一種快速檢測Hg2＋的比率熒光傳感器構建

賈寶珠，戚凱欣，樊怡飛，蔡美玲，廖彩霞，羅雙子，古宗婷，蔡常宇，韋曉群，徐振林，羅 林,*

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東 廣州 510303；2.廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642）

隨經(jīng)濟的發(fā)展，重金屬離子在各領域得到了廣泛的應用，但與此同時也帶來了環(huán)境污染與食品安全問題。我國是農(nóng)業(yè)出口大國，而農(nóng)產(chǎn)品中重金屬污染成為我國食品貿易亟待解決的巨大障礙[1]。其中汞離子（Hg2+）是常見的劇毒重金屬離子之一，其可通過水、空氣和土壤等方式進行遷移，并以食物鏈的形式進入人體，在肝臟、腎臟、腦部等器官富集，從而危害人體的生命健康[2]。1956年日本因工業(yè)廢水的排放造成食品、水源污染的“水俁病”[3]。因此，從貿易利益和國民食品安全的角度出發(fā)，世界各國對食品中Hg2+殘留的監(jiān)測日益嚴格，這也要求Hg2+的檢測技術不斷進步。

傳統(tǒng)檢測重金屬離子主要基于儀器分析法，如原子吸收光譜法[4-8]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[9-11]。儀器法準確度高、精密度好、檢出限低，但是操作繁瑣、設備成本高、較難用于現(xiàn)場的快速檢測。隨著納米科技近些年的快速發(fā)展，利用納米材料構建檢測重金屬離子的傳感器已成為研究熱點之一，其中熒光傳感器由于靈敏度高、操作簡便更備受關注。然而，現(xiàn)今檢測Hg2+的熒光傳感器大多為“turn-off”模式（熒光猝滅型）[12-13]和“turn-on”模式（熒光猝滅型）[14-16]。此類以單一熒光強度為檢測信號的熒光傳感器，易受探針濃度、pH值等外界環(huán)境因素的干擾，導致其精確度相對較弱。而通過測定在同一激發(fā)波長下兩個發(fā)射強度比值變化的比率熒光傳感器，由于兩個發(fā)射峰強度受到的外界干擾一樣，兩者的比值一定程度上抵消了外界干擾因素，具有自帶內標效應，因此該類傳感器具有更高精密度、信噪比及靈敏度，已成為當前熱門研究方向。Zhang Zhenzhen等[17]構建了基于熒光染料摻雜的鑭系配位聚合物顆粒為Hg2+探針的比率熒光傳感器，然而該傳感器存在探針合成步驟復雜、有機染料熒光穩(wěn)定性差等缺陷。

近年來新型熒光納米材料如碳量子點、硅量子點、金屬納米簇等地不斷涌現(xiàn)，因其具有生物相容性好、熒光光穩(wěn)定性強、量子產(chǎn)率高等優(yōu)點，已成為構建熒光探針的優(yōu)選材料[18-20]。本研究通過水熱法一步合成硅摻雜碳量子點（silicon-doped carbon quantum dots，Si-CDs），以溶菌酶（lysozyme，Lys）為配體及還原劑在堿性條件下還原氯金酸制備Lys穩(wěn)定的金納米簇（Lys-AuNCs），并以這兩種熒光材料構建了一種能夠快速、準確檢測Hg2+的比率熒光傳感器。其原理如圖1所示，發(fā)藍色熒光的Si-CDs的熒光強度（I470）不受Hg2+的影響作為比率熒光傳感器的參比熒光信號；基于Au+-Hg2+間的親金效應，Hg2+可高效猝滅Lys-AuNCs的紅色熒光（I670），因此，以發(fā)紅色熒光的Lys-AuNCs作為比率熒光傳感器的響應熒光信號，通過熒光強度比值（I670/I470）即可對Hg2+濃度實現(xiàn)快速、準確的檢測。

圖1 比率熒光傳感器檢測Hg2＋原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the ratometric fluorescence sensor for Hg2＋ determination

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

華南農(nóng)業(yè)大學鄱陽湖湖水、超市銷售的屈臣氏礦泉水以及實驗室自來水。

3-氨丙基三甲氧基硅烷、氯金酸 美國西格瑪奧德里奇公司；檸檬酸、NaOH、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）國藥集團化學試劑有限公司；Lys 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MS 3 basic旋渦混勻振蕩器 德國IKA公司；SSW-600-2S電熱恒溫水槽 上海博訊實業(yè)有限公司；SpectraMax i3x多功能微孔板檢測平臺 美國分子儀器有限公司；Tecnai 12高分辨透射電子顯微鏡 荷蘭FEI公司；ME 104電子分析天平、FE28-Standard pH酸度計德國梅特勒-托利多儀器有限公司；Unique R10超純水凈化儀 廈門銳思捷水純化技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Lys穩(wěn)定的金納米簇的制備

參照文獻[21]方法合成。100 μL 10 mg/mL Lys溶液和100 μL 4 mmol/L HAuCl4溶液加到100 μL的水中混勻。大約5 min之后，加入10 μL 1 mol/L NaOH溶液，在37 ℃攪拌反應過夜。反應混合物用蒸餾水透析48 h，得到棕褐色溶液即為制備完成Lys-AuNCs溶液。

1.3.2 Si-CDs的制備

為實驗前期制備[22]，合成方法如下：量取10 mLN-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷于100 mL三頸燒瓶中，用氮氣脫氣5 min后，加熱至240 ℃，在劇烈攪拌下迅速加入0.5 g無水檸檬酸，保持該溫度加熱1 min，最終產(chǎn)物用石油醚洗滌3 次，得到約2 mL碳量子點。

1.3.3 比率熒光傳感器的構建

將合成的Si-CDs和Lys-AuNCs溶液進行不同倍數(shù)稀釋。分別取50 μL不同稀釋倍數(shù)的Si-CDs和Lys-AuNCs進行不同濃度配比的混合，再加入200 μL的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 6.0），于室溫下充分振蕩，利用兩者在緩沖液中相互作用，構建I670/I470約為1∶1的Si-CDs@Lys-AuNCs比率熒光探針。

1.3.4 標準曲線的建立

先配制質量濃度為0、0.002、0.004、0.008、0.010、0.012、0.016 mg/L的Hg2+溶液，取100 μL不同質量濃度Hg2+溶液、100 μL Si-CDs@Lys-AuNCs混合液與200 μL PBS（0.01 mol/L，pH 6.0）混合，室溫下靜置4 min后進行熒光光譜測試。在370 nm激發(fā)波長下，設定光源激發(fā)狹縫寬與發(fā)射狹縫寬分別為9、15 nm，掃描400～750 nm波長范圍內熒光強度變化。通過計算雙峰熒光強度比值與Hg2+濃度變化關系，并建立標準曲線。

1.3.5 比率熒光傳感器的選擇性

為考察其他金屬離子如Mn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+、Ba2+、Na+對比率熒光傳感器是否有干擾作用，首先，配制濃度為100 nmol/L的上述金屬離子鹽溶液及50 nmol/L的Hg2+溶液，再分別取100 μL不同金屬離子溶液、100 μL Si-CDs@Lys-AuNCs混合液與200 μL PBS（0.01 mol/L，pH 6.0）混合，室溫下充分振蕩，同時設置空白對照組，進行熒光光譜分析。通過計算雙峰熒光強度比值與不同金屬離子的變化關系，判斷比率熒光傳感器對Hg2+的選擇性情況。

1.3.6 實際樣品分析

將華南農(nóng)業(yè)大學鄱陽湖湖水、屈臣氏礦泉水以及實驗室自來水用0.2 μm微孔濾膜過濾后用所建立的熒光傳感器進行測定。并向每個水樣中分別添加0.000 8、0.002、0.012 mg/L三個水平的Hg2+，用0.2 μm微孔濾膜過濾后用所建立的熒光傳感器進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)均重復3 次，采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用Origin 2017軟件繪制結果圖。

2 結果與分析

2.1 Lys-AuNCs與Si-CDs的表征

如圖2A插圖所示，合成的Lys-AuNCs為深棕色溶液，在365 nm紫外燈照射下發(fā)射強烈紅色熒光。Lys-AuNCs分別在370 nm與500 nm左右具有兩個最佳激發(fā)峰，并且在650 nm處有一個被認為由自由電子的帶內躍遷所引發(fā)的近紅外發(fā)射峰[23]，這些特點均與報道的Lys-AuNCs的熒光光譜相符[21]。透射電鏡圖（圖2B）顯示，Lys-AuNCs在水中分散性較好，平均粒徑約2.0 nm。Si-CDs的水溶液為無色透明溶液，在365 nm紫外等照射發(fā)藍色熒光。Si-CDs的最佳激發(fā)波長在370 nm左右，在此激發(fā)波長下，470 nm處有1 個發(fā)射峰（圖3A）。透射電鏡圖顯示平均粒徑在2.2 nm左右，與文獻[22]報道相符。

圖2 Lys-AuNCs的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜圖（A）以及透射電鏡圖（B）Fig.2 Fluorescence excitation and emission spectra (A) and TEM image of Lys-AuNCs (B)

圖3 Si-CDs的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜圖（A）及透射電鏡圖（B）Fig.3 Fluorescence excitation and emission spectra (A) and TEM image of Si-CDs (B)

2.2 比率熒光傳感器可行性驗證

由2.1節(jié)可知，Si-CDs與Lys-AuNCs均在370 nm左右有最佳激發(fā)波長，這是構建單一激發(fā)雙發(fā)射比率熒光探針的必要條件。將Si-CDs與Lys-AuNCs混合構建熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs。圖4A顯示在370 nm激發(fā)下，熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs分別在470 nm與670 nm處具有兩個分離度很好的熒光發(fā)射峰。對Si-CDs、Lys-AuNCs及Si-CDs@Lys-AuNCs的紫外-可見吸收光譜進行掃描測試，發(fā)現(xiàn)Si-CDs與Lys-AuNCs混合后，Si-CDs在353 nm的特征吸收峰沒有發(fā)生紅移或藍移（圖4B）；與此同時，對Si-CDs與Lys-AuNCs混合后0、10、20、30、40 min后的熒光光譜進行測定，發(fā)現(xiàn)熒光光譜基本沒有發(fā)生變化，說明Lys-AuNCs和Si-CDs之間沒有發(fā)生反應或相互作用（圖4C）。將熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs與不同質量濃度Hg2+相互作用，結果如圖4D所示，隸屬于Si-CDs在470 nm處的發(fā)射峰強度在不同Hg2+質量濃度下保持穩(wěn)定，因此，470 nm的熒光信號可作為比率熒光傳感器的參比信號；而隸屬于Lys-AuNCs在670 nm的發(fā)射峰強度隨著Hg2+質量濃度升高而逐漸減弱。Hg2+對金納米簇熒光猝滅機理已有報道：Xie Jianping等[24]發(fā)現(xiàn)由于Hg2+與Au+之間的高親和嗜金屬效應，Hg2+可以顯著猝滅牛血清蛋白穩(wěn)定的金納米簇（BSA-AuNCs）的熒光。綜上可知，基于Si-CDs與Lys-AuNCs構建檢測Hg2+的比率熒光傳感器完全可行。

圖4 Si-CDs@Lys-AuNCs的熒光光譜和紫外-可見光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra and UV-vis absorption spectra of Si-CDs@Lys-AuNCs

2.3 比率熒光傳感器的優(yōu)化

為保證傳感器的最佳檢測性能，對傳感體系所處的pH值、反應時間對Hg2+檢測的影響進行探究。采樣不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的PBS（0.01 mol/L）作為基底溶液進行Hg2+測定實驗，分別對加入Hg2+前后體系的比率熒光信號（I670/I470）進行采集。圖5A顯示，當不存在Hg2+時，體系的I670/I470值比較穩(wěn)定受pH值的影響較小。在加入Hg2+后，由于Hg2+對Lys-AuNCs的熒光猝滅作用，體系的I670/I470值均會減小，但是在pH值偏堿性時（pH＞7.0），Hg2+由于易生產(chǎn)沉淀對Lys-AuNCs猝滅效果明顯減弱導致I670/I470值在Hg2+加入前后的降低幅度減小，從而影響檢測靈敏度。當pH值為6.0時，比率熒光信號在Hg2+加入后降低幅度最大，因此，選擇pH 6.0的PBS作為該傳感體系的基底緩沖液。

圖5 加入Hg2＋（50 nmol/L）后pH值（A）和反應時間（B）對體系比率熒光信號變化的影響Fig.5 Effect of buffer pH (A) and reaction time (B) on variation in ratiometric fluorescence signal after the addition of Hg2+ (50 nmol/L)

與此同時，為保證在最短時間對Hg2+進行準確測定，對反應時間進行優(yōu)化。將Hg2+與比率熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs混合后，記錄體系的I670/I470值隨作用時間變化情況。由圖5B可知，Hg2+加入后的4 min以內，體系的I670/I470值隨時間延長而逐漸降低，說明Hg2+在與熒光探針反應，猝滅Lys-AuNCs；當反應時間超過4 min，體系的I670/I470值基本趨于穩(wěn)定，說明反應基本完成。因此，選擇4 min作為最佳反應時間。

2.4 標準曲線與檢出限

在最優(yōu)條件下，將不同質量濃度的Hg2+（0、0.002、0.004、0.008、0.010、0.012、0.016 mg/L）標準溶液與比率熒光探針Si-CDs@Lys-AuNCs混合，通過熒光光譜儀記錄熒光發(fā)射光譜，計算I670/I470值并建立其與Hg2+質量濃度關系。圖6A顯示，隨Hg2+質量濃度的增加，470 nm波長處Si-CDs的藍色熒光強度（I470）不隨Hg2+質量濃度的變化而變化，而670 nm波長處Lys-AuNC的紅色熒光強度（I670）隨Hg2+質量濃度的增加而逐漸減弱。同等條件下的基于單一熒光信號測定的傳感器與比率熒光傳感器比較，單一熒光信號的傳感器易受外界溫度、濃度、pH值、激發(fā)強度等眾多難以控制因素的干擾；而比率熒光信號傳感器因其自帶內標，通過兩峰熒光強度的比值作為因變量，可極大地削弱其他干擾因素的影響，使得對目標分析物的定量檢測更加精確、更加靈敏。圖6B顯示，I670/I470與Hg2+質量濃度在0～0.016 mg/L范圍內呈良好線性關系，其線性關系式為I670/I470= 1.35-64.18C（Hg2+），R2=0.999，計算檢出限（3σ）為0.001 mg/L，σ為20 次空白測定信號的標準偏差。與已報道的Hg2+檢測方法比較（表1），可以看到本研究建立的傳感器具有較好的靈敏度。

表1 不同方法對Hg2＋的檢測性能比較Table 1 Comparsion of figures of merit of different Hg2+ detection methods

圖6 比率熒光傳感器對不同質量濃度Hg2＋標準溶液（0～0.016 mg/L）熒光光譜的響應（A）和比率熒光信號與Hg2＋質量濃度關系圖（B）Fig.6 Fluorescence emission spectra of the sensor in the presence of various concentrations of Hg2+ (from 0 to 0.016 mg/L) (A) and linear plot of (I670/I470) versus Hg2+ concentration (B)

2.5 比率熒光傳感器對Hg2+的選擇性

探究比率熒光傳感器對其他金屬離子與Hg2+的響應情況，以便考察比率熒光傳感器對Hg2+的選擇性。如圖7所示，在其他實驗相同條件下，選擇100 nmol/L Mn2+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+、Ba2+、Na+以及無金屬離子的空白組與50 nmol/L Hg2+進行對比實驗，發(fā)現(xiàn)濃度僅為50 nmol/L的Hg2+能明顯猝滅670 nm波長處Lys-AuNCs的熒光峰值。濃度更高的其他金屬離子（100 nmol/L）與空白組響應情況相接近，猝滅670 nm波長處的熒光能力較弱。由此可說明，其他金屬離子對該傳感器檢測Hg2+的影響很小，即本研究所建立的比率熒光傳感器對Hg2+具有較好的選擇性。

圖7 比率熒光傳感器對不同金屬離子的選擇性（50 nmol/L Hg2＋和100 nmol/L其他金屬離子）熒光光譜圖（A）及比率熒光信號響應情況（B）Fig.7 Fluorescence emission spectra of the sensor (A) and I670/I470 values observed (B) in the presence of 50 nmol/L of Hg2+ or 100 nmol/L of different other metal ions

2.6 實際樣品中Hg2+的檢測

為考察所建立比率熒光傳感器在實際樣品檢測中的準確性，分別選取湖水、自來水、礦泉水為實際樣品，探究該比率熒光傳感器對這些樣品中Hg2+的響應情況。將Hg2+標準溶液添加前后的水樣經(jīng)過簡單處理分別用所建立的比率熒光傳感器進行測定。如表2所示，該傳感器在3 種實際水樣中也能對Hg2+產(chǎn)生準確、靈敏的響應，回收率在94.3%～115.0%之間，變異系數(shù)不大于10.3%，表明本研究所建立的Hg2+比率熒光傳感器可用于實際樣品的檢測。

表2 實際樣品中Hg2＋的檢測結果與加標回收率（n=3）Table 2 Recoveries of Hg2+ spiked in different water samples (n = 3)

3 結 論

本研究利用對Hg2+穩(wěn)定的Si-CDs和對Hg2+敏感響應的Lys-AuNCs分別作為參比熒光團與響應熒光團，構建了一種單一激發(fā)雙發(fā)射的比率熒光探針實現(xiàn)快速、準確、靈敏地對Hg2+進行測定。在最優(yōu)條件下，檢測線性范圍為0～0.016 mg/L，檢出限為0.001 mg/L。GB 2762—2017《食品中污染物限量本標準》規(guī)定飲用水中汞限量為0.001 mg/L，因此，該感器的靈敏度滿足國標限量標準的需求。在實際湖水、自來水、礦泉水3 種水樣的加標回收實驗，回收率范圍在94.3%～115.0%之間。綜上可知，本研究所建立Hg2+比率熒光傳感器具有較好的檢測性能與實際應用價值。