白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁體細(xì)胞、酶、炎性和抗氧化因子影響

錢柏霖，尤留超，張 鉞，莘 余，呂尚揆，肖勁邦，蘇柘僮，董 可，裴淼毓，左昌雄，楊世林，馮育林*，沈留紅*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院/動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/奶牛疾病研究中心，四川 成都 611130；2.廣西英路維特藥物有限公司，廣西 荔浦 541100；3.四川育強(qiáng)本草生物技術(shù)有限公司，四川 成都 611130；4.江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006）

【研究意義】臨床型乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害最為嚴(yán)重的疾病之一，不僅會降低奶牛生產(chǎn)性能、泌乳量和乳品質(zhì)，而且治療周期長、成本高，嚴(yán)重影響牧場效益。目前國內(nèi)外主要通過使用各種抗菌藥物防治該病，然而長期、大量反復(fù)使用抗菌藥物不僅導(dǎo)致療效下降、抗生素殘留和耐藥菌株產(chǎn)生等問題，還嚴(yán)重危害人類健康。為配合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部開展的“獸用抗菌藥使用減量化行動”，探尋天然高效、無耐藥性和乳汁殘留的抗生素替代藥物極具研究價(jià)值，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】奶牛發(fā)生乳房炎時，致炎因素刺激機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等炎癥介質(zhì)[1]，損傷乳腺細(xì)胞并導(dǎo)致血管擴(kuò)張，促使血液中白細(xì)胞進(jìn)入乳汁，引起體細(xì)胞數(shù)（somatic cell counts，SCC）升高并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[2]。在體細(xì)胞溶酶體酶作用下，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-d-glucosaminidase，NAG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，AST）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）等活性改變[3-4]。同時，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體氧化-抗氧化失衡，使總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化指標(biāo)水平降低，丙二醛（malonaldehyde，MDA）堆積，造成乳腺氧化損傷[5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】白頭翁及其提取物皂苷B4 可明顯抑制金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌等[6]，下調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α水平，抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[7]，提高機(jī)體抗氧化和抗凋亡功能[8]，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答[9]，兼具藥物和營養(yǎng)劑雙重作用，高效低毒且不易產(chǎn)生耐藥性和乳汁殘留，在替代抗生素治療乳房方面極具潛力和研究價(jià)值，且其治療臨床型乳房炎奶牛療效顯著[10]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)旨在探究白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁SCC，乳清酶LDH、NAG、ALT、AST、ALP、ACP，炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 和抗氧化因子T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、MDA的影響，為其防治奶牛臨床型乳房炎提供數(shù)據(jù)支持，并為其臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

選用規(guī)?；敕忾]統(tǒng)一舍飼，2～3胎次泌乳高峰期、泌乳天數(shù)、產(chǎn)奶量相近的臨床檢查健康和臨床型乳房炎中國荷斯坦奶牛各12頭，自由飲水，統(tǒng)一全混合日糧飼喂，試驗(yàn)期間均無其他疾病發(fā)生，試驗(yàn)前后也未接受抗生素治療。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 體細(xì)胞檢測儀，De Laval，瑞士；臺式離心機(jī)，TGLB-16G，Sigma；超低溫冰箱，DW-86L828W，海爾；超凈工作臺，SW-CJ-1F，蘇凈集團(tuán)；全波長酶標(biāo)儀，Varioskan Flash，美國；紫外可見分光光度計(jì)，Lambda 45，美國；電子恒溫水浴鍋，DZKW-4，北京中興；微量加樣器，LH99186，美國Thermo。

1.2.2 主要試劑 白頭翁皂苷B4 注射液（100 mL/瓶，白頭翁皂苷B4 含量66.00%），PubChem CID：11636713，由英路維特醫(yī)藥科技有限公司惠贈，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心鑒定。

乳酶LDH、NAG、ALT、AST、ALP、ACP，炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α，抗氧化因子T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、MDA雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒，上海酶聯(lián)生物。

1.3 方法

1.3.1 臨床型乳房炎奶牛判斷標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)?zāi)膛＞鶠樽匀桓腥?，由牧場同一?zhí)業(yè)獸醫(yī)判定，表現(xiàn)典型臨床體征，入選標(biāo)準(zhǔn)如下：感染乳區(qū)乳汁SCC＞50 萬/mL，患區(qū)紅、腫，觸之敏感、不安、躲避等，體溫升高，乳腺腫大，泌乳量顯著減少或停止，乳汁異常，呈淺黃色或淺紅色，稀薄、粘稠或有絮狀物[11-12]。

1.3.2 分組和給藥 12 頭健康奶牛記為對照組（不注射藥物），12 頭臨床型乳房炎奶牛記為試驗(yàn)組（按0.05 mL/kg頸部肌肉注射白頭翁皂苷B4，1 次/d，連續(xù)6 d），乳房炎發(fā)病當(dāng)天記為第0天，觀察臨床療效至第12天。

1.3.3 乳清采集和保存 每日08:00 于用藥前分別采集各組奶牛第0、1、3、5、7、9、11 天乳汁。采樣前溫水清洗乳房，75%酒精消毒，棄去前3 把后采集10 mL 乳汁，5 mL 立即檢測SCC，5 mL 在4 ℃下10 000 r/min 離心2次，30 min/次，充分脫脂，直至透明清亮，取上層乳清，-80 ℃凍存。

1.3.4 體細(xì)胞數(shù)和乳清因子檢測 分別采用De Laval 乳汁體細(xì)胞檢測儀和ELISA 法檢測試驗(yàn)?zāi)膛５?、1、3、5、7、9、11 天乳汁SCC 和乳清酶LDH、NAG、AST、ALT、ALP、ACP，炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα，抗氧化因子T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，K-S檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，各計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±Standard Deviation）表示，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)的影響

如表1所示，試驗(yàn)組臨床型乳房炎奶牛乳汁SCC在0～7 d顯著高于對照組（P＜0.05），隨用藥時間推移呈下降趨勢，在0～7 d 顯著下降（P＜0.05），7～11 d 無顯著變化（P＞0.05），并在9、11 d 與對照組差異不顯著（P＞0.05），表明白頭翁皂苷B4可顯著降低臨床型乳房炎奶牛乳汁SCC。

表1 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)的影響Tab.1 The effect of Pulsatilla saponin B4 on somatic cell count of milk in dairy cows with clinical mastitis

2.2 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清酶的影響

如表2 所示，臨床型乳房炎奶牛乳清LDH 和NAG 在0～3 d 顯著高于對照組（P＜0.05），AST 和ACP 在0～5 d 顯著高于對照組（P＜0.05），ALT 在0～7 d 顯著高于對照組（P＜0.05），ALP 在0～11 d 顯著高于對照組（P＜0.05），隨用藥時間推移，各指標(biāo)均呈下降趨勢；其中LDH和NAG在5～11 d與對照組差異不顯著（P＞0.05），AST和ACP在7～11 d與對照組差異不顯著（P＞0.05），ALT在9～11 d與對照組差異不顯著（P＞0.05），ALP 在用藥后仍顯著高于對照組（P＜0.05），但其含量顯著低于發(fā)病初（P＜0.05），表明白頭翁皂苷B4可顯著促進(jìn)臨床型乳房炎奶牛乳酶恢復(fù)至健康水平。

表2 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清酶的影響Tab.2 The effect of Pulsatilla saponin B4 on enzymes activity of whey in dairy cows with clinical mastitis

2.3 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清炎性因子的影響

如表3 所示，試驗(yàn)組臨床型乳房炎奶牛乳清IL-1β 在0～5 d 顯著高于對照組（P＜0.05），IL-6、IL-8 和TNF-α 在0～7 d 顯著高于對照組（P＜0.05），隨用藥時間推移，各指標(biāo)均呈下降趨勢；其中IL-1β 在7～11 d與對照組差異不顯著（P＞0.05），IL-6、IL-8 和TNF-α 在9～11 d 與對照組差異不顯著（P＞0.05），表明白頭翁皂苷B4可顯著降低臨床型乳房炎奶牛乳清炎性因子含量。

表3 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清炎性因子的影響Tab.3 The effect of Pulsatilla saponin B4 on inflammatory factors of whey in dairy cows with clinical mastitis

2.4 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清抗氧化因子的影響

如表4 所示，臨床型乳房炎奶牛乳清T-AOC 和GSH-Px 在0～5 d 顯著低于對照組（P＜0.05），CAT 和SOD 分別在0～3 d 和0～1 d 顯著低于對照組（P＜0.05），隨用藥時間推移，各指標(biāo)均呈上升趨勢，其中TAOC 和GSH-Px 在7～11 d 與對照組差異不顯著（P＞0.05），CAT 和SOD 分別在5～11 d 和3～11 d 與對照組差異不顯著（P＞0.05）；MDA 含量在0～1 d 顯著高于對照組（P＜0.05），隨用藥時間推移，呈下降趨勢，在3～11 d 與對照組差異不顯著（P＞0.05），表明白頭翁皂苷B4 可顯著升高臨床型乳房炎奶牛乳清抗氧化因子含量，降低脂質(zhì)過氧化物含量。

表4 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清抗氧能力的影響Tab.4 The effect of Pulsatilla saponins B4 on antioxidant index of whey in dairy cows with clinical mastitis

3 討論與結(jié)論

3.1 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁體細(xì)胞和炎性因子的影響

奶牛乳汁SCC是指每毫升原乳含有的細(xì)胞總數(shù)，主要包括巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞以及脫落的乳腺上皮細(xì)胞等，它們共同參與乳房細(xì)胞免疫，其含量隨乳房炎嚴(yán)重程度增加而升高，可作為奶牛臨床型乳房炎早期診斷和療效評估指標(biāo)[13]。當(dāng)奶牛發(fā)生乳房炎時，病原微生物刺激并激活其合成和分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子參與炎癥反應(yīng)，而炎性因子通過趨化作用，又吸引免疫細(xì)胞向炎癥部位聚集，最終造成乳腺炎癥相關(guān)因子過度表達(dá)，導(dǎo)致乳腺細(xì)胞損傷加劇[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，臨床型乳房炎奶牛乳汁SCC 和炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 含量顯著高于健康奶牛（P＜0.05），與資料報(bào)道一致[15]，可能是細(xì)菌感染損傷乳腺組織，使血管增強(qiáng)通透性，血液白細(xì)胞進(jìn)入乳中，導(dǎo)致SCC 升高并產(chǎn)生大量的炎性因子引起炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)中藥可有效提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能，減輕泌乳期奶牛炎癥反應(yīng)，降低乳汁SCC，提高奶牛生產(chǎn)性能和乳品質(zhì)[16-17]。白頭翁皂苷B4具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[18]，可顯著降低中性粒細(xì)胞數(shù)量[19]，通過抑制炎癥信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)，下調(diào)炎性因子含量，發(fā)揮抗炎作用[20]。本試驗(yàn)中，臨床型乳房炎奶牛經(jīng)白頭翁皂苷B4治療后，乳汁SCC、IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05），并最終接近正常水平，與上述學(xué)者研究結(jié)果一致，說明白頭翁皂苷B4具有顯著抗炎效果，通過降低促炎因子含量，減輕乳腺炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)乳房恢復(fù)健康，而炎性因子的減少又抑制巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向乳腺損傷部位趨化和募集，降低乳汁SCC，形成良性循環(huán)，最終恢復(fù)至健康水平。

3.2 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳酶的影響

奶牛乳酶參與乳汁產(chǎn)生和分泌，在乳腺先天性免疫和抗氧化過程中發(fā)揮重要作用，但當(dāng)奶牛發(fā)生乳房炎時，其活性顯著變化，因此乳酶活性對診斷奶牛乳房炎具有重要意義。其中LDH 和NAG 含量在乳房炎奶牛乳汁中顯著升高，反映白細(xì)胞聚集過程和乳腺組織損害程度，可作為乳房炎早期診斷指標(biāo)[4,21]，乳房炎牛乳中ALP 和ACP 含量隨乳房炎嚴(yán)重程度增加而升高[22]，而AST 和ALT 在一定程度上可判斷乳腺損傷和炎癥感染程度[23]。本試驗(yàn)中，臨床型乳房炎奶牛乳清NAG、LDH、AST、ALT、ALP 和ACP 含量均顯著高于健康奶牛（P＞0.05），與上述研究結(jié)果一致，乳房炎導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞和血乳屏障受損，血液中酶直接進(jìn)入乳中，同時體細(xì)胞中大量溶酶體發(fā)生溶解，進(jìn)一步使乳中酶活性升高。而使用白頭翁皂苷B4 治療后，臨床型乳房炎奶牛乳清NAG、LDH、AST、ALT 和ACP 含量均呈下降趨勢，并最終基本恢復(fù)至健康水平，與于文會等[24]和覃杰等[25]研究結(jié)果一致，白頭翁皂苷B4 修復(fù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞并增強(qiáng)中性粒細(xì)胞殺菌能力，抑制血液體細(xì)胞和溶酶體向乳汁轉(zhuǎn)移[26]，并增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[27]，促使奶牛乳酶恢復(fù)正常水平。

3.3 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清抗氧化能力的影響

炎癥發(fā)展過程中，免疫細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除病原體，機(jī)體耗氧量增加并產(chǎn)生過量超氧陰離子（superoxide anion，）。當(dāng)抗氧化能力不足以清除時，細(xì)胞發(fā)生氧化變化并誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，從而損害奶牛乳腺組織[28]。反映機(jī)體抗氧化功能指標(biāo)主要有T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT和MDA 等，其中T-AOC 是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，可判斷機(jī)體氧化應(yīng)激程度[29]。GSH-Px是重要的脂質(zhì)過氧化物分解酶，可衡量機(jī)體抗氧化能力[30]。SOD和CAT可通過清除和過氧化氫等強(qiáng)氧化性物質(zhì)，減緩氧自由基對細(xì)胞氧化損傷[31]。MDA 則是機(jī)體脂質(zhì)受氧自由基攻擊損害程度的重要指標(biāo)之一[32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，臨床型乳房炎奶牛乳清T-AOC、GSH-Px、SOD 和CAT含量顯著低于健康奶牛（P＜0.05），MDA 顯著高于對照組（P＜0.05），與尹柏雙等[33]研究結(jié)果一致，可能是機(jī)體為對抗炎癥反應(yīng)，不斷產(chǎn)生和過氧化氫殺滅病原菌，但氧自由基過多引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使抗氧化酶活性降低，造成組織細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致奶牛氧化-抗氧化失衡。研究表明白頭翁、秦皮和杜仲混合提取物可提高麻鴨免疫功能和抗氧化能力[34]。白頭翁及皂苷B4可提高T-AOC和SOD含量，降低MDA含量[35-36]。本試驗(yàn)中，白頭翁皂苷B4 提高了臨床型乳房炎奶牛乳清T-AOC、GSH-Px、SOD 和CAT 含量，降低MDA 含量，與He等[8]研究結(jié)果一致，可能是白頭翁皂苷B4促進(jìn)奶牛機(jī)體T-AOC 和SOD 將過多的轉(zhuǎn)換為過氧化氫，并在GSH-Px 和CAT 作用下生成水和氧氣，從而減輕機(jī)體和MDA 堆積，避免細(xì)胞受損，恢復(fù)抗氧化功能[37]。

白頭翁皂苷B4可顯著降低臨床型乳房炎奶牛炎癥反應(yīng)和乳汁SCC，促進(jìn)乳酶恢復(fù)正常水平，增強(qiáng)乳腺抗氧化能力，是治療奶牛臨床型乳房炎的理想藥物。