基于穩(wěn)定同位素比值的陽春砂產(chǎn)地判別分析

鐘慧怡， 黃海波， 陳玉娥， 覃挺紅

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

陽春砂為姜科植物Amomum villosumLour.的干燥成熟果實(shí)，味辛、性溫，歸脾、胃、腎經(jīng)，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎等功效，臨床上多用于濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒等證[1]，是治療胃腸疾病的常用藥，為“香砂六君丸”“香砂理中丸”等著名中成藥的組方原料[2]。陽春砂主要產(chǎn)于廣東省陽春市，近年來產(chǎn)區(qū)逐漸由陽春及其周邊變遷到廣西南寧、百色、崇左及云南西雙版納、紅河等地。由于引種產(chǎn)地具有適宜的環(huán)境氣候和較為成熟的種植技術(shù)，陽春砂得到了大規(guī)模的種植。但不同產(chǎn)地的陽春砂在化學(xué)成分和藥理作用上有所差別（道地產(chǎn)地的質(zhì)量較優(yōu)），且其市場價(jià)格差距較大，以次充好的現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生，造成了陽春砂商品來源復(fù)雜混亂的現(xiàn)狀[3]，因此，為保護(hù)藥材道地性、提升消費(fèi)者信心，有必要對陽春砂進(jìn)行產(chǎn)地溯源。目前，常用的溯源技術(shù)主要有高效液相色譜法、氣相色譜法以及穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜法等，其中，穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜法是近年來逐步發(fā)展的一種新型溯源技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)如中藥材[4-7]、稻米[8]、茶葉[9]、果蔬類[10-11]等的產(chǎn)地溯源，具有無污染、高精密度、高準(zhǔn)確度等優(yōu)點(diǎn)。既往有研究發(fā)現(xiàn)：不同產(chǎn)地何首烏的穩(wěn)定同位素比值具有明顯的地域分布特征，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可有效對何首烏進(jìn)行產(chǎn)地溯源[5]；利用碳、氮穩(wěn)定同位素對青海、云南、四川以及尼泊爾等12個(gè)產(chǎn)地的冬蟲夏草樣品進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的樣品之間δ15N差異較大，可以利用δ15N比值對大多數(shù)樣品的產(chǎn)地來源進(jìn)行有效的區(qū)分[7]；不同產(chǎn)地的茶葉中穩(wěn)定同位素δ15N、δ13C、δD和δ18O的數(shù)值范圍也不同，表現(xiàn)出一定的地域特征[9]。本研究采用穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜法檢測，結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）與線性判別分析方法（LDA）建立陽春砂產(chǎn)地判別模型，初步對廣東、廣西及云南產(chǎn)的陽春砂進(jìn)行產(chǎn)地溯源和判別，探討用于陽春砂產(chǎn)地溯源和地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)的可行性，以期為陽春砂的道地性保護(hù)提供借鑒和技術(shù)支持。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料陽春砂樣品主要采集于廣東、廣西和云南3省，購于當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院黃海波副教授鑒定為姜科植物陽春砂（AmomumvillosumLour.），總樣品量為39個(gè)。收集的干果用密封袋封裝，置于4℃冰箱冷藏保存。樣品產(chǎn)地信息見表1、圖1。

圖1 陽春砂樣品采集地點(diǎn)Figure 1 The locations of collecting Amomum villosum samples

表1 陽春砂樣品產(chǎn)地信息表Table 1 The information of Amomum villosum habitats

1.2 陽春砂樣品的測定

1.2.1 碳、氮穩(wěn)定同位素比值的測定稱取5 g制備好的樣品包入錫囊，排盡空氣，放入元素分析儀的固體進(jìn)樣器依次進(jìn)樣。樣品在高溫的過氧環(huán)境下瞬間燃燒，燃燒產(chǎn)生的氣體被氦載氣流帶入并通過氧化還原反應(yīng)管，氣體在高純氦氣的運(yùn)載下經(jīng)還原轉(zhuǎn)化成CO2（N2），隨后氣體通過色譜柱將CO2和N2氣體分開后進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子源進(jìn)行電離，形成的離子束經(jīng)磁分析器將不同質(zhì)荷比的離子完全分離，最后進(jìn)入到檢測器進(jìn)行分析和測定。測定結(jié)果用單點(diǎn)校正法計(jì)算。

元素分析儀測定：氧化爐溫度1 020℃，還原爐溫度680℃，載氣流速90～100 mL·min-1，注氧時(shí)間3 s，吹掃流量180 mL·min-1。

1.2.2 氫穩(wěn)定同位素比值的測定稱取適量的樣品于錫杯中并將其放置于90℃的烘箱內(nèi)干燥12 h，以去除樣品表面的吸附。再將烘烤后的樣品置于高溫裂解爐中進(jìn)行裂解反應(yīng)，礦物包體水、含羥基的單礦物或有機(jī)物在裂解釋放后與玻璃碳瞬間反應(yīng)生成H2，被高純氦氣攜載經(jīng)過色譜柱進(jìn)入同位素質(zhì)譜儀，測定H2的同位素比值δD。測定結(jié)果用單點(diǎn)校正法計(jì)算。

元素分析儀測定：爐溫1 380℃，載氣流速150 mL·min-1，吹掃流量200 mL·min-1。色譜柱溫50℃。

2 測定結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

2.1 計(jì)算方法與數(shù)據(jù)處理重同位素豐度與輕同位素豐度之比用同位素比值R表示，樣品R值與國家標(biāo)準(zhǔn)物R值的比較用δ來表示，即δ13C、δ15N、δD，用該值代表樣品的同位素比值，計(jì)算公式：δ（‰）=（R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)-1）×1 000。

應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件對不同產(chǎn)地的陽春砂樣品3種穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行差異分析及線性判別分析。利用SIMCA-P Version 14.1軟件（瑞典Umetrics AB公司）進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析。

2.2 陽春砂C、N、H穩(wěn)定同位素比值差異分析陽春砂樣品中δ13C、δ15N及δD的含量測定結(jié)果見表2，利用K-W檢驗(yàn)不同組間的同位素比值是否有差異。從表3得知，不同省份之間的δ13C和δD有顯著性差異（P＜0.01），表明3個(gè)省份陽春砂的同位素比值有差異，能夠?yàn)楹罄m(xù)產(chǎn)地判別的可行性提供依據(jù)。所測得的39份陽春砂中的δ13C值在-31.41‰～-25.44‰之間，根據(jù)均值大小排列依次是云南＞廣東＞廣西；3個(gè)省份的δ15N值在-2.61‰～2.93‰之間，按大小排列依次是云南＞廣西＞廣東。其比值相差不大，說明不同省份陽春砂的生長環(huán)境及施肥方式等因素不足以造成氮同位素比值的顯著性差異。降水影響著氫同位素的組成，距海越近，雨水及地下水中D含量越大。所測得的樣品δD值在-68.76‰～-45.64‰之間，不同省份之間δD值差異較大，按大小排列依次是廣東＞廣西＞云南。

表2 陽春砂樣品C、N、H穩(wěn)定同位素測定結(jié)果Table 2 Determination results of C，N，H stable isotopes of Amomum villosum

表3 K-W檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistical results of K-W test

進(jìn)一步選取樣品數(shù)較多、具有地域代表性的產(chǎn)地進(jìn)行分組，分別是廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個(gè)產(chǎn)地樣品的δ13C、δ15N、δD比值進(jìn)行差異分析。4個(gè)代表產(chǎn)區(qū)的陽春砂δ13C值介于-31.35‰～-25.94‰之間，崇左相對貧化，文山相對富集。δ15N值介于-1.02‰～2.93‰之間，崇左相對貧化，西雙版納相對富集。δD值則介于-68.76‰～-45.64‰之間，西雙版納相對貧化，陽春相對富集。具體結(jié)果見表4~5。

表4 3個(gè)省份陽春砂樣品C、N、H穩(wěn)定同位素描述統(tǒng)計(jì)表Table 4 Description of statistics of C，N，H stable isotopes of Amomum villosum from 3 provinces

2.3 正交偏最小二乘法判別分析觀察表2~5數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)3個(gè)省份的陽春砂樣品中δ13C、δ15N、δD的含量比值存在一定的差異。為了使分析結(jié)果更加直觀可靠，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用有監(jiān)督性分析OPLS-DA，可減少組內(nèi)差異，篩選造成分類的差異變量。為了幫助選擇貢獻(xiàn)較大的差異組分，變量權(quán)重重要性排序（variable importancein projection，VIP）值被作為多維模型差異元素選擇的指標(biāo)[12]。VIP值越大，該成分在不同省份的陽春砂樣品中的差異越顯著。按照經(jīng)驗(yàn)值，VIP值大于1的組分即為多維模型的貢獻(xiàn)變量，其中，VIP值大于1.5的組分可被標(biāo)記為非常顯著的貢獻(xiàn)變量。

將樣品按省份分為廣東、廣西和云南3組，利用δ13C、δ15N、δD這3個(gè)同位素比值進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析，OPLS-DA得分見圖2。廣東與云南的樣品得到較好的分離，但廣西有部分樣品與廣東、云南均有重疊，不能較好地分離。3個(gè)省份樣品的同位素VIP值見表6，VIP值大于1的組分共2種，δD、δ13C為貢獻(xiàn)變量，其中δD標(biāo)記為非常顯著的貢獻(xiàn)變量，說明這2個(gè)同位素在樣品分類中起著關(guān)鍵作用。

圖2 廣東、廣西、云南陽春砂樣品的同位素OPLS-DA得分圖Figure 2 OPLS-DA scores of Amomum villosum from Guangdong，Guangxi and Yunnan

表5 4個(gè)代表產(chǎn)區(qū)的陽春砂樣品C、N、H穩(wěn)定同位素描述統(tǒng)計(jì)表Table 5 Description of statistics of C，N，H stable isotopes of Amomum villosum from 4 representative habitats

再選取廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個(gè)產(chǎn)地樣品的δ13C、δ15N、δD比值進(jìn)行OPLS-DA分析，得分見圖3。由圖可知：文山的樣品得到較好的分離，樣品間的距離?。魂柎旱臉悠芬不镜玫椒蛛x，但各樣品間的距離較大；而崇左和西雙版納的分離效果較差，崇左的部分樣品落在陽春和西雙版納的范圍內(nèi)，西雙版納的樣品分布位置較散，有部分樣品與文山歸為一類。4個(gè)產(chǎn)地樣品的同位素VIP值見表6，貢獻(xiàn)變量同樣為δD、δ13C，且均被標(biāo)記為極顯著的貢獻(xiàn)變量。

表6 陽春砂樣品的同位素VIP值Table 6 The VIP values of Amomum villosum samples

圖3 陽春、崇左、西雙版納、文山陽春砂樣品的同位素OPLS-DA得分圖Figure 3 OPLS-DA scores of Amomum villosum from Yangchun，Chongzuo，Xishuangbanna and Wenshan

2.4 基于線性判別分析方法的陽春砂產(chǎn)地區(qū)分模型通過OPLS-DA篩選出具有顯著差異性的同位素δ13C、δD，利用這2個(gè)同位素比值進(jìn)行線性判別分析，判別結(jié)果顯示產(chǎn)地回判的正確率有76.9%，分類結(jié)果見表7。有30.0%的廣東樣品被錯(cuò)誤地歸類到廣西，16.6%的廣西樣品也被誤歸到廣東。由于云南的地理位置與廣東差距較大，兩省份的樣品無相互錯(cuò)判的情況，分類效果較好。但云南與廣西位置相鄰，有11.8%的云南樣品被錯(cuò)誤歸類到廣西，16.7%的廣西樣品也被錯(cuò)誤歸類到云南。再針對廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個(gè)產(chǎn)地進(jìn)行判別，回判正確率89.7%，說明此模型比較適于陽春砂產(chǎn)地溯源。分類結(jié)果見表8。

表7 廣東、廣西、云南3個(gè)省份陽春砂樣品穩(wěn)定同位素判別結(jié)果Table 7 Discrimination results of the stable isotopes of Amomum villosum from Guangdong，Guangxi and Yunnan

表8 陽春、崇左、西雙版納、文山4個(gè)產(chǎn)地陽春砂樣品穩(wěn)定同位素判別結(jié)果Table 8 Discrimination results of stable isotopes of Amomum villosum from Yangchun，Chongzuo，Xishuangbanna and Wenshan

3 討論

由于不同地域的氣候、降水、地質(zhì)、土壤以及人為等因素的不同，導(dǎo)致生長在地理位置差距大的同種植物的同位素豐度出現(xiàn)一定的差異。植物體內(nèi)對氮素的固化、同化、吸收和排除過程影響著氮同位素的分餾作用。因此，植物的生長環(huán)境和施肥方式等都可能導(dǎo)致氮同位素比值的變化，尤其是施肥方式對氮素的影響較為顯著[13-15]。但不同產(chǎn)地陽春砂δ15N的變化范圍較小，其比值相差不大，地域特征不明顯。說明不同省份陽春砂的生長環(huán)境及施肥方式等因素不足以造成氮同位素比值的顯著性差異。而δD、δ13C的變化范圍較大，有一定的差異性和地域特征（P＜0.01）。植物體內(nèi)C同位素的組成主要與其固定CO2的方式，即光合作用途徑（C3、C4、CAM）有關(guān)，同一物種固定CO2的方式相同且13C在固定范圍內(nèi)，但氣溫、降水及大氣中CO2濃度等影響因素可能會(huì)造成δ13C比值的差異，通常與13C呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[15]。觀察表4、5數(shù)據(jù)，根據(jù)δ13C均值大小排列依次是云南＞廣東＞廣西，其中，廣西崇左相對貧化，云南文山相對富集，可能與云南陽春砂生長環(huán)境中的氣溫、降水量低于其他2個(gè)省份的原因有關(guān)。云南各產(chǎn)地的氣溫在16.3～20.5℃之間，廣東與廣西的氣溫較接近，均在21.2～22.6℃范圍內(nèi)。云南的年平均降水量為779.0～2 026.5 mm，廣西為1 000.0～1304.2 mm，而廣東的降水量相對較高，在1 650.0～2 116.0 mm之間。降水也影響著氫同位素的組成，通常為正相關(guān)關(guān)系，距海越近，雨水及地下水中D含量越大。廣東南臨南海，廣西南臨北部灣，故廣東的δD遠(yuǎn)高于云南，其中陽春相對富集，西雙版納相對貧化；而廣西介于二者之間，δD值介于-68.76‰～-45.64‰之間。

在建立判別模型時(shí)，自變量的個(gè)數(shù)多并不代表結(jié)果更好，若未加選擇地使用全變量進(jìn)行分析，可能會(huì)產(chǎn)生較大的偏差。因此，本研究采用OPLS-DA對不同產(chǎn)地的陽春砂樣品進(jìn)行初步判別，篩選出具有顯著差異性的同位素，再利用經(jīng)篩選后的差異性指標(biāo)建立LDA判別模型，減少出現(xiàn)判別結(jié)果的偏差，提高判別效果及可信度。利用δ13C、δD的比值建立廣東、廣西、云南等3個(gè)省份的產(chǎn)地判別模型，判別率僅為76.9%，產(chǎn)地判別的正確率不高?？赡芤?yàn)檫@3個(gè)省份的自然氣候和生態(tài)環(huán)境相似，不足以導(dǎo)致同位素比率的顯著性變化，所以，有部分樣品被誤判到鄰近的省份。進(jìn)一步選取廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個(gè)樣品數(shù)較多且具有地域代表性的產(chǎn)地樣品進(jìn)行判別分析，所得判別率達(dá)到89.7%，說明這4個(gè)產(chǎn)地的判別模型良好，具有一定的可行性，但后續(xù)仍需要結(jié)合更多其他指標(biāo)作進(jìn)一步判別分析，提高模型的準(zhǔn)確性。

利用穩(wěn)定同位素比值建立的判別模型，正確率不高的可能性有：分析的指標(biāo)少，獲得的同位素信息面不全；所采集的樣品其地理位置差距不大，導(dǎo)致同位素比值的差異不足以準(zhǔn)確地區(qū)分不同產(chǎn)地的陽春砂；樣本量有限，無法反映整體的差異性。因此，需要結(jié)合更多的分析指標(biāo)如無機(jī)元素、有機(jī)成分等指標(biāo)，以及增加地理位置差距大的樣品數(shù)量來提高判別正確率，才可為陽春砂的產(chǎn)地鑒別提供更多的科學(xué)依據(jù)，以進(jìn)一步證明該方法的可行性。

綜上所述，穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜法作為一種新型的檢測技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法可為中藥材的產(chǎn)地鑒別提供一種新的思路。結(jié)合OPLS-DA及LDA方法建立不同產(chǎn)地陽春砂的判別模型，分析結(jié)果表明廣東陽春、廣西崇左、云南西雙版納、云南文山這4個(gè)產(chǎn)地的判別模型良好，具有地域性特征的δ13C、δD有望被應(yīng)用于陽春砂產(chǎn)地溯源。