié)構(gòu)，并將3組的群落結(jié)構(gòu)分析放在一起對比，基于群落結(jié)構(gòu)組分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes、Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Proteobacteria、Actinobacteri是羊腸道微生物中最主要的細(xì)菌，其中Firmicutes和Bacteroidetes是優(yōu)勢菌屬，相對豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌屬。根據(jù)物種分類結(jié)果，比較組間豐度差異，找出組間豐度存在顯著差異的物種分類，基于組間菌群豐度差異分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A 組相比，B 組和C 組中Firmicutes的相對豐度均顯著下降；C 組的Synergistetes以及Parcubacteria的相對豐度顯著低于A組；B組的Parcubacteria和Atribacteria的相對豐度顯著低于C組（圖2和表5）。

圖2 各分組樣品在門水平上的相對豐度Fig.2 The relative abundance of each grouping sample at the gate level

表5 門水平上不同分組具有顯著差異的菌種Tab.5 Strains with significant differences in different groups at the phylum level

2.2.3 基于屬分類水平的物種分析 根據(jù)測序結(jié)果，在微生物的屬水平對樣品進(jìn)行分析，分析方法同門水平，基于群落結(jié)構(gòu)組分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，按相對豐度從高到低排列前6 屬分別為Bacteroides、Alistipes、Clostridium XlVa、Akkermansia、Oscillibacter、Paraprevotella?；诮M間菌群豐度差異分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在屬水平上看，各組之間相對豐度較高的幾種優(yōu)勢菌屬并無明顯差異，A組與B組之間Anaerofustis、Brevundimonas，Terrimicrobium等菌屬間存在顯著性差異，其中A 組中相對豐度較高的Clostridium IV和Parabacteroides的相對豐度顯著高于B 組，A 組與C 組之間Clostridium IV、Aquabacterium、Bacillus等菌屬間存在顯著性差異，其中相對豐度比例較高的Clostridium IV以及Flavonifractor的相對豐度顯著高于C 組（圖3 和表6）。B 組與C 組之間Brevundimonas、Atopobium、Aquabacterium等菌屬間存在顯著性差異，但因其相對豐度均較低（＜0.5%），故暫不討論。

圖3 各分組樣品在屬水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of samples in each group at the genus level

表6 屬水平上不同分組具有顯著差異的菌種Tab.6 Strains with significant differences in different groups at the genus level

續(xù)表Continued tab.

3 討論與分析

3.1 不同發(fā)酵日糧對湖羊生長性能的作用

試驗(yàn)中，B組各階段采食量及干物質(zhì)采食量與A組基本一致，而平均日增重在前期、后期及全期分別比A 組高5.93%、8.62%及6.95%，但差異不顯著，說明飼喂發(fā)酵精料補(bǔ)充料有提高肉羊的生長性能的趨勢。C 組的日采食量（粗飼料）明顯高于A 組和B 組，說明發(fā)酵的花生秸稈適口性較好，可以明顯增強(qiáng)肉羊的食欲，提高采食量，該結(jié)果與曲強(qiáng)[9]的研究結(jié)果一致，而折合干物質(zhì)采食量、料肉比均以試驗(yàn)C 組最低，且全期平均日增重以C 組最高，說明發(fā)酵花生秸稈對提高肉羊生長性能和飼料的轉(zhuǎn)化率有一定影響，但與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比生長性能的提升效果并不顯著，其原因可能與日糧組成中精料補(bǔ)充料與花生秸稈的比例有關(guān)，高旭紅等[10]的研究表明，隨著發(fā)酵杏鮑菇菌糠飼料添加比例的增加，試驗(yàn)羊的生產(chǎn)性能下降，Abdou 等[13]發(fā)現(xiàn)以20%花生秸稈與濃縮料混合飼喂可以達(dá)到最大日增重，表明發(fā)酵秸稈飼料的使用需要一個合適的比例，才能有效提高羊的生長性能。

3.2 不同發(fā)酵日糧對湖羊腸道微生物組成的影響

采用Illumina MiSeq 測序技術(shù)，對試驗(yàn)羊的腸道菌群進(jìn)行了檢測，測序結(jié)果表明試驗(yàn)羊腸道內(nèi)Firmicutes和Bacteroidetes是腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，該結(jié)果與Oikonomou 等[14]的研究結(jié)果相同。通過對腸道菌群的α多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)飼喂不同的發(fā)酵日糧并沒有明顯改變腸道菌群的多樣性，但飼喂發(fā)酵的花生秸稈可以顯著降低腸道菌群的菌屬豐度，試驗(yàn)中C 組的菌群豐度顯著低于A 組，其原因可能是粗飼料發(fā)酵過程中存在的大量乳酸菌抑制了腸道內(nèi)有害菌的生長，促進(jìn)了腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，因此導(dǎo)致了菌群豐度的顯著下降[15]。此外，β多樣性分析的結(jié)果表明飼喂不同的發(fā)酵日糧均會對腸道菌群的菌屬結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。

基于微生物的門水平對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，B 組和C 組中Firmicutes的相對豐度均顯著低于A 組，過往的研究表明Firmicutes是促進(jìn)宿主胃腸道微生物分解纖維素的最主要菌群[16-17]，試驗(yàn)中飼料經(jīng)微生物發(fā)酵后，其中的粗纖維類物質(zhì)轉(zhuǎn)變成動物易消化吸收的小分子物質(zhì)，飼料中需要分解的纖維素含量降低，最終導(dǎo)致了腸道內(nèi)Firmicutes的相對豐度下降。

基于微生物的屬水平對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，Bacteroides、Alistipes、Clostridium XlVa是試驗(yàn)羊腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌屬，研究表明Bacteroides在維持腸道菌群平衡方面有十分重要的作用，而Alistipes則能夠提高機(jī)體免疫力[18-19]，說明這兩種優(yōu)勢菌屬共同維持了腸道的微生態(tài)平衡。試驗(yàn)結(jié)果表明A組中Clostridium IV的相對豐度顯著高于B 組和C 組，有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Clostridium IV在功能上可以部分彌補(bǔ)Clostridium XlVa的不足[20]，而研究表明Clostridium XlVa具有粘附蛋白以及能夠參與腸道代謝反應(yīng)的功能[21-22]，與羊的腸道健康密切相關(guān)，說明B組和C組與A組相比，試驗(yàn)羊只的腸道相對健康，Clostridium XlVa能夠正常發(fā)揮其功能，不需要Clostridium IV來彌補(bǔ)功能的不足，使得Clostridium IV的相對豐度顯著下降。此外，A組中Flavonifractor的相對豐度顯著高于C 組，而相關(guān)文獻(xiàn)則表明Flavonifractor具有潛在的促炎作用[23]，該結(jié)果可能是由于發(fā)酵的花生秸稈中存在的大量乳酸菌，抑制了Flavonifractor的生長，最終導(dǎo)致了Flavonifractor的相對豐度降低。

4 結(jié)論

綜上所述，飼喂發(fā)酵精料補(bǔ)充料有提高肉羊的生長性能的趨勢，發(fā)酵的花生秸稈可以改善適口性，一定程度上可以提高肉羊生長性能和飼料的轉(zhuǎn)化率；發(fā)酵的花生秸稈中粗纖維類物質(zhì)被分解成小分子物質(zhì)，無需經(jīng)過Firmicutes分解便可被機(jī)體吸收，使得Firmicutes的相對豐度下降；此外，發(fā)酵花生秸稈中存在的大量乳酸菌，抑制了Flavonifractor等有害菌的生長，促進(jìn)腸道微生態(tài)環(huán)境的健康，而健康的腸道環(huán)境使Clostridium XlVa能夠正常發(fā)揮其功能。