1 株產甘露聚糖酶嗜熱真菌的鑒定、酶學性質表征及轉錄組學分析

談蘇慧，盧海強，陳 偉，張莉娟，田洪濤，谷新晰*

（河北農業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannanase，EC 3.2.1.78）是內切水解酶，可隨機水解甘露聚糖分子內部的β-1,4糖苷鍵，將甘露聚糖降解為葡萄糖、甘露寡糖等低聚糖[1-2]。β-甘露聚糖酶在食品行業(yè)應用前景廣闊，其可降解角豆膠[3]、瓜兒豆膠[4]、魔芋膠[5]等富含甘露聚糖的植物膠生產甘露寡糖。甘露寡糖具有促進腸道有益菌生長、調節(jié)腸道黏膜免疫、改善腸道菌群環(huán)境等作用，是一種新型的優(yōu)質益生元[6-7]。β-甘露聚糖酶還可用于降低咖啡、巧克力及可可液等的黏性以利于其進一步加工[8]。Suryawanshi等[9]發(fā)現甘露聚糖酶的多酶系統(tǒng)固定化后，β-甘露聚糖酶可在澄清蘋果汁、獼猴桃汁、橙汁、桃汁等果汁的同時，增加其還原糖含量。Singh等[10]的研究結果表明β-甘露聚糖酶可高效去除含甘露聚糖食物引起的污漬。崔婷婷等[11]研究發(fā)現在面團中添加β-甘露聚糖酶處理15 min的體積分數為2.0%魔芋葡甘聚糖，能夠顯著抑制二硫鍵的斷裂和二級結構的變化，防止面團的水分散失，維持面團的拉伸能力。Comfort等[12]報道的甘露聚糖酶多為最適反應溫度在50～60 ℃之間的中低溫酶，無法滿足工業(yè)生產中較高的溫度要求。因此，熱穩(wěn)定性較好的嗜熱甘露聚糖酶逐漸成為新的研究熱點[13]。

嗜熱真菌能在45 ℃以上正常生長，且在19 ℃無法生長[14]，嗜熱真菌分泌的酶類大部分為嗜熱酶[15]。嗜熱甘露聚糖酶具有熱穩(wěn)定性好、可提高反應的催化效率、高溫時底物黏度低、促進酶與底物的結合、具有催化等優(yōu)勢[16]。迄今為止，獲得的近30 種嗜熱甘露聚糖酶僅有少部分來源于嗜熱真菌[17]，如來自黑曲霉Aspergillus nigerBK01的酶Man BK[18]、來自小巢狀曲霉Aspergillus nidulansXZ7的酶Man5XZ7[19]和來自籃狀菌Talaromyces leycettanusJCM12802的酶Man5A[16]。因此，分離鑒定嗜熱真菌并獲得嗜熱甘露聚糖酶，對提高微生物資源利用率以及解決甘露聚糖酶工業(yè)應用受限等問題有較高的理論價值和指導意義。

碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）是參與復雜碳水化合物合成或分解蛋白酶的統(tǒng)稱，具有降解、修飾及生成糖苷鍵的功能[20]。根據氨基酸序列相似性、蛋白結構及催化功能的不同，主要分為5 類催化酶及一類非催化模塊，催化酶分別為碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）、糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）、糖基轉移酶（glycosyltransferases，GTs）、多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PLs）、輔助氧化還原酶（auxiliary activities，AAs）、非催化模塊即碳水化合物結合模塊（carbohydrate-binding modules，CBMs）[21]。近幾年，以轉錄組學測序技術為基礎，探究真菌編碼碳水化合物酶基因的數量以及種類，并以此為指標篩選高效產碳水化合物酶的菌株，成為分離篩選優(yōu)良產酶菌株新依據。

本研究以大曲中分離、篩選的嗜熱真菌GZFH7為研究對象，對該菌株進行生物學鑒定，并對其誘導的嗜熱甘露聚糖酶的酶學性質進行研究。同時，利用轉錄組學探究該菌株產碳水化合物活性酶的性能，為進一步開發(fā)利用該菌株提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株GZFH7篩選自貴州醬香型大曲，并由本實驗室于4 ℃保存；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基 上海博微生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、真菌通用引物ITS1、ITS4、PCR mix、ddH2O 北京博邁德基因技術有限公司；乳酸酚棉藍染色液 青島海博生物技術有限公司；Oligo（dT）磁珠 無錫百邁格生物科技有限公司。。

基礎鹽溶液：(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2的質量濃度分別為1.00、1.00、0.01、5.00、0.20 g/L。

魔芋發(fā)酵培養(yǎng)基：基礎鹽溶液中加入魔芋膠、酵母浸粉質量濃度均為3.00 g/L；多碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：基礎鹽溶液中加入魔芋膠、麩皮、酒糟質量濃度均為1.00 g/L。

1.2 儀器與設備

MJX-250B-Z恒溫霉菌培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；MODEL YS100電子顯微鏡 日本Nikon公司；TU-1810PC紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；NDJ-5S數字式黏度計 上海佑科儀器儀表有限公司；CR-G立式高速低溫離心機日本Hitachi公司；Biometra Tprofessional聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

取研碎的大曲樣品10.0 g于100 mL無菌水中，于37 ℃、150 r/min搖床振蕩2 h。靜置后取上清液，用無菌水適當稀釋，涂布于PDA培養(yǎng)基，45 ℃倒置培養(yǎng)，挑取單菌落點植于PDA培養(yǎng)基上，分離、純化得到的單一菌株保藏于麩皮管中，4 ℃存放、備用。

1.3.2 粗酶液的制備

將保藏于麩皮管的GZFH7接種于PDB活化培養(yǎng)基中，45 ℃搖床培養(yǎng)1 d。按1%的接菌量從活化培養(yǎng)基中吸取菌液加入魔芋發(fā)酵培養(yǎng)基中，45 ℃搖床培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為粗酶液，4 ℃?zhèn)溆弥苽浜玫拇置敢骸?/p>

1.3.3 菌株的鑒定

1.3.3.1 菌株嗜熱性鑒定

將菌株GZFH7點植于PDA平板中心處，分別于19、45 ℃倒置培養(yǎng)，觀察并記錄菌株的生長情況。

1.3.3.2 菌落形態(tài)特征觀察

采用點植法將GZFH7接種于PDA平板中，45 ℃倒置培養(yǎng)，觀察菌落的形狀、大小、顏色及生長狀況等情況并進行記錄，對照真菌鑒定手冊[22]，初步確定菌株的種屬地位。

采用棉藍染色法[23]進行制片觀察：于潔凈的載玻片中央滴一滴乳酸酚棉藍染色液，用接種環(huán)挑取GZFH7平板中的少量帶有孢子的菌絲置于染液中，細心地將菌絲挑散開，加蓋玻片，在電子顯微鏡40 倍鏡觀察霉菌形態(tài)，記錄菌株菌絲孢子、孢子囊以及孢子梗的形態(tài)特征。

1.3.3.3 菌株的分子鑒定

采用CTAB法提取菌株GZFH7的基因組DNA；獲得的基因組DNA經ITS序列PCR擴增后，得到的PCR產物由華大基因科技服務有限公司進行測序。將獲得的測序結果提交NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.gov/blast/）進行BLAST同源性分析，采用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹并分析。

1.3.4 生長曲線的測定

采用菌落直線生長法測定菌株GZFH7的生長曲線[23]，將菌株GZFH7點植于PDA平板中心處，45 ℃倒置培養(yǎng)，分別在6、11、23、25、29、36、48、54、56 h（菌落長滿整個平板）測其菌落直徑，繪制菌株的生長曲線。

1.3.5 甘露聚糖酶活力的測定

參考Miller[24]的3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）方法。取100 μL適當稀釋酶液和900 μL角豆膠（底物由pH 5.0、50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制、體積分數0.5%），以甘露聚糖酶最適反應溫度（1.3.6.1節(jié)方法）進行水浴反應10 min后，加入1.5 mL DNS終止反應。對照則在加入1.5 mL DNS后，補加100 μL稀釋酶液。沸水浴5 min后冷卻至室溫，在540 nm波長處測定吸光度。

酶活力單位（U）：以每分鐘生成1 μmol甘露糖所需的酶量定義為1 U。

1.3.6 酶學性質分析

1.3.6.1 最適反應溫度的測定

酶液與底物在不同溫度（20、30、40、50、60、70、80、90 ℃）進行反應，按1.3.5節(jié)的方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，測定酶的最適反應溫度。

1.3.6.2 最適反應pH值的測定

在最適反應溫度，酶液與不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）的底物進行反應，按照1.3.5節(jié)方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，測定酶的最適反應pH值。

1.3.6.3 溫度穩(wěn)定性的測定

在最適反應pH值，按照1.3.6.1節(jié)的方法測酶液在最適反應溫度，及最適反應溫度浮動10 ℃處理不同時間（0、2、5、10、20、30 min和60 min）的酶活力，以最高酶活力為100%，研究甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.6.4 pH值穩(wěn)定性的測定

用不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）的緩沖液稀釋酶液后，冰浴1 h。最適反應溫度按1.3.5節(jié)的方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，研究甘露聚糖酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.7 酶解產物黏度的測定

粗酶液與體積分數1%魔芋膠底物1∶2（V/V），70 ℃水浴反應1 h后，迅速冷卻至室溫，測其黏度。通過比較滅活酶液與正常酶液反應產物的黏度差異，反映甘露聚糖酶降解甘露聚糖酶的能力大小。

1.3.8 平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）的測定及計算

聚合度是指組成寡糖的單糖單位的個數，mDP越接近于1則底物水解越徹底。直接還原糖與總還原糖參照Somogyi等[25]的方法測定，mDP按下式計算：

式中：C1、C2分別為酶解液中總糖和還原糖的質量濃度/（mg/mL）。

1.3.9 菌株GZFH7的碳源譜測定分析

不同碳源固體培養(yǎng)基的配制參照Hüttner等[26]的方法，將菌株點分別植于含有不同單一碳源（果膠、纖維素、木聚糖、幾丁質、可溶性淀粉、殼聚糖、魔芋精粉）的固體培養(yǎng)基上，相同條件培養(yǎng)相同時間，以PDA平板作為對照，觀察菌株GZFH7的生長狀況。

1.3.10 菌株GZFH7的轉錄組學分析

菌株GZFH7接入多碳源發(fā)酵培養(yǎng)基，45 ℃搖床培養(yǎng)3 d后收集菌體。采用Trizol法提取總RNA，檢測其濃度及純度，完整性采用RNA專用瓊脂糖電泳或者Agilent 2100 Bioanalyzer進行測定、分析。通過Oligo（dT）磁珠富集總RNA中帶有polyA結構的mRNA，采用離子打斷的方式，將RNA打斷約長度為300 bp的片段，并以此為模板構建表達文庫。

采用PCR擴增進行文庫片段富集，之后根據片段長度進行文庫選擇，文庫長度在450 bp。通過Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫進行質檢，再對文庫總濃度及有效濃度進行檢測。根據文庫的有效濃度及文庫所需數據量，將含有不同Index序列的文庫按比例進行混合。混合文庫統(tǒng)一稀釋到2 nmol/L通過堿變性，形成單鏈文庫。

采用第2代測序技術，基于Illumina HiSeq測序平臺，對這些文庫進行雙末端測序，獲得長度約380 bp測序reads。對獲得的原始測序序列進行分析，去除帶接頭、長度小于50 bp、序列平均質量低于Q20的Reads。對得到的高質量序列進行從頭拼接得到轉錄本序列。對轉錄本進行聚類，挑選最長的轉錄本作為Unigene，最后用Unigene進行后續(xù)無參轉錄組分析，并依據CAZymes數據庫（http://www.cazy.org/）分類標準，對測序數據進行統(tǒng)計分析。

1.4 數據分析及處理

每次實驗重復測定3 次，利用Excel和SPSS19.0軟件對測定結果進行統(tǒng)計分析，數據結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

在19 ℃培養(yǎng)3 d，菌株GZFH7幾乎不生長。45 ℃培養(yǎng)3 d后，該菌株生長旺盛，菌絲如圖1A所示，可鋪滿整個平皿。生長初期菌落呈白色絨毛狀，后期變成灰褐色厚氈狀，且菌落表面粗糙。如圖1B所示，顯微鏡可觀察到菌絲有較多分支，且匍匐絲彼此有間隔，囊軸呈球形，孢囊孢子的形狀有球形，橢圓形以及其他形狀。對菌株GZFH7的ITS PCR產物測序結果進行BLAST比對，結果如圖1C所示。菌株GZFH7與微小根毛霉（Rhizomucor pusillusT3B）的相似度為100%，并且位于進化樹的同一分支中，親緣關系相近，因此判斷該菌為微小根毛霉，命名為R.pusillusGZFH7。

圖1 菌株GZFH7菌落特征（A）、微觀鏡像（B）及系統(tǒng)發(fā)育樹（C）Fig.1 Colony characteristics (A), microscopic image (B), and phylogenetic tree (C) of strain GZFH7

2.2 菌株生長和產酶曲線的測定

如圖2所示，0～10 h為該菌株的生長停滯期，10～54 h之間菌株迅速生長，生物量迅速增加，此階段為快速生長期，此后隨培養(yǎng)時間延長，菌株的生物量趨于平穩(wěn)，即進入穩(wěn)定期。通過對GZFH7甘露聚糖酶活力測定分析，發(fā)現該菌在迅速生長期開始進行產酶，其產酶量隨菌株自身的生長而增加。直至穩(wěn)定期，甘露聚糖酶產酶量達到穩(wěn)定值9.5 U/mL，之后隨發(fā)酵時間延長，產酶量幾乎不再增加。因此，GZFH7菌株在45 ℃生長迅速，能夠短周期發(fā)酵生產甘露聚糖酶。

圖2 菌株GZFH7生長及產酶曲線Fig.2 Growth curve and enzyme production curve of strain GZFH7

2.3 酶學性質分析

由圖3A可知，菌株GZFH7誘導甘露聚糖酶的最適反應溫度為70 ℃，屬于嗜熱酶。在50～80 ℃范圍內，相對酶活力均可達到50%以上。如圖3B所示，甘露聚糖酶在60 ℃熱處理1 h，其相對酶活力在90%以上；70 ℃處理1 h，酶活力基本保持不變；當該酶在80 ℃處理30 min，能保持高于50%的酶活力，且在處理1 h后，依然能夠維持大約50%的酶活力。因此，菌株GZFH7所產的甘露聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性。如圖3C所示，甘露聚糖酶的最適反應pH值為5.0，底物pH 4.0～6.0范圍內時，能夠維持50%以上的酶活力，具有一定的pH值適應性。如圖3D所示，甘露聚糖酶在pH 2.0～12.0范圍內均表現一定的酶活力，在酸性范圍內（2.0＜pH＜6.0）酶活力較高，能夠維持70%以上的酶活力。酶活力隨pH值從5.0開始增加而降低。

圖3 甘露聚糖酶的酶學性質Fig.3 Enzymatic properties of mannanase

2.4 酶解產物黏度及mDP計算

經酶水解后，魔芋膠溶液的黏度由125 mPa·s降低為74 mPa·s，該結果表明菌株GZFH7產生的甘露聚糖酶可有效降解魔芋膠，使其由黏度較高的甘露聚糖降解為黏度較低的甘露低聚糖。測得酶解產物的直接還原糖質量濃度為0.39 mg/mL，總還原糖質量濃度為0.37 mg/mL，mDP為0.96，接近于1。該結果表明由菌株GZFH7產生的甘露聚糖酶可較徹底的降解魔芋膠，酶的水解能力較高。

2.5 菌株GZFH7的碳源譜分析

對菌株的碳源譜進行探究，根據其在不同碳源平板上的生長狀況，可對該菌株的產酶能力進行初步判斷。菌株GZFH7在不同碳源上的生長情況如圖4所示，45 ℃培養(yǎng)相同時間后，分別以果膠、纖維素、木聚糖、淀粉、魔芋精粉為單一碳源的生長情況分別如圖4B、C、D、F、H所示，菌株長勢良好，菌絲均布滿整個平板。以幾丁質、殼聚糖為單一碳源的生長情況分別如圖4E、G所示，菌株長勢較差。另外菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)基本一致，但產生色素情況差異較大。因此，菌株GZFH7碳源譜較廣，除了產生甘露聚糖酶外，還具有產果膠酶、幾丁質酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶等的可能性，是待開發(fā)利用的理想菌株，在食品工業(yè)酶制劑生產中有較大應用潛能。

圖4 菌株GZFH7在單一碳源平板上的生長情況Fig.4 Growth status of strain GZFH7 on single carbon source plates

2.6 菌株GZFH7的轉錄組學分析

2.6.1 Unigene的功能注釋分析

對Unigene進行基因功能注釋。在Nr數據庫中被注釋到的Unigene最多，共8 586 個，占總數的69.73%；其次為eggNOG數據庫和Swiss-Prot數據庫，分別為6 876、6 543 個，占總數的55.84%和53.13%；在數據庫Pfam中被注釋到的最少為1 588 個，僅占12.90%。778 個Unigene在所有的數據庫中都被注釋到，占總數的6.32%。

通過BLAST程序，將Unigene序列與Nr數據庫比對，共有8 586 個Unigene被注釋到，占總Unigene的69.73%。微小根毛霉GZFH7轉錄組測序組裝的Unigene與橫梗霉的相似性最多，為2 810 個，占32.75%；其次是傘狀毛霉菌，比對上的Unigene為2 262 個，占26.36%。值得注意的是，有19.75%的Unigene屬于其他序列，可能包含微小根毛霉與大多數物種不同的、自身特有的基因序列。

對微小根毛霉Unigene進行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能分析。有4 987 個Unigene被注釋到，共分為3 類41 個分支。統(tǒng)計每一類的基因數量發(fā)現，在細胞組成類的13 個分支中，涉及本轉錄組的Unigene最多，為11 124 個；生物過程類次之，為9 951 個；分子功能類最少，為5 452 個。其中細胞過程（2 645 個）、代謝過程（2 491 個）、催化活性（2 398 個）、細胞（2 367 個）、細胞組分（2 354 個）及連接（2 267 個）功能組涉及的Unigene較多，多細胞生物過程（8 個）、病毒（8 個）、病毒組分（8 個）、擬核（5 個）、通道調節(jié)活性（2 個）、蛋白標簽（2 個）及翻譯調節(jié)器活動（2 個）功能組涉及的Unigene較少。

經Unigene的京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫注釋分析，微小根毛霉GZFH7共有4 367 個Unigene在KEGG數據庫中被注釋到，占總Unigene的35.46%，共涉及代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、生物系統(tǒng)以及細胞過程中5 個一級層級。其中被注釋最多基因個數的為遺傳信息處理過程中的翻譯（494 個），其次是環(huán)境信息處理中的信號傳導（469 個）、代謝過程中的碳水化合物代謝（464 個）。生物系統(tǒng)過程中被注釋最多基因個數的為內分泌系統(tǒng)（232 個），細胞過程中被注釋最多基因個數的為運輸和分解代謝（313 個）。這些Unigene及其注釋信息為今后對菌株GZFH7的代謝途徑及相關功能基因的更進一步研究提供一定理論依據。

2.6.2 菌株CAZymes基因表達分析

通過對菌株GZFH7的轉錄組測序分析，共獲得該菌的4.38×107條reads，數據量為6.56×109bp，GC含量為46.80%，Q20值為97.36%，Q30值為92.95%，Clean Data值為93.76%。大部分堿基序列Q值分布在33～37之間，代表堿基質量良好，可進行后續(xù)分析。

以魔芋膠、麩皮以及酒糟的混合物為碳源時，菌株GZFH7共有253 個CAZymes基因表達，表達結果如圖5所示，其中包括31 個CEs基因，95 個GHs基因，104 個GTs基因，1 個PLs基因，16 個AAs基因以及6 個CBMs基因，與Hüttner等[27]對R.pusillusFCH 5.7的研究結果基本一致（12 個CEs基因、81 個GHs基因、77 個GTs基因、2 個PLs基因、11 個AAs基因、1 個CBMs基因）。其中GTs基因的表達最為豐富，約占CAZymes酶類表達總數的41.1%，約占總GTs家族的27.4%（29 種），主要包括纖維素合成酶、幾丁質合成酶、透明質酸合成酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、葡聚糖合成酶、乙酰氨基葡萄糖氨基轉移酶、磷酸合成酶等。其次為GHs基因，約占CAZymes酶類表達總數的37.5%，約占總GHs家族的22.2%（34 種），主要種類有幾丁質酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、海藻糖酶等。因此，菌株R.pusillusGZFH7酶系較豐富，是高效產碳水化合物活性酶的菌株。

圖5 R.pusillus GZFH7碳水化合物活性酶基因表達分布Fig.5 Distribution of CAZymes gene expression in R.pusillus GZFH7

3 討 論

微生物來源的甘露聚糖酶因其資源豐富、成本低、易培養(yǎng)、活性高等優(yōu)勢[17,28]，是科學研究以及工業(yè)應用的長期熱點。大曲所含微生物種類豐富，組成復雜，是極具利用價值的資源庫[29-30]。菌株GZFH7為大曲中分離、篩選的嗜熱真菌，通過對其菌落形態(tài)特征觀察以及ITS序列分子鑒定，判定該菌為微小根毛霉（R.pusillus），命名為R.pusillusGZFH7。現階段研究的較多的是利用微小根毛霉產凝乳酶[31]，除凝乳酶之外，還有其他一些已產生并鑒定編碼的酶，如聚半乳糖醛酸酶、糖淀粉酶、植酸酶和葡聚糖酶[27]。姚燦等[32]發(fā)現該嗜熱真菌能產生淀粉酶和酸性淀粉酶，具有應用于白酒生產的開發(fā)潛力。但利用微小根毛霉產甘露聚糖酶的研究鮮有報道。

目前，實際投入生產應用的甘露聚糖酶大多為中低溫酶且熱穩(wěn)定性較差，無法滿足工業(yè)生產過程中部分高溫環(huán)節(jié)對溫度的要求。如來源于密黏褶菌ATCC 11539的甘露聚糖酶，在50 ℃處理30 min，酶活力剩余60%[33]；來源于枯草芽孢桿菌MAFIC-S11的β-甘露聚糖酶Mann S，在60 ℃處理10 min，酶活力僅剩余10%[34]。菌株GZFH7所產的甘露聚糖酶最適反應溫度70 ℃，為嗜熱酶，并且該酶在70 ℃處理1 h仍能維持原酶活力不變，熱穩(wěn)定性優(yōu)良。該嗜熱甘露聚糖的最適pH值為5.0，與目前已獲得的大多數真菌來源的甘露聚糖酶的最適pH值一致[35-37]，且在pH 2.0～11.0的范圍內均表現較理想的pH值耐受性。該酶滿足工業(yè)生產需求，有效解決甘露聚糖酶的生產應用受限問題。魔芋膠溶液（1%）經酶解后黏度降低51 mPa·s，且酶解產物的mDP為0.96，而多數β-甘露聚糖酶水解魔芋膠、角豆膠等主要產生聚合度為2～5的甘露寡糖和一些帶半乳糖殘基側鏈的半乳甘露寡糖[38]。此結果很可能是由于粗酶液中的甘露聚糖酶與其中的多種酶協同作用而導致的。

菌株GZFH7在不同單一碳源的平板上45 ℃培養(yǎng)時均能生長，其中以果膠、纖維素、木聚糖、淀粉、魔芋精粉為單一碳源的平板長勢較好，以幾丁質、殼聚糖為單一碳源的平板，長勢較差，這可能是由于R.pusillusGZFH7中缺乏參與幾丁質、殼聚糖降解的基因導致的。經轉錄組分析，共發(fā)現253 個CAZymes基因表達，其中包括以纖維素合成酶、甘露糖基轉移酶、葡聚糖合成酶、乙酰氨基葡萄糖氨基轉移酶等為主的GTs，以及以幾丁質酶、半乳糖苷酶、淀粉酶等為主的GHs。綜上所述，菌株R.pusillusGZFH7碳源譜較廣，酶系豐富，是一株高效產碳水化合物活性酶的菌株，具有較高的研發(fā)利用價值。

4 結 論

本研究從大曲中分離嗜熱真菌微小根毛霉R.pusillusGZFH7，在對該菌株誘導的甘露聚糖酶進行相關性質研究的同時，對菌株進行轉錄組學的分析。微小根毛霉GZFH7為嗜熱真菌，其誘導的嗜熱甘露聚糖酶有較好的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。轉錄組學結果表明，菌株GZFH7有較好的產碳水化合物活性酶的能力。本研究不僅豐富嗜熱甘露聚糖酶資源，同時也為微小根毛霉GZFH7在酶制劑的開發(fā)與應用提供參考。