髖關(guān)節(jié)脫位法聯(lián)合液氮冷凍法建立兔早中期創(chuàng)傷性股骨頭壞死動(dòng)物模型觀察

王禛， 王上增， 余鵬， 游明燦

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州 450046；2.河南省中醫(yī)院，河南鄭州 450002；3.上海市第二康復(fù)醫(yī)院，上海 201900；4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450052）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head）是靜脈堵塞或股骨頭血供的損壞或中斷，最終導(dǎo)致股骨頭細(xì)胞死亡，甚至股骨頭塌陷的病理生理過程[1-2]，與髖關(guān)節(jié)局部的骨、脂肪代謝等因素密切相關(guān)，多為股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of the femoral head）或者是股骨頭無菌性壞死（aseptic necrosis of the femoral head），治療難度較大，發(fā)病率逐年上升，且致殘率較高。目前，股骨頭壞死病因仍未完全明確，尚缺少有效的治療方法。對(duì)于晚期股骨頭壞死患者，骨壞死區(qū)域塌陷或骨折時(shí)，需要采取髖關(guān)節(jié)置換的手術(shù)方式來獲得更好的療效[3]。除卻病因、疾病進(jìn)展過程復(fù)雜之外，本病也缺乏理想化的動(dòng)物模型。因此，建立合適的股骨頭壞死動(dòng)物模型，對(duì)于進(jìn)一步研究股骨頭壞死的合理治療方案具有重要意義，本研究采用髖關(guān)節(jié)脫位聯(lián)合液氮冷凍法建立兔創(chuàng)傷性股骨頭壞死模型，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)4個(gè)月齡雄性日本大耳白兔28只，體質(zhì)量2.0~2.5 kg，購于河南康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（豫）2016-0002。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，分籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水，室溫為20~26℃。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作方案已經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審議批準(zhǔn)[IACUC號(hào)：20161201]，實(shí)驗(yàn)過程中遵循“3R”原則。

1.2 藥物、試劑與儀器烏拉坦溶液、注射用水合氯醛、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑（北京索萊寶科技有限公司）；青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）；多聚甲醛溶液（常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。5605-IECX射線機(jī)（德國西門子公司）；3.0T Singna HDxt核磁共振（MRI）（美國GE公司）；BH-2光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 兔創(chuàng)傷性股骨頭壞死模型的制備

1.3.1 造模前準(zhǔn)備適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無異常即可開始實(shí)驗(yàn)。所有兔均選擇右側(cè)髖關(guān)節(jié)進(jìn)行模型制備。用蒸餾水配制20%的烏拉坦溶液對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，正式制備模型前給所有兔稱質(zhì)量，每只兔麻醉劑量為5 mL/kg（可視具體情況增加1~2 mL），麻醉方式為耳緣靜脈麻醉。

1.3.2 模型制備麻醉成功后，將兔側(cè)臥位固定在操作臺(tái)上，備皮。確定切口，暴露股骨頭，尋找體表骨性標(biāo)志，確定股骨大轉(zhuǎn)子。沿股骨大轉(zhuǎn)子內(nèi)側(cè)緣行長約5 cm的弧形手術(shù)切口，切開皮膚后，剝離淺筋膜，剝離深筋膜，暴露臀大肌后使用彎鉗鈍性分離臀大肌，顯露并撥開臀中肌，顯露臀小肌與梨狀肌，顯露股骨大轉(zhuǎn)子。沿大轉(zhuǎn)子切斷部分梨狀肌肌肉附著，暴露髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊，“T”形切開關(guān)節(jié)囊，內(nèi)收內(nèi)旋右下肢。暴露股骨頭，切斷股骨頭圓韌帶，脫位股骨頭，并將股骨頸近端骨膜組織全部切除。

1.3.3 液氮冷凍固定股骨頭，使用一次性無菌棉簽蘸取液氮置于股骨頭負(fù)重區(qū)，大約停留8 s后撤離，冷凍后使用溫生理鹽水（約40℃）對(duì)局部復(fù)溫。如此反復(fù)操作3次后，使用生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，使用可吸收縫合線依次縫合肌肉、深筋膜、淺筋膜及皮膚?？p合完畢后使用碘伏紗布消毒，消毒后無菌敷料加壓包扎。

1.3.4 造模后處理造模后當(dāng)天即開始使用20萬IU青霉素鈉肌肉注射預(yù)防術(shù)后感染，持續(xù)使用5 d。造模后定期對(duì)手術(shù)切口進(jìn)行清潔換藥，2 d/次。換藥時(shí)密切觀察切口愈合情況，直至切口愈合。最終成功造模兔25只。造模后4、8周分別處死12、13只兔。定期觀察造模后兔精神狀態(tài)、活動(dòng)、二便等一般情況。

1.4 兔股骨頭壞死模型評(píng)價(jià)指標(biāo)與方法

1.4.1 影像學(xué)觀察造模后4、8周分別對(duì)兔進(jìn)行X線攝片觀察股骨頭情況；造模后4、8周分別進(jìn)行兔雙髖關(guān)節(jié)MRI檢查觀察雙側(cè)股骨頭情況。

1.4.2 組織學(xué)觀察使用空氣栓塞法分批處死兔，無菌條件下手術(shù)取出右側(cè)股骨頭，置入40 g/L多聚甲醛溶液中固定浸泡24 h后放入EDAT脫鈣液中進(jìn)行脫鈣。脫鈣成功后，用石蠟切片機(jī)對(duì)包埋后的股骨頭組織標(biāo)本進(jìn)行切片。對(duì)切片進(jìn)行脫蠟和HE染色。最后，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察腦組織病理形態(tài)，計(jì)算空骨陷窩率，計(jì)算方法：鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，空骨陷窩率=空骨陷窩總計(jì)數(shù)/骨陷窩總計(jì)數(shù)。以術(shù)后造模側(cè)股骨頭組織學(xué)表現(xiàn)可見軟骨剝脫、鏡下觀察到空骨陷窩率增加為判斷造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 造模動(dòng)物一般情況造模過程中因麻醉劑過量致兔死亡2只，因手術(shù)時(shí)間較長致兔死亡1只，余存活良好。無感染動(dòng)物病例。造模后2周內(nèi)，兔精神狀態(tài)較術(shù)前萎靡，日常活動(dòng)減少，不活躍，飲食量較術(shù)前減少，體質(zhì)量減輕，二便正常。造模2周后，一般情況較前好轉(zhuǎn)，但較術(shù)前仍欠佳。觀察可得，兔在被抓取時(shí)有明顯的懼怕感。造模4周時(shí)，造模兔有不同程度的跛行，患肢力量減弱，彈跳無力。造模后8周，造模兔無法彈跳，跛行較前加重，患肢力量明顯減弱。

2.2 造模后兔股骨頭X線表現(xiàn)圖1結(jié)果顯示：造模后4周，患側(cè)股骨頭表面光整，股骨頭彌漫性骨質(zhì)疏松，骨小梁稍模糊，出現(xiàn)局限性骨密度增高，骨質(zhì)硬化，股骨頭周圍骨質(zhì)變薄。造模后8周，患側(cè)間隙未見明顯變窄，股骨頭輕度變形，股骨頭形態(tài)尚可，股骨頭密度不均勻，可見囊性破壞，股骨頸增寬，髖臼邊緣增生。

圖1 造模后兔股骨頭X線檢查表現(xiàn)Figure 1 X-ray performance of rabbit femoral head after modeling

2.3 造模后MRI情況圖2結(jié)果顯示：造模后4周，雙側(cè)髖關(guān)節(jié)形態(tài)可，右側(cè)股骨頭負(fù)重區(qū)軟骨變薄，可見稍長T1長T2信號(hào)，右側(cè)髖關(guān)節(jié)間隙可見少量條片狀液體信號(hào)影。造模后8周，雙側(cè)髖關(guān)節(jié)形態(tài)尚可，右側(cè)股骨頭負(fù)重區(qū)可見表面軟骨脫落，可見稍長T1長T2信號(hào)。

圖2 造模后兔股骨頭MRI檢查情況Figure 2 MRIperformance of rabbit femoral head after modeling

2.4 股骨頭組織學(xué)觀察圖3結(jié)果顯示：造模后4周，光鏡下可見骨小梁稀疏、排列紊亂，骨小梁變細(xì)、部分破裂，呈不規(guī)則現(xiàn)象，骨陷窩空虛，骨細(xì)胞減少，造血細(xì)胞減少，骨小梁周圍骨細(xì)胞減少。造模后8周，光鏡下可見骨小梁間隙變大，骨小梁破壞嚴(yán)重，壞死區(qū)空骨陷窩明顯增多，骨小梁間骨髓組織脂肪細(xì)胞增多，可見部分壞死骨細(xì)胞，骨細(xì)胞核固縮、碎裂，骨小梁周圍成骨細(xì)胞稀少甚至消失。

圖3 造模后兔股骨頭組織學(xué)圖像（HE染色，×200）Figure 3 Histological features of rabbit femoral head after modeling（by HE staining，×200）

造模后8周組織學(xué)發(fā)現(xiàn)空骨陷窩率增加，為8%~12%，超過正常兔股骨頭軟骨下區(qū)空骨陷窩率，符合達(dá)到股骨頭壞死的標(biāo)準(zhǔn)，提示造模成功。具體結(jié)果見表1。

表1 造模后兔股骨頭組織空骨陷窩率Table 1 The rate of empty osseous lacunae in the femoral head after rabbit modeling （±s，%）

表1 造模后兔股骨頭組織空骨陷窩率Table 1 The rate of empty osseous lacunae in the femoral head after rabbit modeling （±s，%）

時(shí)間造模后4周造模后8周兔數(shù)（只）12 13空骨陷窩率8.09±3.04 11.85±1.49

3 討論

股骨頭壞死在臨床中是造成患者疼痛，甚至殘疾的重要病因，嚴(yán)重影響了患者的生產(chǎn)能力和活動(dòng)能力[4]。對(duì)于股骨頭壞死動(dòng)物模型的制備，主要以激素型股骨頭壞死、乙醇攝入型股骨頭壞死和創(chuàng)傷性股骨頭壞死為主。目前，激素型、乙醇攝入型股骨頭壞死動(dòng)物模型制備技術(shù)都相對(duì)成熟，激素型股骨頭壞死動(dòng)物模型的制備方法主要有單一激素使用、激素聯(lián)合內(nèi)毒素或動(dòng)物血清等方法。酒精性股骨頭壞死動(dòng)物模型的制備方法主要為局部酒精注射方式。創(chuàng)傷性股骨頭壞死近年來在臨床也較多見，其動(dòng)物模型制備方法主要有外科手術(shù)下頭頸部血管結(jié)扎、破壞髓內(nèi)外血供、股骨頸骨折、物理誘導(dǎo)等方式。曲春濤[5]利用導(dǎo)航裝置鉆孔后對(duì)鴯鹋行液氮冷凍和射頻加熱交替的方法處理從而獲得創(chuàng)傷性股骨頭壞死動(dòng)物模型，但是，制作導(dǎo)航裝置會(huì)增加實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，加大實(shí)驗(yàn)負(fù)擔(dān)。Vélez等[6]、Swiontkowski等[7]通過血管結(jié)扎、股骨頸骨折等方法來獲得股骨頭壞死模型，這都需要外科手術(shù)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，學(xué)習(xí)曲線較長，加大實(shí)驗(yàn)難度，且每個(gè)人手術(shù)技術(shù)有差異，重復(fù)性一般。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同周期冷凍方法直接影響股骨頭壞死造模效果。液氮冷凍股骨頭壞死具有造模周期短、動(dòng)物死亡率低的優(yōu)點(diǎn)，因而成為相對(duì)較常采用的創(chuàng)傷性股骨頭壞死造模方法。本實(shí)驗(yàn)方法通過髖關(guān)節(jié)脫位聯(lián)合液氮冷凍股骨頭的造模方法較王江泳等[9]、楊述華等[10]的實(shí)驗(yàn)方法造模成功率高，且更早出現(xiàn)股骨頭壞死；與周正麗[11]的造模方法比較，因加入了兔髖關(guān)節(jié)MRI對(duì)造模結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)方法更加客觀多樣，更具參考性。

本實(shí)驗(yàn)在參照Wen等[12]以及李玉龍[13]的造模方法基礎(chǔ)上，結(jié)合髖關(guān)節(jié)脫位法制備兔創(chuàng)傷性股骨頭壞死動(dòng)物模型，術(shù)中切斷了兔股骨頭圓韌帶、脫位股骨頭后，使用液氮冷凍法直接冷凍股骨頭表面，冷凍位置更加精確；再使用溫生理鹽水對(duì)其進(jìn)行復(fù)溫，可以很好地?fù)p傷股骨頭，有效縮短股骨頭壞死的疾病進(jìn)程，同時(shí)，縮短造模手術(shù)時(shí)長，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)周期。此造模方法雖不能模擬創(chuàng)傷性股骨頭壞死疾病的發(fā)病進(jìn)程，無法進(jìn)行創(chuàng)傷性股骨頭壞死病因?qū)W的研究，但對(duì)于后續(xù)臨床治療性研究以及對(duì)比不同治療方式療效，可以起到很大的作用。

術(shù)后4周X線片顯示，患側(cè)股骨頭表面光整，可見股骨頭彌漫性骨質(zhì)疏松，骨小梁稍模糊，出現(xiàn)局限性骨密度增高，骨質(zhì)硬化，股骨頭周圍可見骨質(zhì)變薄。拍攝MRI結(jié)果顯示：雙側(cè)髖關(guān)節(jié)形態(tài)可，右側(cè)股骨頭負(fù)重區(qū)軟骨變薄，可見稍長T1長T2信號(hào)，右側(cè)髖關(guān)節(jié)間隙可見少量條片狀液體信號(hào)影。組織學(xué)顯示：骨小梁稀疏、排列紊亂，骨小梁變細(xì)、部分破裂，呈不規(guī)則現(xiàn)象，骨陷窩空虛，骨細(xì)胞減少，造血細(xì)胞減少，骨小梁周圍骨細(xì)胞減少；造模術(shù)后4周造模側(cè)股骨頭骨質(zhì)輕度破壞，局部周圍組織發(fā)生水腫，但MRI檢查未顯示發(fā)生壞死。光鏡下觀察組織學(xué)特點(diǎn)，可見骨小梁變細(xì)、部分破裂，說明經(jīng)過液氮處理的股骨頭局部骨組織被破壞，但并未出現(xiàn)壞死。

術(shù)后8周X線片可見，患側(cè)間隙未見明顯變窄，股骨頭輕度變形，股骨頭形態(tài)尚可，股骨頭密度不均勻，可見囊性破壞，股骨頸增寬，髖臼邊緣增生。拍攝MRI結(jié)果顯示：右側(cè)股骨頭負(fù)重區(qū)可見表面軟骨脫落，可見稍長T1長T2信號(hào)。組織學(xué)顯示：骨小梁間隙變大，骨小梁破壞嚴(yán)重，壞死區(qū)空骨陷窩明顯增多，骨小梁間骨髓組織脂肪細(xì)胞增多，可見部分壞死骨細(xì)胞，骨細(xì)胞核固縮、碎裂，骨小梁周圍成骨細(xì)胞稀少甚至消失。股骨頭壞死包括了骨頭內(nèi)部的病理改變，這些改變?cè)贛RI信號(hào)出現(xiàn)前就已存在，目前，MRI檢查在臨床早期發(fā)現(xiàn)診斷股骨頭壞死中較敏感[14]。本實(shí)驗(yàn)X線攝片及MRI檢查可發(fā)現(xiàn)造模側(cè)關(guān)節(jié)出現(xiàn)股骨頭壞死早期表現(xiàn)，如軟骨脫落、股骨頭形態(tài)變化、局部骨組織密度變化不均等。組織學(xué)觀察則更為直觀，造模術(shù)后第8周組織學(xué)的表現(xiàn)符合股骨頭壞死診斷。通過影像學(xué)和組織學(xué)觀察后發(fā)現(xiàn)此方法對(duì)于創(chuàng)傷性股骨頭壞死動(dòng)物模型制備較為合適。

在選擇合適的動(dòng)物模型及造模方式時(shí)，所選擇的動(dòng)物應(yīng)易于喂養(yǎng)，造模方法應(yīng)難度較低，整體可重復(fù)性好。已有選擇鴯鹋作為實(shí)驗(yàn)造模動(dòng)物[15]，該雙足動(dòng)物在下肢負(fù)重、負(fù)重質(zhì)量上和人類有更高的相似度，相對(duì)來說可以更好地模擬人類雙足活動(dòng)的特點(diǎn)，但因其價(jià)格昂貴、飼養(yǎng)困難，且對(duì)較大體積的動(dòng)物進(jìn)行造模操作時(shí)難度較大，故不作為實(shí)驗(yàn)造模動(dòng)物的首選。兔為四足動(dòng)物，其繁殖力強(qiáng)、易于獲得、飼養(yǎng)簡單，較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物犬等價(jià)格低廉[4，16]，且臨床早中期股骨頭壞死患者診斷明確之后需減少負(fù)重，兔為四足動(dòng)物，后肢負(fù)重較少，也利于研究股骨頭壞死的后續(xù)治療方法及療效[17]，是目前研究的較好選擇。但此動(dòng)物模型制備方法在模擬股骨頭壞死疾病發(fā)生發(fā)展方面還存在不足，家兔與人的股骨近端形態(tài)學(xué)、血管分布等都有一定的差異，兔股骨頭更小、股骨頸更短，頸干角較人類小，且兔股骨頭頸結(jié)合部骨小梁分布相對(duì)疏松，以及股骨頸干交界處無骨小梁分布，更有利于滋養(yǎng)動(dòng)脈穿過從而到達(dá)股骨頭，更有利于股骨頭缺血性壞死的修復(fù)等，這些與人類有較大差異。目前，我們尚未尋找到完美的模型動(dòng)物，這也就需要在以后的研究中尋找更為合適、更為接近人類解剖結(jié)構(gòu)的動(dòng)物模型進(jìn)行研究[18]。

綜上所述，本研究通過使用液氮冷凍法聯(lián)合髖關(guān)節(jié)脫位法制備兔股骨頭壞死模型，操作簡單，造價(jià)低廉，可重復(fù)性好，動(dòng)物死亡率低，對(duì)于后續(xù)臨床治療性研究以及對(duì)比不同治療方式治療創(chuàng)傷性股骨頭壞死療效可以起到支撐作用。但本實(shí)驗(yàn)中尚存在一定的不足：①未設(shè)置對(duì)照組，只研究了單種造模方法，未直接與其他造模方法進(jìn)行直觀比較；②模型評(píng)價(jià)未使用CT、骨掃描等技術(shù)進(jìn)一步豐富實(shí)驗(yàn)資料；③模型適用于早中期股骨頭壞死治療的研究，可以相應(yīng)縮短總體研究時(shí)長，但未能增加時(shí)間序列，觀察股骨頭壞死的早期修復(fù)過程。以上均有待下一步研究完善。