腸道集聚性大腸埃希氏菌菌體和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

趙琳娜，劉 娜，王學(xué)碩，崔生輝*

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

致瀉性大腸埃希氏菌引起的腹瀉是世界范圍內(nèi)存在的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。根據(jù)毒力因子、致病機(jī)理和流行病學(xué)特征，致瀉性大腸埃希氏菌可分為5 類(lèi)：腸道致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenicEscherichia coli，EPEC）、腸道產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌（enterotoxigenicE.coli，ETEC）、腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagicE.coli，EHEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasiveE.coli，EIEC）以及腸道集聚性大腸埃希氏菌（enteroaggregativeE.coli，EAEC）[2-3]。EAEC是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的致瀉性大腸埃希氏菌，已在世界各國(guó)引起散發(fā)或暴發(fā)[4]。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院已將EAEC歸為B類(lèi)生物恐怖病原體[5]。我國(guó)各省市致瀉大腸埃希氏菌流行特征分析結(jié)果顯示，EAEC在食源性致瀉大腸埃希氏菌中最常見(jiàn)，為主要毒力基因型[6-9]。因此食品中EAEC快速準(zhǔn)確的檢測(cè)工作對(duì)預(yù)防和控制由其引起的細(xì)菌性食物中毒事件有著非常重要的作用。

EAEC傳統(tǒng)的鑒定方法包括分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)鑒定和16S rDNA鑒定等[10]，這些方法實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且存在一定的局限性。目前聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)由于其靈敏度高、可靠性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于EAEC的檢測(cè)中[11-13]。GB 4789.6—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》[14]規(guī)定對(duì)生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落進(jìn)行集聚熱穩(wěn)定性毒素A基因（enteroaggregative heatstable enterotoxin A，astA）、集聚黏附菌毛調(diào)節(jié)基因（aggregative adhesive fimbriae regulator，aggR）、腸定植因子基因（protein involved in intestinal colonization，pic）3 個(gè)特征性基因的PCR鑒定，每次PCR需要使用EAEC標(biāo)準(zhǔn)菌株及其gDNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于復(fù)雜的食品基質(zhì)背景、培養(yǎng)基、試劑、DNA提取、人員操作等原因可直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以在檢測(cè)過(guò)程中需要穩(wěn)定的微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制，從而保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和有效性[15]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其基因組DNA（genomic DNA，gDNA）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鮮見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。

自21世紀(jì)初，基因測(cè)序技術(shù)取得突破性進(jìn)展[16]，基因測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)量、測(cè)序速度和費(fèi)用都得到大幅度改觀[17]。在國(guó)內(nèi)，單個(gè)微生物基因組測(cè)序的費(fèi)用也從數(shù)萬(wàn)元降低至目前幾百元。通過(guò)對(duì)食源性微生物基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝，能夠獲得90%以上的細(xì)菌DNA信息，包括種屬、耐藥基因、毒力因子、轉(zhuǎn)移元件等信息，可對(duì)多個(gè)細(xì)菌間的基因組信息進(jìn)行比對(duì)分析，在細(xì)菌鑒定、耐藥機(jī)制和溯源等研究中發(fā)揮重要的作用。

本研究針對(duì)目前檢驗(yàn)領(lǐng)域需求，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)EAEC CMCC 44841進(jìn)行全基因組測(cè)序，研制基因組信息背景清晰、穩(wěn)定性良好的即用型EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可應(yīng)用于我國(guó)食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)。從而促進(jìn)我國(guó)食品安全檢測(cè)水平的進(jìn)一步提高，為及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EAEC CMCC 44841來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptose soya agar，TSA）美國(guó)BD公司；生理鹽水 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302） 天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP 日本Takara公司；瓊脂糖 美國(guó)Oxoid公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FreeZone12L冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Labconco公司；PL2002電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Thermo1389生物安全柜、205050GC恒溫培養(yǎng)箱、LEGEND Micro21R冷凍離心機(jī)、NanoDrop 2000微量核酸蛋白測(cè)定儀、Qubit熒光定量測(cè)定儀 美國(guó)Thermo公司；FORMA恒溫?fù)u床 西班牙IUL公司；VITEKCompact 2自動(dòng)微生物分析系統(tǒng) 法國(guó)梅里埃公司；Autoflex飛行時(shí)間質(zhì)譜 德國(guó)Bruker公司；C1000 PCR儀、紫外凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，具體方法和步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。所提取的菌株DNA利用核酸蛋白分析儀和Qubit熒光定量測(cè)定儀檢測(cè)基因組DNA的純度和濃度，并送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。

1.3.2 細(xì)菌全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

經(jīng)電泳檢測(cè)合格的DNA樣品用超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約為350 bp的片段，進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和測(cè)序接頭、純化和PCR擴(kuò)增等步驟完成文庫(kù)制備。使用Qubit2.0和Agilent2100對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行初步定量和插入片段檢測(cè)。插入片段符合預(yù)期后，使用Q-PCR對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。文庫(kù)檢測(cè)合格后采用北京諾禾致源科技股份有限公司的Illumina NovaSeq 6000測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行全基因組測(cè)序。對(duì)Illumina測(cè)序平臺(tái)的數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量過(guò)濾，包括去除無(wú)效信號(hào)、去除測(cè)序接頭和錨定引物序列、去除復(fù)雜序列和重復(fù)序列，從而獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)（Clean Data）進(jìn)行后續(xù)分析。使用SOAPdenovo軟件進(jìn)行組裝，用RAST對(duì)組裝序列進(jìn)行注釋?zhuān)╤ttp://rast.nmpdr.org）。使用基因組流行病學(xué)中心（Center for Genomic Epidemiology，CGE）的默認(rèn)閾值，對(duì)組裝序列進(jìn)行鑒定（http://www.genomicepidemiology.org），利用美國(guó)病原體系統(tǒng)資源整合中心（Pathosystems Resource Integration Center，PATRIC）工作系統(tǒng)對(duì)基因組組成進(jìn)行分析（https://www.patricbrc.org/），利用CGE VirulenceFinder在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)血清分型、MLST分型和毒力基因進(jìn)行分析。

1.3.3 特征性基因PCR檢測(cè)

將提取的CMCC 44841基因組DNA定量后，分別進(jìn)行10 倍梯度稀釋?zhuān)玫?0-1、10-2、10-3、10-4系列濃度，參照GB 4789.6—2016[14]中引物序列和PCR檢測(cè)方法，進(jìn)行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴(kuò)增和靈敏度檢測(cè)，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生產(chǎn)制備

1.3.4.1 EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

取CMCC 44841一代新鮮培養(yǎng)物，劃線(xiàn)接種于TSA平板，36 ℃培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌棉簽從平板上刮取菌落，加入到含有海藻糖和胎牛血清的凍干保護(hù)劑中，渦旋混勻，用移液槍吸取20 μL在低溫下速凍成球，然后于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。將凍干后的菌球置于2 mL的西林瓶中，利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空壓蓋密封。最終制備成EAEC含量為103CFU/樣品的菌球。

1.3.4.2 EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

將純度A260nm/A280nm為1.7的20 μg DNA加入到20 mL含有葡聚糖的凍干保護(hù)劑中，用移液槍吸取20 μL在低溫下速凍成球，然后于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，最終制備成含量為20 ng/樣品的菌球。將凍干后的菌球放入2 mL的西林瓶中，將膠塞虛掩的蓋在西林瓶上，然后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空壓蓋。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性測(cè)試

1.3.5.1 EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性測(cè)試

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性研究抽取樣品數(shù)量要求[18]，從制備的一批600 瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取20 瓶樣品，每瓶樣品充分溶于1 mL生理鹽水，使用螺旋涂布儀E50模式在TSA平板上進(jìn)行螺旋涂布，每個(gè)樣品2 個(gè)平行。36 ℃培養(yǎng)24 h后對(duì)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)CNAS-GL003[19]對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行單因子方差分析，評(píng)價(jià)樣品的均勻性。

1.3.5.2 EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性測(cè)試

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性研究抽取樣品數(shù)量要求[18]，從制備的一批300 瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取10 件樣品，向每瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品加入100 μL ddH2O，充分溶解，制備成20 ng/100 μL的DNA樣品，取2 μL作為模板，參照GB 4789.6—2016[14]中引物序列和PCR檢測(cè)方法，進(jìn)行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴(kuò)增。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)試

1.3.6.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性

將制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別存放于25 ℃和37 ℃條件下，EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)模擬實(shí)驗(yàn)周期為7 d，分別于第1、3、5、7天抽取3 個(gè)樣品，進(jìn)行含菌量測(cè)定。根據(jù)CNAS-GL003[19]中|x-y|≤0.3σ準(zhǔn)則對(duì)結(jié)果進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)模擬實(shí)驗(yàn)周期為14 d，分別于第1、3、5、7、14天抽取3 個(gè)樣品，對(duì)特征性基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，考察樣品的運(yùn)輸穩(wěn)定性。

1.3.6.2 貯藏穩(wěn)定性

將制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別于-20 ℃和4 ℃條件下保存2 個(gè)月。于4 ℃保存7、14 d和28 d，-20 ℃保存28 d和60 d，分別抽取3 個(gè)樣品進(jìn)行菌含量測(cè)定，于4 ℃和-20 ℃保存28、45 d和60 d分別抽取3 個(gè)樣品進(jìn)行特征性基因檢測(cè)，考察樣品的貯藏穩(wěn)定性。根據(jù)CNAS-GL003[19]中|x-y|≤0.3σ準(zhǔn)則對(duì)EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的協(xié)作驗(yàn)證

使用上述制備好的樣品，按照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作標(biāo)定實(shí)施細(xì)則，發(fā)給3 家實(shí)驗(yàn)室，代碼分別為A、B和C，每家實(shí)驗(yàn)室收到10 件樣品，參照協(xié)作驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書(shū)對(duì)樣品中EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)，包括菌落計(jì)數(shù)和特征性基因檢測(cè)。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用效果驗(yàn)證

根據(jù)GB 29921—2013《食品中致病菌限量》[20]，選擇熟肉制品、乳粉、腐乳、餅干和薯片5 種食品基質(zhì)共20 份樣品對(duì)EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用效果進(jìn)行驗(yàn)證，樣品信息見(jiàn)表1。先將EAEC 103CFU濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶于1 mL生理鹽水中，每件樣品各稱(chēng)取2 份，25 g/份，1 份正常檢驗(yàn)，1 份加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生理鹽水溶解溶液100 μL，根據(jù)GB 4789.6—2016[14]進(jìn)行操作。增菌后劃線(xiàn)分離平板觀察是否有典型菌落生長(zhǎng)，并進(jìn)行PCR確認(rèn)。

表1 食品樣品信息Table 1 Information about food samples used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

利用Nano Drop2000對(duì)提取的CMCC 44841基因組DNA進(jìn)行純度測(cè)定，A260nm/A280nm和A260nm/A230nm分別為1.70和2.37。利用Qubit熒光計(jì)測(cè)定EAEC DNA質(zhì)量濃度為65 ng/μL，提取的DNA的質(zhì)量濃度滿(mǎn)足全基因組測(cè)序和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備要求。

2.2 全基因組測(cè)序分析結(jié)果

利用二代高通量全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)CMCC 44841進(jìn)行序列測(cè)定。獲得的基因組序列信息結(jié)果通過(guò)生物信息學(xué)分析，CMCC44841基因組大小為5.057 285 Mb，其N(xiāo)50重疊大小為114 319 bp，共有121 個(gè)長(zhǎng)度從305 600 bp到505 bp不等的拼接序列，GC含量為50.6%，編碼區(qū)基因5 173 個(gè)。利用CGE網(wǎng)站KmerFinder對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定，結(jié)果顯示CMCC 44841鑒定為大腸埃希氏菌（E.coli），具體鑒定結(jié)果如表2所示。同時(shí)CGE網(wǎng)站分析CMCC 44841血清預(yù)測(cè)結(jié)果為O127:H21，MLST為ST40型。PATRIC和CGE毒力基因分析顯示，CMCC44841攜帶aggR、astA、pic毒力基因外，還預(yù)測(cè)到含有aap、aar、afaD、agg3C、lpfA、ompT等毒力基因，詳見(jiàn)表3。CMCC 44841全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為SRR12278211。

表2 利用KmerFinder對(duì)CMCC 44841菌種屬鑒定結(jié)果Table 2 Identification of CMCC 44841 with KmerFinder

表3 利用VirulenceFinder對(duì)CMCC 44841毒力基因預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Virulence gene prediction of CMCC 44841 using CGE

2.3 特征性基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

按照GB 4789.6—2016[14]的方法對(duì)CMCC 44841分別進(jìn)行astA、aggR、pic特征性基因檢測(cè)。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，提取的CMCC 44841 DNA分別擴(kuò)增出102、400 bp和1 111 bp長(zhǎng)度片段。不同濃度DNA擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，0.1、0.01、0.001 ng/μL的DNA均有特征性基因擴(kuò)增產(chǎn)物，選擇CMCC 44841 DNA凍干小球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用時(shí)PCR的模板量不小于0.1 ng/μL，按照20 ng/球進(jìn)行DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。

圖1 不同濃度DNA astA、aggR和pic基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of astA, aggR and pic at different concentrations

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

隨機(jī)抽取的20 瓶EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)結(jié)果如表4所示，所有樣品菌落數(shù)均在103CFU數(shù)量級(jí)，數(shù)值符合正態(tài)分布。單因素方差分析結(jié)果顯示，制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組內(nèi)和組間無(wú)顯著性差異，即樣品符合均勻性要求（F＝1.59＜F臨界值＝2.137，P＞0.05）。

表4 EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)計(jì)數(shù)結(jié)果Table 4 Counting results of EAEC cell reference material

隨機(jī)抽取10 瓶EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，10 個(gè)gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的astA、aggR、pic基因均得到清晰的擴(kuò)增條帶（圖2）。

圖2 gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均一性aggR基因（A）、astA基因（B）和pic基因（C）PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PCR products of aggR (A), astA (B) and pic (C) genes with uniformity in gDNA reference material

2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性結(jié)果

將所制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別存放于25 ℃和37 ℃條件下，于第1、3、5、7天各抽取3 個(gè)樣品，通過(guò)螺旋涂布進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。如表5、6所示，EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在25 ℃條件下保存7 d穩(wěn)定性良好，在37 ℃環(huán)境下5 d內(nèi)穩(wěn)定情況良好，第7天活菌數(shù)量下降出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象，但菌含量仍能維持在103CFU/樣品水平，即滿(mǎn)足定性樣品的要求。

表5 EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)模擬運(yùn)輸條件25 ℃穩(wěn)定性結(jié)果Table 5 Stability of EAEC cell reference material during simulated transportation at 25 ℃

表6 EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)模擬運(yùn)輸條件37 ℃穩(wěn)定性結(jié)果Table 6 Stability of EAEC cell reference material during simulated transportation at 37 ℃

對(duì)分別在25 ℃和37 ℃條件下存放14 d的3 個(gè)EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品進(jìn)行特征性基因檢測(cè)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3所示，astA、aggR、pic基因均能擴(kuò)增出清晰的條帶。說(shuō)明EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在25 ℃和37 ℃條件下保存14 d穩(wěn)定性良好。

圖3 gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)25 ℃和37 ℃保存14 d astA、aggR基因（A）和pic基因（B）PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of PCR products of astA, aggR (A) and pic (C) genes in gDNA reference materials stored at 25 or 37 ℃ for 14 d

上述數(shù)據(jù)表明，EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在非高溫季節(jié)，可以常溫運(yùn)輸，而在高溫季節(jié)可以采用泡沫箱加冰袋的方式進(jìn)行低溫運(yùn)輸。

2.5.2 貯藏穩(wěn)定性結(jié)果

通過(guò)與第0天的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，由表7可以看出，EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃保存60 d復(fù)蘇率為100%，表明-20 ℃可以滿(mǎn)足穩(wěn)定性要求。4 ℃條件下，保存14 d復(fù)蘇率為95.6%，28 d復(fù)蘇率為78.2%，樣品中菌含量仍保持在103CFU/樣品水平，樣品穩(wěn)定，表明4 ℃可以作為短期貯藏條件。

表7 EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)貯藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Storage stability of EAEC cell reference material

對(duì)分別在-20 ℃和4 ℃條件下存放60 d的3 個(gè)EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品進(jìn)行特征性基因檢測(cè)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示，EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃和4 ℃條件下保存60 d均能對(duì)astA、aggR、pic基因擴(kuò)增出特異性條帶。說(shuō)明-20 ℃和4 ℃滿(mǎn)足gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的貯藏條件。

圖4 gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)－20 ℃和4 ℃保存60 d astA、aggR基因（A）和pic基因（B）PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis results of PCR products of astA, aggR (A) and pic (B) genes in gDNA reference materials stored at ?20 or 4 ℃ for 60 days

2.6 協(xié)作驗(yàn)證結(jié)果

EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過(guò)3 家協(xié)作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)定，測(cè)定結(jié)果如表8所示，EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)樣品菌含量均為103CFU/樣品，與研制的目標(biāo)值一致。生化和特征基因PCR鑒定結(jié)果符合EAEC的特征。同時(shí)EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征基因PCR鑒定結(jié)果也符合實(shí)驗(yàn)要求。

表8 EAEC協(xié)作標(biāo)定結(jié)果Table 8 Results of collaborative interlaboratory calibration for EAEC cell reference material

2.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用效果驗(yàn)證

選擇熟肉制品、乳粉、腐乳、餅干和薯片5 種食品基質(zhì)共20 份樣品對(duì)EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用效果進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)結(jié)果顯示，20 件樣品正常檢驗(yàn)（作為本底對(duì)照）分離平板上未見(jiàn)可疑菌落，而加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品在分離平板上均有可疑菌落生長(zhǎng)，并通過(guò)PCR檢測(cè)擴(kuò)增得到相應(yīng)的特征基因條帶，與gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)擴(kuò)增條帶大小一致。結(jié)果表明，研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適用于食品中EAEC檢驗(yàn)的質(zhì)控需求。

3 討論和結(jié)論

準(zhǔn)確快速的檢測(cè)技術(shù)是及時(shí)有效控制和預(yù)防由病原菌引起的食源性疾病的重要手段。目前食品和腹瀉病人中致瀉大腸埃希氏菌的檢測(cè)越來(lái)越受到關(guān)注和重視[21-23]。由于致瀉大腸埃希氏菌種類(lèi)繁多的血清群/型，給檢驗(yàn)工作帶來(lái)很多挑戰(zhàn)[24]。快速準(zhǔn)確的檢驗(yàn)工作不僅依賴(lài)于不同技術(shù)的檢驗(yàn)方法，還需要科學(xué)使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制已有較大的發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)菌株多來(lái)自美國(guó)菌種保藏中心，而且對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定方式多為傳統(tǒng)的生化反應(yīng)[25-28]。目前對(duì)于具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)而且具有清晰全基因組序列信息的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究還是空白。本研究采用EAEC標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，分離自我國(guó)腹瀉病人，具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。

全基因組測(cè)序技術(shù)在微生物領(lǐng)域研究中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[29-30]。隨著測(cè)序技術(shù)所獲得數(shù)據(jù)量的突破性進(jìn)展，測(cè)序速度和費(fèi)用得到大幅度改觀[31]。而且二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件的日趨完善，非生物信息學(xué)專(zhuān)業(yè)人員可以使用網(wǎng)頁(yè)類(lèi)型分析工具對(duì)微生物基因組測(cè)序數(shù)據(jù)完成微生物遺傳特征、溯源等信息分析。Rapid Annotation using Subsystem Technology（RAST，http://rast.nmpdr.org）[32]能夠快速注釋基因組信息、CGE（https://cge.cbs.dtu.dk/）網(wǎng)站擁有方便快捷的獨(dú)立數(shù)據(jù)分析工具，可以進(jìn)行種屬鑒定、耐藥基因、毒力因子、質(zhì)粒分型以及菌株分子分型等特征分析[33]。這些網(wǎng)頁(yè)類(lèi)型分析工具可提供更為直觀的用戶(hù)界面和簡(jiǎn)便的操作環(huán)境[34]。本研究利用RAST、PATRIC、CGE對(duì)EAEC進(jìn)行了種屬鑒定、血清分型和除astA、aggR、pic特征基因之外的毒力基因分析，為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供科學(xué)依據(jù)。

本研究根據(jù)GB 4789.6—2016中的引物序列對(duì)EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了特征性基因擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，astA、aggR和pic基因得到清晰的擴(kuò)增條帶，說(shuō)明PCR擴(kuò)增結(jié)果和全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)。在傳統(tǒng)的生化方法基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)對(duì)毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增，是提高EAEC檢出率的有力手段[35]，同時(shí)也為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢驗(yàn)提供了快速準(zhǔn)確的方法。

目前研究中報(bào)道的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以粉末形式凍干[36]，本研究制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均以小球的形式進(jìn)行凍干，相比較粉末形式凍干，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用避免了由于粉末開(kāi)蓋帶來(lái)的污染和質(zhì)粒污染，并且省去離心步驟，操作更加方便，同時(shí)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)易于溶解，計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確。

本研究制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好，經(jīng)單因素方差分析符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。經(jīng)過(guò)25、37 ℃運(yùn)輸穩(wěn)定性測(cè)試，7 d仍能保持樣品中菌含量在103CFU/樣品水平，可以保證樣品在非極端的高溫天氣下運(yùn)輸不受影響，而且在-20 ℃條件下可以長(zhǎng)期貯存。對(duì)于EAEC gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同樣具有很好的穩(wěn)定性。考慮到食品基質(zhì)的復(fù)雜性，本研究選用5 種不同的食品基質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品均能檢測(cè)到EAEC，說(shuō)明研制的菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適用于食品中EAEC的檢驗(yàn)，滿(mǎn)足質(zhì)控要求。

綜上所述，EAEC是造成人體中重度腹瀉的重要病原菌之一，開(kāi)展食品中EAEC檢測(cè)工作對(duì)維護(hù)人類(lèi)健康意義重大。本研究研制的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和全基因組數(shù)據(jù)的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和穩(wěn)定性良好，可用于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制及實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，為EAEC的檢驗(yàn)工作提供了有效參考手段，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性。