基于NLRP3炎癥小體探討天麻鉤藤顆粒對自發(fā)性高血壓肝陽上亢證認知障礙的影響*

劉晨笑，孟玥，孫治琪，趙永烈，劉子旺

北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029

隨著人們生活節(jié)奏的加快，不規(guī)律的生活和飲食方式使得高血壓發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性的高血壓是引起認知功能障礙的主要危險因素，對學習、記憶、執(zhí)行等方面的認知功能造成不同程度的損害［1］。中醫(yī)學將高血壓歸屬于“頭痛”“眩暈”等范疇，以肝陽上亢證最為常見［2］。臨床上，中醫(yī)準確的辨證論治收效明顯，但其作用機理尚未明確。因此，本實驗擬建立肝陽上亢型高血壓認知功能障礙模型，通過檢測模型大鼠血壓、認知行為學、血清炎性因子及額葉病理損傷，探究天麻鉤藤顆粒防治高血壓認知功能障礙可能的作用機制，以期為臨床治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHRs）32只，清潔級，雄性，8周齡，體質量（200±10）g；清潔級SD大鼠6只，雄性，8周齡，體質量（200±10）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2012－0001，倫理批號：BUCM－4－2019092402－3070。實驗室定期清潔、消毒，通風良好，溫度20～25℃、濕度（55±2）%，晝夜間斷照明。

1.2 藥物與試劑附子湯（北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院中藥房提供）；天麻鉤藤顆粒（成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司，批號：20200609）；尼莫地平片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號：20190207）。戊巴比妥鈉（天津市元立化工有限公司，批號：20190506）；無水乙醇、二甲苯（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號分別為：BH100591、20191208）；蘇木素染液（上海碧云天生物公司，批號：190916）；伊紅（北京索萊寶生物技術有限公司，批號：190917）；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（nucleotides bind to oligomeric domain－like receptor 3，NLRP3）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis－associated spot－like protein，ASC）、Caspase－1試劑盒（武漢圣洛捷生物技術有限公司，貨號分別為：AE31893HU、AE58604HU、AE38730HU）。

1.3 儀器Softron BP－2010A型大鼠無創(chuàng)尾動脈測壓儀（北京軟隆科技有限責任公司）；ZS－001moriss型水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司）；酶標儀（美國Bio－tek公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備附子湯制備方法：制附子（黑順片）浸泡30 min，煎煮兩次，將兩次藥液合并濃縮為含生藥量0.2 g·mL－1藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

臨床上患者每天服用天麻鉤藤顆粒為30 g，尼莫地平片為60 mg。按照大鼠與人為6.25換算系數(shù)，計算出實驗大鼠天麻鉤藤顆粒灌胃劑量為3.125 g·kg－1，尼莫地平片灌胃劑量為6.25 g·kg－1。用蒸餾水把天麻鉤藤顆粒配制成31.25 g·mL－1藥液，尼莫地平片配制成62.5 g·mL－1藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物模型制備及分組將32只SHRs大鼠，隨機取8只作為自發(fā)性高血壓組，其余大鼠連續(xù)給予附子湯（2 g·kg－1）28 d，復制自發(fā)性高血壓肝陽上亢證大鼠模型［3－4］，然后將其分為SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組，另取6只正常SD大鼠為空白組，分別給予相應的藥物連續(xù)灌胃42 d，空白組、對照組均給予同體積的蒸餾水42 d。

2.3 觀察大鼠的一般情況

2.3.1 大鼠的表觀指標觀察大鼠毛發(fā)是否粗糙發(fā)黃、蓬松無光澤，形體是否消瘦，眼結合膜是否充血、顏色等。大鼠給藥后進行測定。

2.3.2 易激惹程度評分的測定Ⅰ級：抓取大鼠頸部時狂躁、驚叫，為1分；Ⅱ級：抓取大鼠頸部時惱怒、傷人，有攻擊性，為2分；Ⅲ級：提捏大鼠尾部時驚叫、狂躁，同籠內大鼠打斗激烈、撕咬鼠籠、傷人，攻擊性較強，為3分；無明顯現(xiàn)象記0分。大鼠于給藥后測量1次。

2.3.3 大鼠飲水量的測量將全部大鼠予單籠飼養(yǎng)，選擇帶有刻度值的250 mL專用滾珠型飲水瓶供水，觀察24 h飲水量變化，飲水瓶內水量變化加每日灌藥量即為每日飲水量。大鼠于給藥后測量1次。

2.4 Morris水迷宮的測試給藥第38天后，大鼠進行Morris水迷宮訓練，共3 d，訓練大鼠的學習、記憶能力，第4天記錄大鼠在各象限入水點入水后找到平臺的時間（逃避潛伏期）。具體操作：將大鼠面朝壁分別于四個象限的入水點放入水迷宮內，觀察并記錄找到平臺的時間；第4天撤去平臺，將大鼠于平臺對側入水點放入，觀察大鼠游泳軌跡并記錄60 s內大鼠在目標象限穿越平臺區(qū)域的次數(shù)，測試大鼠空間記憶能力。

2.5 血壓的測量水迷宮測試后對大鼠測量血壓，每只大鼠在靜息狀態(tài)下測量3次，取平均值。

2.6 血清指標的檢測血壓測量后，用體積分數(shù)5%戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，腹主動脈血，4 000 r·min－1轉速離心3 min，分離血清后，采用ELISA法檢測血清中NLRP3、Caspase－1、ASC水平。

2.7 觀察大鼠腦病理損傷變化腹主動脈取血后，每組隨機選取4只大鼠，剝離大腦額葉組織，40 ng·L－1多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，進行連續(xù)切片，厚5μm，每片相距30μm，常規(guī)脫蠟后蘇木精－伊紅染色，封用。在顯微鏡下觀察大鼠腦病理損傷變化。

2.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結果采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間采用配對樣本t檢驗，組間比較采用單因素ANOVA檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠的一般情況空白組、對照組毛發(fā)柔順光澤、形體正常、眼結合膜無充血；SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)蓬松無光澤、形體消瘦、眼結合膜充血等。與空白組、對照組比較，SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠易激惹程度評分和飲水量均顯著增加（P＜0.01）。見表1。

表1 對大鼠易激惹程度和飲水量的影響（±s）

表1 對大鼠易激惹程度和飲水量的影響（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與對照組比較，△△P＜0.01

組別 n易激惹程度評分／分 飲水量（V／mL）6 0.83±0.41 24.71±1.57對照組 8 1.50±0.76 24.51±2.04 SHRs肝陽上亢證組 8 2.38±0.52**△△46.24±2.56**△△天麻鉤藤顆粒組 8 2.38±0.52**△△46.93±2.23**△△尼莫地平片組 8 2.5±0.53**△△47.33±3.09空白組**△△

3.2 對大鼠水迷宮測試的影響與空白組、對照組比較，SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠逃避潛伏期明顯延長，目標象限停留時間明顯縮短、穿越平臺次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與SHRs肝陽上亢證組比較，天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，目標象限停留時間明顯延長、穿越平臺次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。見表2、圖1、圖2。

表2 對大鼠水迷宮測試的影響 （±s）

表2 對大鼠水迷宮測試的影響 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05；與SHRs肝陽上亢證組比較，＃P＜0.05

組別 n逃避潛伏期（t／s）目標象限停留時間（t／s）穿越平臺次數(shù)／次6 25.99±3.28 34.04±1.77 5.58±1.26對照組 8 26.74±2.42 32.36±3.12 5.02±1.52 SHRs肝陽上亢證組8 42.96±5.91*△24.22±2.67*△ 3.00±1.13*△天麻鉤藤顆粒組 8 29.62±5.65*△＃27.87±2.46*△＃4.99±1.16*△＃尼莫地平片組 8 30.40±3.52*△＃28.03±2.55*△＃5.03±1.09*△?？瞻捉M

圖1 大鼠定位航行實驗游泳軌跡圖

圖2大鼠空間探索實驗游泳軌跡圖

3.3 對大鼠血壓的影響與空白組比較，對照組、SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠收縮壓、舒張壓均顯著升高（P＜0.01）；與對照組比較，麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠收縮壓顯著降低（P＜0.05）、舒張壓顯著降低（P＜0.01）；與SHRs肝陽上亢證組比較，麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠收縮壓、舒張壓均顯著降低（P＜0.01）。見表3。

表3 對大鼠血壓的影響 （±s，mm Hg）

表3 對大鼠血壓的影響 （±s，mm Hg）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與SHRs肝陽上亢證組比較，＃＃P＜0.01。1 mm Hg＝0.133 kPa

組別 n 收縮壓 舒張壓空白組6 116.00±9.63 87.50±3.15對照組 8 193.50±11.82** 140.88±5.74**SHRs肝陽上亢證組 8 205.63±15.95** 137.00±7.96**天麻鉤藤顆粒組 8 183.50±29.44**△＃＃118.50±12.26**△△＃＃尼莫地平片組 8 172.38±22.82**△＃＃117.25±10.76**△△＃＃

3.4 對大鼠血清炎癥因子的影響與空白組比較，對照組、SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠血清NLRP3、Caspase－1、ASC水平均顯著升高（P＜0.01）；與對照組、SHRs肝陽上亢組比較，麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠血清NLRP3、Caspase－1、ASC水平均顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 對大鼠血清炎癥因子的影響 （±s）

表4 對大鼠血清炎癥因子的影響 （±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與SHRs肝陽上亢證組比較，＃＃P＜0.01

數(shù)量 NLRP3（ρ／μg·L－1） Caspase－1（c／nmol·L－1） ASC（ρ／ng·L－1）8.50±0.69 17.37±1.56 73.50±37.57對照組 8 13.78±0.87** 27.61±1.94** 182.35±36.45**SHRs肝陽上亢證組 8 13.33±0.51** 24.10±2.56** 199.02±25.92**天麻鉤藤顆粒組 8 11.39±0.30**△△＃＃ 20.60±1.66**△△＃＃ 114.12±25.39**△△＃＃尼莫地平片組 8 11.28±0.43**△△＃＃ 20.16±3.65**△△＃＃ 125.79±17.67**△△＃?？瞻捉M6

3.5 對大鼠額葉病理學及尼氏染色的影響空白組、對照組、天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠額葉神經元細胞輪廓清晰，排列規(guī)整、緊密，細胞核大而圓，處于胞體中心，核仁清晰可見，胞體充盈，細胞質豐富；且天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組分別與空白組及對照組相比無明顯區(qū)別。SHRs肝陽上亢證組大鼠神經元細胞出現(xiàn)變性、大小不等及結構破壞，細胞排列雜亂，細胞核縮小，核仁不清。說明天麻鉤藤顆粒和尼莫地平片能夠抑制神經元變性。見圖3、圖4。

圖3 額葉HE染色（200×）

圖4 大鼠腦組織額葉尼氏染色（200×）

4 討論

隨著中國社會老齡化進程不斷加快，高血壓的發(fā)病率逐年上升，截止到2017年，高血壓患病率已達到46.4%［5］，且由高血壓造成的認知功能障礙也在持續(xù)進行，嚴重影響患者生存質量［6］。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓是認知功能障礙發(fā)生的重要危險因素［7－9］，高收縮壓（＞160 mm Hg）者血壓每升高10 mm Hg，誘發(fā)認知能力減退的風險增加9%［10］。針對高血壓導致的認知功能障礙，西醫(yī)多予降壓、營養(yǎng)腦神經等方法治療，臨床效果較好，但存在不良反應，而中醫(yī)則注重調節(jié)整體，通過辨證論治選方用藥，降壓的同時又能減輕不良反應，較西醫(yī)具有顯著優(yōu)勢［11］。

高血壓屬于中醫(yī)學“眩暈”“頭痛”范疇，其中以肝陽上亢證最為常見［2］，認知功能障礙則屬“癡呆”“健忘”之類。中醫(yī)學認為多因肝陽偏亢、肝腎陰虛日久，耗傷肝腎陰精，腎精虧虛，髓減腦消，神機失用，影響認知功能。天麻鉤藤飲是臨床治療高血壓的代表方劑，該方出自胡光慈的《中醫(yī)內科雜病證治新義》，由天麻、鉤藤、石決明、黃芩、梔子、益母草、牛膝、杜仲、桑寄生、茯神、夜交藤組成，具有平肝潛陽、滋補肝腎之功效，與實驗模型方證對應，并且干預42 d即可出現(xiàn)相關癥狀及指標的變化［12－13］。研究發(fā)現(xiàn)，尼莫地平脂溶性好，能夠通過血腦屏障，有降壓作用，同時對認知功能障礙亦有改善作用［14－15］。因此，本實驗中選用尼莫地平片作為對照組。

高血壓導致認知功能障礙的西醫(yī)發(fā)病機制尚不完全清楚［16］，“高血壓是一種血管炎癥”這一說法越來越受到醫(yī)者的認可［17］，其中NLRP3炎癥小體在高血壓、認知功能障礙等疾病發(fā)生進程中具有重要作用［18－20］。NLRP3炎癥小體是由NLR蛋白、ASC、半胱氨酸蛋白酶前體（pro－caspase－1）共同組成的一種多蛋白多聚體，受到氧化應激、微生物感染、免疫反應等危險因子時被激活形成巨大的炎癥小體復合物［21］，將Caspase－1前體（pro－caspase－1）剪切為生物活性較強的Caspase－1 P10片段，促使下游白細胞介素－18前體（pro－interleukin－18，pro－IL－18）和白細胞介素－1β前體（pro－interleukin－1β，pro－IL－1β）轉化成具有較強生物活性的IL－18和IL－1β等炎癥因子［22］，促進機體內膽堿能抗炎通路（cholinergic anti－inflammatory pathway，CRP）、IL－6和腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）等多種炎癥細胞因子的成熟與分泌［23－24］。其中IL－18和IL－1β可激活核因子－κB（nuclear factorκB，NF－κB）信號通路，誘發(fā)腦神經炎［25］；TNF－α可通過激活T淋巴細胞引起適應性免疫反應或一系列的復合反應導致細胞變性壞死，加重局部炎癥，導致腦細胞凋亡及腦組織損傷［26］，出現(xiàn)認知、記憶、學習等腦功能障礙。加之長期處于高血壓狀態(tài)下，血管平滑肌增生、內皮損傷，血管通透性增加，促使了各種炎癥因子向腦組織的侵入，加重腦組織損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，與SHRs肝陽上亢證組、對照組比較，天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠血清中NLRP3、ASC、Caspase－1水平顯著降低，且天麻鉤藤顆粒組亦低于尼莫地平片組。大腦額葉與認知、執(zhí)行能力和情緒處理能力等功能密切相關［6］，通過觀察大鼠腦額葉病理損傷發(fā)現(xiàn)，藥物干預后，除SHRs肝陽上亢證組出現(xiàn)腦皮質水腫、神經元變性，空白組、對照組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組組間無明顯區(qū)別。結合Morris水迷宮實驗結果，即干預后的天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠逃避潛伏期縮短、目標象限停留時間延長、穿越平臺次數(shù)增多等情況，提示天麻鉤藤顆粒能夠有效改善認知功能障礙，其機制可能是通過降低血清中的NLRP3炎癥小體，抑制炎癥反應，減輕腦額葉組織損傷，保護額葉神經元，從而達到改善認知功能的目的。有研究證明了癡呆與炎癥反應的關系［27］，提出額葉皮質損傷可導致認知功能障礙［28］，也有研究證實天麻鉤藤飲能夠改善自發(fā)性高血壓肝陽上亢證所致的認知功能障礙［29－30］，均支持了本實驗的結論。

綜上所述，天麻鉤藤顆粒能在一定程度上抑制NLRP3炎癥小體合成，保護額葉神經元，改善模型大鼠認知能力，這可能是其治療高血壓認知功能障礙的重要機制。