東鄉(xiāng)野生稻對稻曲病抗性鑒定與分析

胡建坤，黃 蓉，李湘民，劉永鋒，曹志斌，黃瑞榮*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，江西 南昌 330200；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，江蘇 南京 210014；3.江西省農(nóng)業(yè)科學院 江西省超級水稻研究發(fā)展中心，江西 南昌 330200）

【研究意義】水稻稻曲病是由稻綠核菌（Ustilaginoidea virens（Cooke）Takaheshi）引起的一種水稻中后期穗部真菌病害[1]，發(fā)病時在水稻穗部形成稻曲球，不僅導致水稻產(chǎn)量的下降[2]，還嚴重影響稻米品質[3]。20世紀80年代以后隨著密穗型雜交水稻大面積的推廣和氮肥的過量使用，稻曲病在我國各大水稻主產(chǎn)區(qū)逐年加重[4]，給水稻生產(chǎn)安全帶來了嚴重威脅。伴隨著勞動力成本的提高，人們對食品安全的日益重視及對環(huán)境保護的迫切需要，種植抗病品種成為最為經(jīng)濟有效安全的抗病措施，而抗性資源篩選是抗病育種工作的基礎[5]?！厩叭搜芯窟M展】馮愛卿等[6]研究發(fā)現(xiàn)廣東57個已審定的水稻品種對稻曲病抗感比為19.3∶80.7，高感品種達34 個，表明廣東審定品種大多為感稻曲病品種。蘭波等[7]研究發(fā)現(xiàn)江西16 個“秈改粳”候選品種中甬優(yōu)系列品種大多數(shù)都易感稻曲病，只有池優(yōu)65等4個品種對稻曲病有一定抗性。余山紅等[8]研究表明浙江省水稻主栽品種對稻曲病的抗性水平較低，雜交水稻品種尤其感病?？娊ㄥK等[9]研究發(fā)現(xiàn)遼寧省200個水稻主栽品種對稻曲病抗∶中∶感比值分別為19.5∶43.5∶37，整體抗病性較差。上述研究結果表明截至目前我國水稻主產(chǎn)區(qū)普遍存在主栽品種或審定品種抗稻曲病性較差的問題，抗稻曲病種質資源也比較匱乏?！颈狙芯壳腥朦c】東鄉(xiāng)野生稻（簡稱東野，下同）具宿根（多年生），再生力和繁殖（無性）力強，抗逆性強，含廣親和基因、恢復基因、抗病蟲基因等多種有利基因[10]。姜文正等[11]指出東野多數(shù)群落對黃矮病免疫，抗白葉枯病、稻瘟病，半數(shù)以上群落對白葉枯病、細條病表現(xiàn)多抗。黃瑞榮等[12]發(fā)現(xiàn)東野易感稻瘟病，但對白葉枯病和細條病抗性好，同時發(fā)現(xiàn)有5 份材料對以上3 種病害均表現(xiàn)抗性，為理想的抗原材料。然而，東野對稻曲病的抗性情況尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】在之前研究中，筆者掌握了東鄉(xiāng)野生稻稻曲病人工接種技術，在此基礎之上，筆者繼續(xù)開展了東野對稻曲病抗性鑒定，以了解其對稻曲病抗性水平，同時對其抗病原因進行初步分析，為東野在水稻抗稻曲病育種工作中應用給予評價。

1 材料與方法

1.1 東鄉(xiāng)野生稻對稻曲病抗性鑒定

1.1.1 供試水稻種植與管理 東鄉(xiāng)野生稻的種植與管理：東野單株材料于2015 年從江西省農(nóng)科院水稻研究所東野異地保存圃中獲得，共107 份，每份材料種植1 兜，兜與兜之間距離60 cm，接種試驗于2016 年進行。東野單株在自然條件下按常規(guī)方法進行管理，防治蟲害但不防治病害，其適合接種孕穗期在9 月5 日左右，并不會因為種植時間的提前或延后而改變。兩優(yōu)培九的種植與管理：目前尚沒有野生稻對稻曲病抗性鑒定的報道，因此筆者以感病栽培水稻兩優(yōu)培九作為對照。兩優(yōu)培九共播種兩組，第1組于5月15日播種（CK1），適合接種孕穗期在8月15日左右。第2組分別于6月6日、6月13日、6 月20 日播種（CK2），適合接種孕穗期在9 月5 日左右。第1 組兩優(yōu)培九為正常播種，用于該水稻適宜播種期下的稻曲病菌接種試驗。第2 組兩優(yōu)培九為推遲播種，目的是讓該組水稻孕穗期與東野孕穗期一致，以便于東野和對照可以在相同時間內(nèi)進行接種試驗。2 組水稻移栽秧齡30 d，每批移栽10 行，每行8 叢，株行距21 cm×25 cm，設保護行和工作行。兩優(yōu)培九在自然條件下按常規(guī)方法進行管理，防治蟲害但不防治病害。

1.1.2 稻曲病菌菌株及接種體準備 供試強致病力稻曲病菌菌株UvB367 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所劉永鋒研究員提供。將該菌株活化后挑取新鮮稻曲病菌菌絲體到含有100 mL 馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下震蕩培養(yǎng)7 d。之后用組織搗碎機搗碎配制成菌絲片段-分生孢子混合液接種體，用無菌水將該接種體分生孢子濃度稀釋至1×106個/mL備用。

1.1.3 稻曲病菌接種 參考張君成等[13]、胡建坤等[14]報道，采用注射接種方法，選擇東野及兩優(yōu)培九生長期分別處于劍葉與倒二葉葉枕距為（4±0.5）cm 和（6±0.5）cm 的稻穗于當日16：00—18：00進行接種，接種菌液量為2 mL，不足2 mL 的直至菌液從劍葉葉鞘處流出為止。根據(jù)水稻實際生長情況，每個東野單株材料接種稻穗5～10穗，每批次兩優(yōu)培九接種稻穗20穗。

1.1.4 稻曲病發(fā)病情況調查 于接種后10 d進行第1次水稻稻曲病病情調查，之后每隔3 d調查1次，以水稻接近成熟時稻曲球不再增加時結束調查。調查方法為統(tǒng)計每個接種稻穗上病粒數(shù)（稻曲球個數(shù)）并計算病穗平均病粒數(shù)。

參考王舒婷[15]方法，制定了稻曲病抗病性分級標準：病穗平均病粒數(shù)=0，高抗（HR）；0＜病穗平均病粒數(shù)≤2，抗病（R）；2＜病穗平均病粒數(shù)≤5，中抗（MR）；5＜病穗平均病粒數(shù)≤10，中感（MS）；10＜病穗平均病粒數(shù)≤15，感?。⊿）；病穗平均病粒數(shù)＞15，高感（HS）；

1.2 東鄉(xiāng)野生稻抗稻曲病原因初步分析

1.2.1 東鄉(xiāng)野生稻及兩優(yōu)培九穗苞菌液容納量及不同菌液量接種后兩優(yōu)培九發(fā)病情況調查 參考1.1.3，分別隨機選擇20 穗東野及兩優(yōu)培九進行注射接種，接種至菌液從劍葉葉鞘處剛溢出為止，計算接種菌液量，即為穗苞菌液容納量。統(tǒng)計最小穗苞菌液容納量、最大穗苞菌液容納量及平均穗苞菌液容納量。另隨機選擇20 穗兩優(yōu)培九進行注射接種，接種菌液量分別為0.5，1，1.5，2 mL，隨后參照1.4 進行稻曲病發(fā)病情況調查。

1.2.2 東鄉(xiāng)野生稻及兩優(yōu)培九破口時穗苞長度及直徑調查 當1.2.1 接種水稻剛破口時，分別測量其穗苞長度及直徑，并計算其平均穗苞長度及平均直徑。穗苞的長度為倒二葉葉枕與穗苞頂端的距離，穗苞直徑為整個穗苞最粗的地方的寬度。

1.2.3 接種后10 d 氣溫調查 在1.1.3 參試水稻接種后，分別記錄其后10 d 天氣的日最高溫度、日最低溫度，計算其平均日最高溫度、平均日最低溫度以及總平均溫度。

2 結果與分析

2.1 東鄉(xiāng)野生稻對稻曲病抗性

調查結果顯示，107份東野材料對稻曲病抗性存在高抗、抗病、中抗、中感4個等級，不存在感病和高感材料，說明不同東野單株材料對稻曲病抗性存在差異（表1）。4個抗性等級材料中，表現(xiàn)高抗的材料有19 份，占鑒定材料的17.76%；表現(xiàn)抗病的材料有74 份，占鑒定材料的69.16%；表現(xiàn)中抗的材料有12 份，占鑒定材料的11.21%；表現(xiàn)中感的材料有2 份，占鑒定材料的1.87%，高抗及抗病材料占鑒定材料的86.92%，沒有感病及高感材料，表明東野材料整體對稻曲病有較好的抗性（表2）。對照兩優(yōu)培九調查結果顯示，第一組對照（CK1）稻曲病平均數(shù)為28.90，抗性等級為高感，第二組對照（CK2）稻曲病平均數(shù)為6.25，抗性等級為中抗，表明在其他接種條件相同情況下，推遲播種后的兩優(yōu)培九其稻曲病病情指數(shù)明顯低于正常播種下的稻曲病病情指數(shù)。

表1 107份東鄉(xiāng)野生稻單株材料對稻曲病菌的抗性結果Tab.1 Resistance results of 107 Dongxiang Wild Rice materials to Ustilaginoidea virens

表2 不同抗性東鄉(xiāng)野生稻單株材料數(shù)量及比例Tab.2 Number and proportion of materials with different resistance levels

2.2 東鄉(xiāng)野生稻抗稻曲病原因初步分析

2.2.1 東鄉(xiāng)野生稻穗苞菌液容納量 調查結果顯示，在接種的20穗東野材料中，最小的穗苞菌液容納量為0.52 mL，最大的穗苞菌液容納量為1.53 mL，平均穗苞菌液容納量為0.88 mL；在接種的CK1材料中，最小的穗苞菌液容納量為1.41 mL，最大的穗苞菌液容納量為3.24 mL，平均穗苞菌液容納量為1.93 mL；在接種的CK2 材料中，最小的穗苞菌液容納量為1.43 mL，最大的穗苞菌液容納量為2.68 mL，平均穗苞菌液容納量為1.79 mL（表3）。該結果表明，在稻曲病人工接種試驗中，東野材料稻曲病菌穗苞菌液容納量遠遠低于兩優(yōu)培九；推遲播種的兩優(yōu)培九的最多接種菌液量與正常播種的兩優(yōu)培九差異不明顯。

表3 東鄉(xiāng)野生稻及兩優(yōu)培九穗苞菌液容納量Tab.3 The inoculum capacity of Dongxiang Wild Rice and Liangyoupeijiu

2.2.2 不同菌液量接種后兩優(yōu)培九發(fā)病情況 調查結果顯示，當接種菌液量為0.5 mL時，稻曲球個數(shù)平均值為3.95，抗性鑒定結果為中抗（MR）；當接種菌液量為1 mL時，稻曲球個數(shù)平均值為10.15，抗性鑒定結果為感?。⊿）；當接種菌液量為1.5 mL時，稻曲球個數(shù)平均值為26.40，抗性鑒定結果為高感（HS）；當接種菌液量為2 mL時，稻曲球個數(shù)平均值為31.20，抗性鑒定結果為高感（HS）（表4）。該結果表明，在其他條件相同的情況下，接種菌液量的減少會降低稻曲病發(fā)病程度。

表4 不同接種菌液量接種后稻曲球個數(shù)Tab.4 Number of flash smut balls after inoculation with different inoculum liquid

2.2.3 東鄉(xiāng)野生稻及兩優(yōu)培九破口時穗苞長度及直徑 調查結果顯示，東野破口時穗苞長度最小值為21.57 cm，最大值為33.68 cm，平均穗苞長度為28.73 cm；CK1破口時穗苞長度最小值為18.90 cm，最大值為25.13 cm，平均穗苞長度為22.05 cm；CK2破口時穗苞長度最小值為16.53 cm，最大值為23.36 cm，平均穗苞長度為19.94 cm。東野破口時穗苞直徑最小值為0.51 cm，最大值為0.75 cm，平均穗苞長度為0.65 cm；CK1破口時穗苞直徑最小值為0.68 cm，最大值為1.03 cm，平均穗苞長度為0.87 cm；CK2破口時穗苞直徑最小值為0.60 cm，最大值為0.91 cm，平均穗苞長度為0.79 cm（表5）。該結果表明東野材料與兩優(yōu)培九穗型存在顯著差異，其穗苞長度顯著大于兩優(yōu)培九，穗苞直徑顯著小于兩優(yōu)培九。

表5 東鄉(xiāng)野生稻及兩優(yōu)培九破口時穗苞長度與直徑Tab.5 The spike length and width of Dongxiang Wild Rice and Liangyoupeijiu when spike broke

2.2.4 接種后10 或16 d 天氣溫度 在該試驗中CK1 接種時間為8 月15 日，其后10 d 日最高溫度平均值為32.4 ℃，日最低溫度平均值為24.2 ℃，日平均溫度平均值為28.3 ℃。CK2 接種時間為9 月4 日，其后10 d 日最高溫度平均值為28.3 ℃，日最低溫度平均值為21.1 ℃，日平均溫度平均值為24.7 ℃。由于東野單株材料之間孕穗時間略有差異，因此其接種時間為9 月4 日至9 月10 日，共計7 d，因此其測溫時間為9 月5 日至9 月20 日，總計16 d，其日最高溫度平均值為27.4 ℃，日最低溫度平均值為20.6 ℃，日平均溫度平均值為24.0 ℃（表6，圖1）。該結果表明，東野及對照CK2 接種后氣溫溫度顯著低于CK1 接種后的溫度。

圖1 不同處理接種后10或16 d日平均溫度對比Fig.1 Comparison of daily average temperature 10 or 16 days after inoculation with different treatments

表6 不同處理接種后10或16 d溫度Tab.6 Temperature at 10 or 16 days after inoculation with different treatments

3 小結與討論

有研究認為，稻曲病的發(fā)生程度與水稻株形或穗型存在一定的相關性。徐正進等[16]、劉伯林等[17]一致認為稻曲病的發(fā)生與水稻穗部性狀有較密切的聯(lián)系，相關性大小為每穗粒數(shù)、二次枝梗粒數(shù)、二次枝梗數(shù)、著粒密度和二次粒率，即有二次枝梗個數(shù)和二次枝梗粒數(shù)多的大穗、密穗型才發(fā)病率高，一次枝梗數(shù)和一次枝梗粒數(shù)多的大穗、密穗型發(fā)病率不一定高，而二次枝梗個數(shù)和二次枝梗粒數(shù)越多，水稻穗直徑越大。王大為等[18]則指出，水稻稻曲病的發(fā)生不僅與上述穗部性狀相關以外，還與穗長等性狀呈極顯著或顯著的負相關，長穗型水稻品種不易發(fā)病。本研究中，東野材料穗部性狀與對照兩優(yōu)培九存在顯著差異，其穗苞直徑顯著小于兩優(yōu)培九，其穗苞長度顯著大于兩優(yōu)培九，其對稻曲病抗性也遠遠高于兩優(yōu)培九，該結論與上述研究成果一致。進一步研究表明，東野材料穗苞菌液容納量顯著低于對照兩優(yōu)培九，這可能與它們穗型的顯著差異有關，不同接種菌液量在兩優(yōu)培九上的接種試驗又表明接種菌液量的多少與病情發(fā)生重輕呈現(xiàn)正相關性，即接種菌液越多，稻曲病發(fā)病越重。因此，穗型與稻曲病發(fā)生程度之間的相關性，可能是由于不同穗型導致水稻穗苞內(nèi)部無谷?？臻g的不同，間接導致了在自然條件或人工接種下水稻與病原菌之間接觸的頻率與數(shù)量的不同，從而影響了稻曲病發(fā)生程度。對于東野材料，其穗苞呈細長狀，穗苞中無谷?？臻g體積較小，間接降低和減少了東野材料谷粒在自然生長或者人工接種中與稻曲病菌接觸的頻率與數(shù)量，減輕了稻曲病的發(fā)生程度，這可能是東野材料對稻曲病整體抗性水平較高的原因之一。

在影響稻曲病發(fā)生的因素中，降水、濕度、溫度及日照時長等氣象因素是另一些被重點研究的對象。有研究認為稻曲病的發(fā)生只受某一種氣象因素影響，錢均瑞等[19]研究表明隨著光照強度的逐漸減弱，稻曲病的發(fā)病率有上升趨勢。更多研究認為稻曲病的發(fā)生受多種氣象因素綜合影響，F(xiàn)ujita 等[20]發(fā)現(xiàn)低溫高濕（溫度15 ℃、濕度100%）有利于稻曲病的侵染，但較高溫度（25～35 ℃）有利于病害顯癥；呂川根等[21]研究表明兩優(yōu)培九稻曲病發(fā)病率與抽穗后0～15 d 的平均氣溫呈顯著正相關，相對濕度起協(xié)同作用；潘勛等[22]對1987—1996 年十年間的氣象資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)稻曲病嚴重度與7 月中旬至8 月底累計日照時數(shù)和總降雨關系密切，日照時數(shù)減少和降雨量增加時病情趨于嚴重；Bhagat 等[23]報道在日夜較低溫度（約25～30 ℃）、有大的降雨量以及較高的相對濕度時稻曲病發(fā)病率高，每日的云陰時數(shù)與病害的程度呈正相關。但不同氣象因素之間存在著必然的相關性，比如降水的增多必然會導致空氣濕度的增加及日照時間的減少，也經(jīng)常會伴隨著氣溫的下降，因此推斷上述氣象因素并非都對稻曲病的發(fā)生起重要影響。目前更多研究表明稻曲病的初傳染源為厚垣孢子[24]，厚垣孢子只有在水中才能萌發(fā)[25]，表明濕度對稻曲病菌的侵染很重要。厚垣孢子萌發(fā)溫度為21～31 ℃，以28 ℃適宜，萌發(fā)后形成的菌絲體在22～30 ℃下均能良好生長，以28 ℃生長最快，低于13 ℃時，菌絲仍能生長但速度明顯減慢，高于35 ℃時，菌絲生長被抑制[26]，表明溫度對稻曲病的發(fā)生程度影響較大。綜上所述，濕度及溫度才是影響稻曲病發(fā)生及發(fā)病程度最重要的氣象因素。本研究中，正常播種兩優(yōu)培九（CK1）接種后10 d的日平均溫度平均值為28.3 ℃，利于稻曲病菌的生長，而推遲播種兩優(yōu)培九（CK2）接種后10 d 及東野材料接種后16 d 日平均溫度平均值分別為24.7 ℃和24.0 ℃，顯著低于稻曲病菌生長的最適宜溫度，從而減輕了稻曲病的發(fā)病程度，這可能間接影響了東野材料對稻曲病的抗性，而且筆者推測，由于東野材料與常規(guī)栽培稻相比生育期晚20～30 d，導致其孕穗后期溫度偏低是其對多種病蟲害都具有不同程度抗性的原因之一。

目前尚沒有東野材料對稻曲病抗性鑒定的報道，本研究填補了這一空白。利用人工接種技術，鑒定了107 份東野材料對稻曲病的抗性，結果表明，東野對稻曲病有較高的抗性水平，其中86.92%的材料對稻曲病具有抗病及以上的抗性等級。通過對東野材料穗苞長度、寬度、菌液容納量以及接種后一定時間內(nèi)氣溫調查、統(tǒng)計及分析，表明東野材料對稻曲病的抗性可能與東野材料細長狀的穗型不利于稻曲病菌的侵入，以及東野材料孕穗時氣溫較低、不利于稻曲病菌厚垣孢子的萌發(fā)及菌絲體的生長有關。東野材料的穗型及生育期都屬于可遺傳因素，因此可以在水稻育種工作中應用，通過改良栽培水稻的穗型及推遲水稻生育期，提高水稻對稻曲病的抗性。東野材料對稻曲病的抗性應該還存在其他的抗病機制，需要進行進一步研究。