圓齒野鴉椿大小孢子發(fā)生及雌雄配子體形成

萬瑞琪，邵曉雪，吳凌敏，涂淑萍*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省景德鎮(zhèn)市林科所，江西 景德鎮(zhèn) 333000；3.江西省景德鎮(zhèn)市煙草專賣局，江西 景德鎮(zhèn) 333000）

【研究意義】圓齒野鴉椿（Euscaphis konishiiHayata）為省沽油科野鴉椿屬常綠小喬木，是我國特有的藥、賞兩用樹種，野生資源主要分布在廣東、海南、廣西、福建、江西、湖南、貴州和四川等地[1]。圓齒野鴉椿結(jié)果量大，觀果期長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月之久，跨秋、冬和翌年春三季，種子粘掛在反卷、形似蝴蝶的內(nèi)果皮上，猶如滿樹紅花上點(diǎn)綴著的黑珍珠，觀賞價(jià)值極高，還可豐富秋冬季園林景觀和生物多樣性。目前，野鴉椿屬植物中已發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分主要有三萜類、黃酮類和酚酸類等，具有抗腫瘤、抗肝纖維化和抗炎抑菌等藥理活性[2-3]。因此，大力開發(fā)利用和推廣種植該鄉(xiāng)土樹種，對(duì)于促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著極其重要的意義。種苗培育是開發(fā)利用優(yōu)良鄉(xiāng)土植物資源的關(guān)鍵，目前，圓齒野鴉椿育苗仍以播種繁殖為主，種子質(zhì)量是其發(fā)芽率和培育壯苗的關(guān)鍵。此外，播種繁殖在圓齒野鴉椿優(yōu)良種源家系的選擇和雜交育種方面亦具有重要地位。調(diào)查研究過程中發(fā)現(xiàn)，該樹種存在空籽率高，種子發(fā)芽率低且具有深休眠現(xiàn)象，從而大大降低了其種苗繁育效能?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國內(nèi)學(xué)者已在野鴉椿屬植物種質(zhì)資源[4-5]、生態(tài)生物學(xué)特性[6]、種苗繁育[7-10]、種子休眠[11-14]等方面進(jìn)行了大量研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物種子質(zhì)量與其胚胎發(fā)育關(guān)系密切，然而關(guān)于圓齒野鴉椿生殖生物學(xué)及胚胎學(xué)方面的研究極為匱乏?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究擬采用石蠟切片法觀察圓齒野鴉椿大小孢子發(fā)生與雌雄配子體形成，旨在從胚胎學(xué)方面探討其空籽率高、種子發(fā)芽率低的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林實(shí)訓(xùn)基地（28°46'N，115°55'E，海拔50 m）種植的12 年生圓齒野鴉椿實(shí)生苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 圓齒野鴉椿大小孢子發(fā)生和雌雄配子體形成 于2015年5月起，接近開花時(shí)每天觀察一次；開花期間，每隔幾個(gè)小時(shí)觀察一次，采集不同發(fā)育階段的花芽，將其外部鱗片剝離后處理成小份，放入含70%FAA固定液中抽真空保存。石蠟切片法[15]制片，電子顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 圓齒野鴉椿花粉形態(tài)觀察 采集當(dāng)天開放的新鮮花朵與其花藥，用雙面膠處理后噴金，在顯微鏡下觀察拍照[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓齒野鴉椿小孢子發(fā)生與雄配子體形成

2.1.1 小孢子發(fā)生 雄蕊多為5 枚，每枚含4 個(gè)對(duì)稱發(fā)育小孢子囊?；ㄋ幇l(fā)育初期，其橫切面類似于梯形的結(jié)構(gòu)（圖1a）。隨后其四周原表皮下第一層細(xì)胞分裂，形成體積較大、細(xì)胞核明顯的孢原細(xì)胞（圖1b）。孢原細(xì)胞分裂形成周緣細(xì)胞和初生造孢細(xì)胞。周緣細(xì)胞后形成花藥壁，由內(nèi)到外依次為絨氈層、中層、藥室內(nèi)壁和表皮（圖1c）；初生造孢細(xì)胞最終形成小孢子母細(xì)胞（圖1d）。

圖1 小孢子發(fā)生Fig.1 Microsporogenesis

2.1.2 雄配子體形成 小孢子母細(xì)胞經(jīng)兩次減數(shù)分裂形成4 個(gè)子細(xì)胞，由胼胝質(zhì)相連（圖2a）呈四面體排列。后期胼胝質(zhì)分解，4 個(gè)子細(xì)胞分散逐步發(fā)育為雄配子體。小液泡逐漸發(fā)育，將細(xì)胞核擠向靠近細(xì)胞壁的位置，稱為單核靠邊期（圖2b）?？拷?xì)胞壁的小孢子有絲分裂形成兩個(gè)大小不一的核（大的為營養(yǎng)核，小的為生殖核），細(xì)胞質(zhì)也被分為大小不等的兩部分（圖2c）。絨氈層為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)，至花粉粒成熟時(shí)逐漸消失（圖2d）。其成熟花粉為2-細(xì)胞型。

圖2 雄配子體形成Fig.2 Formation of male gametophytes

2.1.3 花藥壁發(fā)育 開始發(fā)育至花藥成熟，其花藥壁表皮細(xì)胞從方形變化至扁平，細(xì)胞排列從有序變化至不規(guī)則。隨著花藥壁發(fā)育，藥室內(nèi)壁僅有的一層細(xì)胞逐步延長(zhǎng)加厚成纖維網(wǎng)狀，以幫助花粉釋放。中層細(xì)胞在減數(shù)分裂期間被逐漸吸收解體。絨氈層細(xì)胞起初為單核，細(xì)胞質(zhì)濃，液泡少且小。減數(shù)分裂期間，絨氈層細(xì)胞分裂成二核至多核，呈不規(guī)則松散排列。當(dāng)中層細(xì)胞被吸收分解，絨氈層亦分解，此時(shí)花粉成熟。部分空腔（圖3a）或花粉敗育（圖3b），則是源于該藥囊絨氈層解體過程異常。

圖3 花粉敗育Fig.3 Pollen abortion

2.2 圓齒野鴉椿大孢子發(fā)生與雌配子體形成

2.2.1 大孢子發(fā)生 由圖4 可知，圓齒野鴉椿屬上位子房，3 室，每室3～4 枚橫生胚珠（圖4a），中軸胎座（圖4b）。孢原細(xì)胞位于胚珠頂部表皮下方，其逐漸發(fā)育成核大、質(zhì)濃的大孢子母細(xì)胞（圖4c）；后經(jīng)兩次減數(shù)分裂，形成4個(gè)呈線性排列的子細(xì)胞（圖4d），有少部分呈“田”字形排列（圖4e）。部分大孢子母細(xì)胞高度液泡化，不見核仁，未能進(jìn)行減數(shù)分裂。靠近珠孔端的3個(gè)細(xì)胞退化，遠(yuǎn)離珠孔端的一個(gè)細(xì)胞發(fā)育成單核胚囊，稱之為大孢子（圖4f）。

圖4 大孢子發(fā)生Fig.4 Megasporogenesis

2.2.2 雌配子體形成 大孢子繼續(xù)發(fā)育，核發(fā)生一次分裂形成二核胚囊（圖5a，5b），兩個(gè)核分別在胚囊的兩側(cè)各進(jìn)行有絲分裂，形成四核胚囊（圖5c），再分裂一次形成八核胚囊；與此同時(shí)，細(xì)胞質(zhì)亦發(fā)生分裂形成“七胞八核”成熟胚囊，也稱雌配子體。在雌配子體形成過程中，部分核未能正常分裂形成八核胚囊，從而不能正常受精座果，或未能形成健康種胚，這可能是圓齒野鴉椿種子發(fā)芽率低的主要原因之一。其成熟胚囊為蓼型胚囊。

圖5 雌配子體形成Fig.5 Formation of female gametophytes

2.3 圓齒野鴉椿花粉形態(tài)觀察

由圖可知，花藥、花粉均為金黃色（圖6a）。掃描電鏡下可見花藥囊以及依附在周圍的花粉粒（圖6b）?；ǚ哿Ｆ交ㄉ倭扛砂T）、赤道面觀呈長(zhǎng)球形，有3條萌發(fā)溝（圖6c）。極面觀呈3裂圓形（圖6d），觀察到許多萌發(fā)孔，屬N3P4C5型花粉。

圖6 花粉形態(tài)Fig.6 Pollen morphology

3 結(jié)論與討論

3.1 圓齒野鴉椿小孢子和雄配子體形成特點(diǎn)

3.1.1 絨氈層對(duì)雄配子體形成的影響 從雄蕊開始形成造孢細(xì)胞到形成小孢子母細(xì)胞階段，絨氈層便開始形成營養(yǎng)物質(zhì)。在花粉成熟前，絨氈層起到提供、運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的作用，最后解體消失。關(guān)于絨氈層與花粉發(fā)育異常之間的關(guān)系，據(jù)張鵬飛等[16]觀察小麥發(fā)現(xiàn)，絨氈層提前降解導(dǎo)致營養(yǎng)供給不足，小孢子分裂過程中，細(xì)胞核未能正常分裂，最終花粉敗育。暴會(huì)會(huì)等[17]開展番茄花粉敗育雄性不育研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，絨氈層細(xì)胞提前或推遲進(jìn)行細(xì)胞程序性死亡降解為小孢子提供營養(yǎng)物質(zhì)，都會(huì)對(duì)雄配子體形成產(chǎn)生影響，DYT1－TDF1－AMS－MS188－MS1 轉(zhuǎn)錄因子形成遺傳途徑控制絨氈層的發(fā)育。張江江等[18]進(jìn)行雄性不育中花粉壁研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，絨氈層降解異常會(huì)導(dǎo)致雄性不育的根本原因是因?yàn)槠鋾?huì)對(duì)花粉壁的形成產(chǎn)生影響。EMSI編碼存在亮氨酸受體蛋白激酶（LRR-RPK），與絨氈層的發(fā)育有關(guān)，說明EMSI與花粉壁的發(fā)育有關(guān)。王馨等[19]在觀察檫木雌雄配子體發(fā)育時(shí)，認(rèn)為如果花粉在絨氈層運(yùn)輸、提供營養(yǎng)物質(zhì)之前就已經(jīng)發(fā)育異常，則絨氈層就不用提供營養(yǎng)物質(zhì)，也就不會(huì)出現(xiàn)解體消失?；ǚ郯l(fā)育異常發(fā)生在形成造孢細(xì)胞之前，絨氈層也就無需發(fā)揮其作用，花粉敗育與之無關(guān)。本研究中，圓齒野鴉椿雄蕊原基分化開始細(xì)胞未出現(xiàn)異常；花粉發(fā)育后期，部分絨氈層未解體退化，且花粉出現(xiàn)解體空腔可能與之有關(guān)。絨氈層解體異常對(duì)小孢子發(fā)育產(chǎn)生的影響有待進(jìn)一步研究。

3.1.2 花粉敗育現(xiàn)象 張鵬飛等[20]研究發(fā)現(xiàn)花粉敗育與很多因素有關(guān)；呼吸作用中發(fā)揮作用的線粒體出現(xiàn)異常會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡；過氧化物酶活性異常與影響蛋白合成之間的關(guān)系；多糖、脂類以及蛋白質(zhì)的異常積累和表達(dá)對(duì)小孢子的育性產(chǎn)生不良的影響。王馨等[21]研究認(rèn)為檫木在減數(shù)分裂時(shí)期，小孢子染色體（染色質(zhì)）分布不均導(dǎo)致花粉空腔，究其原因應(yīng)該與相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。本研究中，圓齒野鴉椿僅出現(xiàn)部分花粉?？涨?，整體對(duì)受精結(jié)實(shí)影響不大，空腔花粉形成的具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 圓齒野鴉椿大孢子和雌配子體形成特點(diǎn)

3.2.1 胚囊敗育現(xiàn)象 張小方[22]研究表明，文冠果大孢子減數(shù)分裂未能形成功能大孢子，4 個(gè)細(xì)胞均退化出現(xiàn)空囊是胚囊敗育的主要原因。圓齒野鴉椿在形成功能大孢子時(shí)，因細(xì)胞核退化出現(xiàn)空囊現(xiàn)象與上述情況類似，可能與大孢子細(xì)胞內(nèi)染色體分裂不均有關(guān)。樊麗莉等[23]研究楸樹發(fā)現(xiàn)，胚珠發(fā)育需要大量營養(yǎng)，胚囊敗育情況大多在二核向八核分裂的時(shí)期。出現(xiàn)敗育情況可能是營養(yǎng)分配不均，植物為保全大局而做出的選擇。左亞君等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)，粗柄獨(dú)尾草在二核胚囊向八核胚囊發(fā)育時(shí)，亦出現(xiàn)胚囊敗育現(xiàn)象。張超越等[26]在西瓜胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，由于養(yǎng)分有限，晚發(fā)生的胚珠會(huì)選擇敗育以保證先發(fā)生的胚珠正常發(fā)育受精。張愛勤等[27]研究發(fā)現(xiàn)，豆科植物也經(jīng)常出現(xiàn)選擇性敗育，物質(zhì)資源有限，需確保最大繁殖效率。陳利娜等[28]研究表明，雌蕊敗育受珠被和胚囊發(fā)育、花柱結(jié)構(gòu)以及整個(gè)雌蕊分化過程影響。本研究中，圓齒野鴉椿在花芽分化過程中需要大量營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)供應(yīng)不足亦可導(dǎo)致胚囊敗育，具體原因需進(jìn)一步探究。

3.2.2 圓齒野鴉椿落花落果的原因 桂明珠等[29]研究發(fā)現(xiàn)，雌雄配子體敗育以及植物體內(nèi)有限營養(yǎng)資源的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)導(dǎo)致落花落果。許培磊等[30]研究認(rèn)為，果樹的品種特性、雌雄配子體發(fā)育、植物體內(nèi)源激素變化以及外部天氣、營養(yǎng)條件等都會(huì)使果樹出現(xiàn)落花落果的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，圓齒野鴉椿出現(xiàn)部分雌雄配子體敗育現(xiàn)象；二核胚囊階段以后，可見卵細(xì)胞部分缺失助細(xì)胞，受精后未能形成正常種胚；此外，圓齒野鴉椿冬芽多為混合芽，春季葉芽與花芽同時(shí)分化，且花量大，花芽分化持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（3 個(gè)月左右），需消耗大量營養(yǎng)，故出現(xiàn)營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)；這些情況可能導(dǎo)致該樹種落花落果。因此，圓齒野鴉椿養(yǎng)護(hù)過程中，應(yīng)及時(shí)施肥，尤其應(yīng)該重視基肥的應(yīng)用，以確保春季萌芽時(shí)養(yǎng)分供應(yīng)充足，以提高坐果率。

3.3 結(jié)論

雄配子體形成過程中，存在部分?jǐn)∮F(xiàn)象，包括花粉?？涨弧⒔q氈層降解異常。雌配子體形成過程中，存在功能大孢子退化、二核至八核分裂時(shí)期出現(xiàn)異常，未能正常分裂形成八核胚囊，從而不能正常受精座果或不能形成健康種胚。該研究解釋了圓齒野鴉椿空籽率高、種子發(fā)芽率低的原因，為解決花粉不育、受精不親和，胚胎敗育等問題提供理論依據(jù)。