加減益經(jīng)湯對卵巢功能減退大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β超家族相關(guān)成員的影響

李麗美， 夏建紅， 黃雪萍， 陳婷婷， 和秀魁

（1.廣東省婦幼保健院婦?？?，廣東廣州 510095；2.廣東省婦幼保健院保健部，廣東廣州 510095；3.廣東省婦幼保健院婦科，廣東廣州 510095）

加減益經(jīng)湯是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科張玉珍、陶莉莉教授的臨床經(jīng)驗方，用于治療卵巢功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）引起的月經(jīng)不調(diào)、不孕、性激素不足等疾病，療效顯著。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，加減益經(jīng)湯可明顯改善腎虛肝郁證卵巢功能減退患者的臨床癥狀、性激素水平及妊娠率[1-3]，可恢復(fù)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的卵巢功能減退大鼠的動情周期，改善性激素水平[1]，但其機(jī)制尚不明確。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族相關(guān)成員對卵泡的生長、發(fā)育、成熟、閉鎖，甾體激素的產(chǎn)生起著重要的調(diào)控作用[4]。另外，前期實驗研究證實，采用單次腹腔注射75 mg/kg環(huán)磷酰胺法可成功構(gòu)建卵巢功能減退大鼠模型[1，5]，因此，本研究同法復(fù)制卵巢功能減退大鼠模型，以補(bǔ)佳樂為陽性對照藥，觀察加減益經(jīng)湯對TGF-β超家族中相關(guān)成員的影響，以期明確其抗卵巢功能減退的作用機(jī)制?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級12周齡健康成年雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量（230±10）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（粵）2013-0002。經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片篩查，動情周期均正常。室溫20～25℃，光照14 h，相對濕度45%～55%。

1.2 藥物、試劑與儀器加減益經(jīng)湯組成包括熟地黃20 g，黨參20 g，菟絲子20 g，當(dāng)歸10 g，丹參15 g，白芍10 g，柴胡6 g等9味中藥[1，6-7]。將上述中藥材水煎并濃縮為每毫升含生藥2.358、1.179、0.589 5 g的藥液，裝瓶冷藏備用（由廣東省中醫(yī)研究所制備），應(yīng)用時以蒸餾水調(diào)配。戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂），為法國DELPHARMLille S.A.S公司產(chǎn)品，批號：251A2。環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號：04130301；抗苗勒氏管激素（AMH）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、抑制素B（INHB）ELISA試劑盒，均為上海西唐生物科技有限公司產(chǎn)品；AMH抗體與TGF-β1抗體為美國Santa Cruz生物技術(shù)公司產(chǎn)品；骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP-15）與轉(zhuǎn)化生長因子-β1受體（TGF-β1R）為武漢博士德生物科技有限公司產(chǎn)品。Bio-Rad 680酶標(biāo)儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.3 動物模型的制備、分組與給藥將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分出10只作為空白組，給予1 mL生理鹽水腹腔注射；其余50只大鼠給予環(huán)磷酰胺75 mg/kg（加生理鹽水配制成1 mL藥液）單次腹腔注射構(gòu)建卵巢功能減退模型[1，5，8]。環(huán)磷酰胺造模后，大鼠出現(xiàn)精神差、蜷臥少動、脫毛、易激惹等表現(xiàn)，提示造模成功。將造模成功的大鼠采用完全隨機(jī)分組法分為加減益經(jīng)湯高、中、低劑量組，補(bǔ)佳樂組，模型組，每組10只。加減益經(jīng)湯高、中、低劑量組參考《中藥藥理研究方法學(xué)》分別給予加減益經(jīng)湯23.58、11.79、5.895 g·kg-1·d-1（生藥劑量）灌胃；補(bǔ)佳樂組參考《中藥藥理研究方法學(xué)》給予補(bǔ)佳樂（與生理鹽水配成混懸液）0.09 mg·kg-1·d-1灌胃；模型組與空白組灌胃10 mL·kg-1蒸餾水。造模后2 h開始灌胃給藥，1次/日，連續(xù)4周。

1.4 觀察指標(biāo)與方法模型組在造模后2周，其余組在結(jié)束給藥后，篩查出處于動情間期的大鼠，斷頸處死。腹主動脈采血，室溫靜置30 min后離心分離血清置于-80℃保存待測。以雙抗體夾心ELISA法測定血清AMH、INHB水平。卵巢組織切片后，采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法按試劑盒說明書分別測定AMH、TGF-β1、TGF-β1R、BMP-15蛋白表達(dá)。采集免疫組織化學(xué)圖像，用Image-Pro Plus分析軟件進(jìn)行圖像分析，每張切片于400倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，進(jìn)行積分光密度（IOD）測定。IOD代表目的蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計方法采用SPSS 21.0 For Windows統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清AMH、INHB水平的比較表1結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清AMH、INHB水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組血清AMH水平明顯升高（P＜0.01），加減益經(jīng)湯高、中劑量組血清INHB水平明顯升高（P＜0.01），且各治療組之間AMH、INHB比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠血清AMH、INHB水平的比較Table 1 Comparison of the serum levels of AMH and INHB in various groups （±s，pg·mL-1）

表1 各組大鼠血清AMH、INHB水平的比較Table 1 Comparison of the serum levels of AMH and INHB in various groups （±s，pg·mL-1）

①P<0.01，與空白組比較；②P<0.01，與模型組比較

組別空白組模型組補(bǔ)佳樂組加減益經(jīng)湯高劑量組加減益經(jīng)湯中劑量組加減益經(jīng)湯低劑量組INHB 150.54±19.05 87.89±17.97①111.25±13.84 120.14±22.96②124.11±19.96②111.14±20.81鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 AMH 17.32±1.96 9.87±1.72①15.97±1.87②14.75±2.06②14.66±2.33②14.10±1.76②

2.2 各組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R表達(dá)水平的比較表2，圖1~2結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R IOD值明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1RIOD值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且各治療組之間TGF-β1、TGF-β1R比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R表達(dá)水平的比較Table 2 Comparison of the expression levels of TGF-β1 and TGF-β1R in rat ovarian tissue of various groups （±s）

表2 各組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R表達(dá)水平的比較Table 2 Comparison of the expression levels of TGF-β1 and TGF-β1R in rat ovarian tissue of various groups （±s）

①P<0.01，與空白組比較；②P<0.05，③P<0.01，與模型組比較

組別空白組模型組補(bǔ)佳樂組加減益經(jīng)湯高劑量組加減益經(jīng)湯中劑量組加減益經(jīng)湯低劑量組TGF-β1RIOD值10 930.35±1 089.87 6 086.16±1 366.70①8 327.58±500.56③8 663.30±585.01③8 352.32±665.88③8 055.16±640.42②鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 TGF-β1 IOD值39 520.25±3 034.53 20 976.87±3 385.54①27 811.26±1 889.68②29 793.98±3 566.76③28 565.70±3 198.38③27 342.17±1 991.62②

圖1 各組大鼠卵巢TGF-β1陽性表達(dá)分布的比較（免疫組織化學(xué)法，×400）Figure 1 Comparison of the distribution of positive expression of TGF-β1 in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖2 各組大鼠卵巢TGF-β1R陽性表達(dá)分布的比較（免疫組織化學(xué)法，×400）Figure 2 Comparison of the distribution of positive expression of TGF-β1 in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×400）

2.3 各組大鼠卵巢AMH、BMP-15表達(dá)水平的比較表3，圖3~4結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組AMH、BMP-15的IOD值明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組AMH、BMP-15 IOD值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且各治療組之間AMH、BMP-15 IOD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠卵巢AMH、BMP-15表達(dá)水平的比較Table 3 Comparison of the expression levels of AMH and BMP-15 in ovarian tissue of various groups （±s）

表3 各組大鼠卵巢AMH、BMP-15表達(dá)水平的比較Table 3 Comparison of the expression levels of AMH and BMP-15 in ovarian tissue of various groups （±s）

①P<0.01，與空白組比較；②P<0.05，③P<0.01，與模型組比較

組別空白組模型組補(bǔ)佳樂組加減益經(jīng)湯高劑量組加減益經(jīng)湯中劑量組加減益經(jīng)湯低劑量組BMP-15 IOD值340 535.46±27 495.48 222 745.08±20 023.42①278 137.75±34 202.27②294 423.19±22 992.96③290 052.26±20 929.47③282 033.55±25 234.15②鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 AMH IOD值24 276.68±3 122.93 12 083.57±1 396.84①20 237.66±1 276.56③21 201.72±1 544.98③21 208.65±2 483.95③19 479.61±2 019.62③

圖3 各組大鼠卵巢AMH陽性表達(dá)分布的比較（免疫組織化學(xué)法，×400）Figure 3 Comparison of the distribution of positive expression of AMH in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖4 各組大鼠卵巢BMP-15陽性表達(dá)分布的比較（免疫組織化學(xué)法，×400）Figure 4 Comparison of the distribution of positive expression of BMP-15 in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×400）

3 討論

中醫(yī)學(xué)將卵巢功能減退歸屬于“經(jīng)水早斷”“血枯”“不孕”等病證范疇?！陡登嘀髋啤穼⑵涿枋鰹椤澳晡蠢隙?jīng)水?dāng)唷?，采用益?jīng)湯治療。張玉珍教授[9]認(rèn)為本病病機(jī)為脾腎虧虛，肝郁血瘀，治法為補(bǔ)腎健脾、疏肝活血，采用加減歸腎丸治療。陶莉莉教授認(rèn)為此病腎虛乃是根本，情志因素是誘發(fā)卵巢功能減退的重要病因，采用加減益經(jīng)湯治療[1-3]。加減益經(jīng)湯是在益經(jīng)湯的基礎(chǔ)上加減化裁而來，方中：以熟地黃、菟絲子、黨參為君，補(bǔ)腎健脾；以杜仲、丹參、北沙參為臣，補(bǔ)腎活血，補(bǔ)而不燥；當(dāng)歸、白芍為佐，補(bǔ)血柔肝；柴胡為使，疏肝氣。全方配伍合理、簡潔，腎、脾、肝、心、肺五臟同調(diào)，共奏補(bǔ)腎健脾，疏肝活血之功。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，加減益經(jīng)湯可改善腎虛肝郁證卵巢功能減退患者的臨床癥狀，提高妊娠率，降低卵泡刺激素（FSH）、促黃體素（LH）水平，升高雌二醇（E2）含量[1-3]；動物實驗證實，加減益經(jīng)湯可恢復(fù)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的卵巢功能減退大鼠的動情周期，改善各級卵泡數(shù)目，降低FSH、LH水平，升高E2含量，但機(jī)制尚不明確[1]。

卵巢衰老的機(jī)制是由多種生理及外界因素相互作用和逐漸積累的生物學(xué)現(xiàn)象，卵泡數(shù)目減少、卵泡質(zhì)量降低是導(dǎo)致卵巢衰老從而引起生育問題以及絕經(jīng)的關(guān)鍵原因。卵泡啟動、生長發(fā)育、退化及甾體激素合成除受下丘腦-垂體-卵巢軸（HPOA）調(diào)節(jié)外，還受多種卵巢局部分泌的生長因子、細(xì)胞因子和激素等所構(gòu)成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)[10]。近年來，許多研究表明，TGF-β超家族中的AMH、INHB、TGF-β1、BMP-15參與了卵巢生理和病理過程的調(diào)控，對卵泡的發(fā)育起著重要的調(diào)控作用[11]。因此，本研究從TGF-β超家族中對卵巢發(fā)育起重要作用的細(xì)胞因子與受體入手，以環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢功能減退模型大鼠為研究對象，觀察卵巢功能減退大鼠TGF-β超家族中AMH、INHB、BMP-15、TGF-β1、TGF-β1R的變化以及高、中、低劑量加減益經(jīng)湯干預(yù)的作用機(jī)制。

AMH主要由卵巢竇前卵泡及小的竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞分泌，它可以相對真實地反映原始卵泡庫存量[1，12]。它的作用是維持原始卵泡持續(xù)處于靜止?fàn)顟B(tài)，抑制其向初級卵泡的轉(zhuǎn)化，可作為預(yù)測卵巢儲備功能及促排卵過程中卵巢反應(yīng)性的血清學(xué)標(biāo)記物[13]。AMH作為評估卵巢儲備功能的指標(biāo)，對卵巢損傷的評估具有意義[14-15]。本研究結(jié)果顯示，卵巢功能減退模型大鼠血清AMH與卵巢AMH的表達(dá)降低，經(jīng)加減益經(jīng)湯治療后，卵巢功能減退大鼠血清與卵巢AMH的表達(dá)升高。表明加減益經(jīng)湯可通過上調(diào)AMH的表達(dá)而促進(jìn)卵泡發(fā)育，抑制卵泡過度閉鎖，提高卵巢儲備力。

INHB作為早期預(yù)測卵巢儲備功能下降的指標(biāo)，是診斷卵巢功能減退的敏感指標(biāo)之一[16]。Yong等[17]發(fā)現(xiàn)，INHB的上升與卵巢顆粒細(xì)胞功能的恢復(fù)呈正相關(guān)，推測INHB可作為評估卵泡發(fā)育或預(yù)測卵母細(xì)胞恢復(fù)的標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎中藥可增加血清INHB水平，改善卵巢儲備功能，抑制卵泡過度閉鎖[18]。本研究結(jié)果顯示，卵巢功能減退模型大鼠卵巢INHB分泌減少，經(jīng)加減益經(jīng)湯干預(yù)后，血清INHB分泌增加，且呈現(xiàn)出劑量依賴性，高、中劑量組明顯，而補(bǔ)佳樂作用不大。表明加減益經(jīng)湯可通過上調(diào)INHB的分泌而提高卵巢儲備功能。

TGF-β1在原始卵泡的募集及原始卵泡池的維持方面起重要調(diào)控作用[19]。TGF-β1R是TGF-β1發(fā)揮作用的重要組成部分。有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢功能減退和POF患者血清中TGF-β1的水平較正常人明顯降低[20]。本研究結(jié)果顯示，卵巢功能減退模型大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R表達(dá)水平降低，經(jīng)加減益經(jīng)湯干預(yù)后，卵巢TGF-β1與TGF-β1R的表達(dá)水平升高。表明加減益經(jīng)湯可通過上調(diào)卵巢TGF-β1、TGF-β1R的表達(dá)，促進(jìn)卵泡的生長、發(fā)育。

BMP-15是X染色體上首個被證實的對維持卵巢儲備及決定絕經(jīng)年齡有著關(guān)鍵作用的劑量效應(yīng)基因[21]。BMP-15對卵泡的早期發(fā)育極其重要，其基因突變可能是卵巢功能減退或POF發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一[22]。本研究結(jié)果顯示，卵巢功能減退模型大鼠卵巢BMP-15表達(dá)降低，經(jīng)加減益經(jīng)湯干預(yù)后，卵巢BMP-15的表達(dá)升高。表明加減益經(jīng)湯可通過上調(diào)卵巢BMP-15的表達(dá)促進(jìn)卵泡早期發(fā)育，從而提高卵巢儲備功能。

綜上所述，加減益經(jīng)湯改善卵巢儲備功能可能與調(diào)節(jié)卵巢TGF-β超家族成員AMH、INHB、BMP-15、TGF-β1、TGF-β1R的表達(dá)有關(guān)。