裝載α-生育酚的乳木果油固體脂質(zhì)納米顆粒的制備與表征

楊 振，李 曼，慕鴻雁，熊 柳，孫慶杰*

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000）

在過(guò)去的20 a不同類型的脂質(zhì)納米顆粒逐漸成為研究熱點(diǎn)，包括固體脂質(zhì)納米顆粒（solid lipid nanoparticle，SLN）、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、脂質(zhì)藥物結(jié)合物、脂質(zhì)納米膠囊[1]。重要的是，SLN已被引入脂溶性活性物質(zhì)的載體，并發(fā)展作為乳液、脂質(zhì)體和聚合物納米顆粒的替代載體[2]。SLN的粒徑范圍通常為50～1 000 nm。SLN是由乳化劑穩(wěn)定的固體脂質(zhì)組成的納米顆粒[3]。與其他的載體相比，SLN展示了靶向藥物遞送[4]、藥物的控釋和緩釋[5]、增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性[6]和改善藥物溶解度的潛力[7]。與以前的油基乳液相比，SLN的脂質(zhì)狀態(tài)在室溫條件下呈現(xiàn)固態(tài)[8]，SLN的脂質(zhì)成分可以是高純化的脂肪酸、甘油三酸酯或脂肪酸和甘油三酸酯的混合物[9]。前期研究表明，SLN通常用于包埋生物活性物質(zhì)[10]。在SLN中生物活性物質(zhì)的包封有利于保護(hù)生物活性物質(zhì)免受由外部因素（如熱、酸和氧）引起的降解損失[11]。此外，SLN的制備是基于通過(guò)高剪切均質(zhì)或超聲處理得到的固化納米乳液技術(shù)，因此，通常認(rèn)為SLN安全[12]。而且，SLN比脂質(zhì)體具有更高的穩(wěn)定性，并且能夠與親脂性的藥物相結(jié)合。另外，SLN的制備能夠進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[13]。

目前制備SLN的方法較多，如溶劑乳化或蒸發(fā)、超聲或高速均質(zhì)以及乳液的超臨界萃取，其中最重要的是高速均質(zhì)化的制備方法。用于制備SLN的脂質(zhì)包括蠟、類固醇、甘油單酸酯、甘油二酸酯、甘油三酸酯和脂肪酸。Hashem等[14]使用硬脂酸和甘油單硬脂酸酯復(fù)合作為脂質(zhì)基質(zhì)成功制備用于裝載脂溶性藥物的SLN。Botto等[15]利用雙硬脂酸甘油酯（Precirol ATO 5）作為脂質(zhì)基質(zhì)制備了用作基因治療的非病毒載體的SLN。Baek等[16]使用硬脂酸制備了用于裝載漢黃芩素的SLN。而且，研究報(bào)道了2 種或多種不同種類的脂質(zhì)組分已用于制備SLN。Dantas等[17]利用硬脂酸與蠟質(zhì)作為脂質(zhì)成分制備了SLN。另外，Xie Shuyu等[18]利用3 種脂肪酸（棕櫚酸、十四酸和硬脂酸）作為一種脂質(zhì)基質(zhì)成功制備了用于包埋活性物質(zhì)的SLN?？傊?，當(dāng)前大多數(shù)研究通過(guò)使用一種或多種脂質(zhì)成分制備SLN。然而，這些脂質(zhì)通常用于非食品領(lǐng)域中，并且具備不可食用的缺點(diǎn)。植物油脂由于其固有的生物降解性和低毒性通常認(rèn)為是綠色安全的。但是植物油脂在室溫下呈液態(tài)，因此很難用于制備SLN。鑒于先前研究中制備的SLN并非食品級(jí)，所以利用植物油制備SLN在食品領(lǐng)域非常重要。

從酪酯樹(shù)的種子中提取的乳木果油被廣泛用于西非和中非的食品、化妝品以及制藥業(yè)中[19]。乳木果油是純天然的綠色植物脂肪固體資源，由于乳木果油組分中存在酚類化合物，使其具有促進(jìn)表皮細(xì)胞再生、抗氧化和抗炎癥的功效[20-21]。由于乳木果油在室溫條件下表現(xiàn)出固態(tài)相性質(zhì)，所以在本研究中使用乳木果油作為固體脂質(zhì)基質(zhì)原料開(kāi)發(fā)食品級(jí)SLN。

本研究以乳木果油為原料，通過(guò)采用高速剪切均質(zhì)的方法制備不同油水比例的SLN。本實(shí)驗(yàn)中該制備方法的優(yōu)點(diǎn)是過(guò)程簡(jiǎn)單、制備時(shí)間短（均質(zhì)時(shí)間）以及基于較少的時(shí)間和材料具備大規(guī)模生產(chǎn)制備的潛力。該方法不同于在其他研究中報(bào)道的復(fù)雜制備方法[22-23]。在許多研究中SLN的制備是通過(guò)熱剪切均質(zhì)技術(shù)結(jié)合超聲處理方法，通常需要較長(zhǎng)的時(shí)間，包括均質(zhì)時(shí)間、超聲時(shí)間和緩慢冷卻時(shí)間。這些新開(kāi)發(fā)的食品級(jí)SLN將在食品、制藥和生物醫(yī)學(xué)行業(yè)中找到潛在的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳木果油 上海千峰化工有限公司；α-生育酚上海賢鼎生物科技有限公司；吐溫20、吐溫80 德國(guó)默克試劑公司；十三酸甲酯（純度＞99%）和52混合標(biāo)準(zhǔn)品（C4～C22） 西格瑪奧德里奇化學(xué)公司；其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

8890GC氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；D8-ADVANCE X射線衍射儀 德國(guó)布魯克AXS有限公司；LXJ-IIB離心機(jī) 上海安亭儀器公司；DSC1差示掃描量熱儀 美國(guó)梅特勒-托利多公司；FJ-200高速均質(zhì)機(jī)紹興上虞艾科儀器設(shè)備有限公司；ZSP動(dòng)態(tài)光散射儀馬爾文儀器有限公司；7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳木果油的氣相色譜分析

甲基化步驟：采用兩步甲基化方法，并進(jìn)行修改[24]。首先，將乳木果油加熱至40 ℃融化，之后將3 滴樣品加入15 mL試管中，然后在40 ℃恒溫條件下保持靜置。向試管中添加4 mL的異辛烷，將其充分搖勻，然后靜置2 min。之后將0.2 mL含有氫氧化鉀的甲醇溶液加入上述混合物中，混勻保持靜置2 min。從試管中取出1 mL上清液用于測(cè)定。

氣相色譜條件：色譜柱：聚二氰丙基硅氧烷強(qiáng)極性固定相（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；程序升溫：初始溫度150 ℃，保持1 min，以1.5 ℃/min升溫至220 ℃，之后保持1 min；檢測(cè)器溫度250 ℃；以氫作為燃料氣體，流速100 mL/min；氮?dú)庥米鬏d氣，流速15 mL/min；尾氣流速15 mL/min。脂肪酸測(cè)定分析基于制造商提供的等效鏈長(zhǎng)值以及不同標(biāo)準(zhǔn)品所獲得保留時(shí)間。通過(guò)高純度標(biāo)準(zhǔn)品分離出不同脂肪酸。

1.3.2 X射線衍射

乳木果油的結(jié)晶結(jié)構(gòu)通過(guò)X射線衍射儀測(cè)定。掃描速率1°/min，掃描范圍0°～60°。乳木果油的相對(duì)結(jié)晶度是通過(guò)在衍射圖上繪制峰的基線并通過(guò)使用JADE 5.0計(jì)算面積確定。相對(duì)結(jié)晶度按式（1）計(jì)算[25]：

式中：A1為X衍射曲線特征峰面積；A2為X衍射曲線上峰的總面積。

1.3.3 SLN的制備

乳木果油SLN通過(guò)高速熱均質(zhì)的方法制備[26]。乳木果油在高于其熔點(diǎn)溫度（36.20 ℃）的60 ℃條件下融化。在相同溫度下，吐溫80或吐溫20加入去離子水中溶解作為水相。然后，將水相加入脂相中，使用高速均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min均質(zhì)3 min形成O/W的乳液。將獲得的SLN在4 ℃進(jìn)行固化貯存。另外，α-生育酚添加到脂質(zhì)相中，包埋α-生育酚的SLN通過(guò)相同制備過(guò)程得到。制備不同SLN方案如表1所示。

表1 SLN和包埋α-生育酚SLN的制備配方Table 1 Formulations of SLNs and α-tocopherol-loaded SLNs%

1.3.4 顆粒粒徑的測(cè)定

參照吳紅艷等[27]的方法，使用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定分析乳木果油SLN的平均顆粒粒徑、聚合物分散指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）和粒徑分布。使用去離子水將SLN懸浮液稀釋20 倍，以避免多重散射效應(yīng)影響測(cè)定結(jié)果。在室溫25 ℃條件下進(jìn)行測(cè)定分析。

1.3.5 透射電子顯微鏡

參照Ge Shengju等[28]的方法，使用超純水將制備得到的SLN懸浮液稀釋20 倍，之后取一滴稀釋后的SLN懸浮液沉積在300 目的碳涂層銅網(wǎng)上。濾紙除去多余的液體，然后通過(guò)真空凍干以獲得樣品。透射電鏡的加速度電壓為80 kV。

1.3.6 差示量熱掃描儀測(cè)定

參照馮艷等[29]的方法，使用差示量熱掃描儀測(cè)定乳木果油的融化參數(shù)（如融化溫度和融化焓值）。差示量熱掃描儀在30 mL/min的氮?dú)庀逻\(yùn)行，并使用空的小鋁鍋?zhàn)鳛榭瞻讓?duì)照。差示量熱掃描的校準(zhǔn)方法是通過(guò)手動(dòng)校準(zhǔn)，包括基線優(yōu)化、熔爐的校準(zhǔn)、樣品溫度的校正、自動(dòng)掃描和熱流校準(zhǔn)[29]。乳木果油和固化后的SLN懸浮液加入到鋁鍋中，然后密封。掃描的溫度范圍和速率分別為0～100 ℃和10 ℃/min。通過(guò)軟件STARe分析記錄差示量熱掃描圖中的起始溫度（To）、峰值溫度（Tp）和終值溫度（Tc）。SLN的融化焓值（ΔH）是通過(guò)峰下基線與熱譜圖之間的面積積分進(jìn)行計(jì)算，單位為J/g。

1.3.7 包封率和載藥量的測(cè)定

參照Ali等[30]的方法，測(cè)定α-生育酚在乳木果油的SLN中的包埋率和載藥量。將3 gα-生育酚添加到30 g融化的液態(tài)脂質(zhì)中，接著按照上述制備步驟形成SLN后將SLN懸浮液離心（3 500×g，10 min），離心后收集上清液，并取1 mL稀釋10 倍進(jìn)行分析。分光光度計(jì)的波長(zhǎng)設(shè)置為285 nm。按式（2）、（3）計(jì)算α-生育酚的包埋率和載藥量[30]：

式中：C1為總α-生育酚質(zhì)量/g；C2為未包埋的α-生育酚質(zhì)量/g；M1為α-生育酚包埋量/g；M2為SLN中的α-生育酚質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 乳木果油的脂肪酸組成

如表2所示，乳木果油是由多不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸組成。乳木果油中的飽和脂肪酸主要由棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和花生酸（C20:0）組成。其中，硬脂酸的含量占全部脂肪酸的40.61%。不飽和脂肪酸主要由高含量的油酸（C18:1，45.47%）和少量的亞油酸（C18:2，7.33%）組成。乳木果油中高濃度的硬脂酸賦予乳木果油在室溫呈現(xiàn)固態(tài)的物理特性，這有利于SLN的制備。而且，各種脂肪酸的存在有利于SLN中疏水活性成分的裝載。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道一致[31]，硬脂酸和油酸是主要的組成成分。

表2 氣相色譜測(cè)定的乳木果油脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of shea butter measured by gas chromatography

如圖1所示，乳木果油的X射線衍射圖譜表現(xiàn)出主要的衍射峰和結(jié)晶相，符合不同脂肪酸的特征。其中，在2θ為21°處的衍射峰屬于硬脂酸[32]。此外，乳木果油的X射線衍射圖譜有較短的晶間距（4.2 ?和3.8 ?），這種β’多態(tài)性的特征表明脂質(zhì)中存在大量的棕櫚酸[32]。乳木果油圖譜中存在的寬峰范圍（12°～22°）是因多種脂肪酸結(jié)合導(dǎo)致，這也與脂肪酸的組成測(cè)定結(jié)果一致（表2）。乳木果油含有多種脂肪酸，具備穩(wěn)定的結(jié)晶多態(tài)性形態(tài)。而且，SLN的X射線衍射圖譜在21°處出現(xiàn)強(qiáng)峰，這可能是由于SLN存在硬脂酸的原因。圖譜中在23.7°處弱峰的存在是因?yàn)樵赟LN表面有吐溫系列的乳化劑[33]。

圖1 乳木果油（A）和SLN（B）的X衍射圖Fig.1 X-ray diffraction patterns of shea butter (A) and SLNs (B)

如圖2所示，乳木果油在36.20 ℃出現(xiàn)吸熱峰。差示量熱掃描儀的吸熱峰表示乳木果油結(jié)晶的熔化。與硬脂酸（69 ℃）和棕櫚酸（63 ℃）等固體脂肪酸相比，乳木果油的熔融溫度更低[33]。乳木果油的熔點(diǎn)與結(jié)晶度一致（圖1），而且乳木果油的低融化溫度是由于組分中含有多種脂肪酸的混合物（表2）。

圖2 乳木果油的差示掃描量熱圖Fig.2 Differential scanning calorimetric thermogram of shea butter

2.2 SLN的粒徑與形貌

根據(jù)不同的油水比（1∶9～1∶1），選擇吐溫80或吐溫20作為乳化劑，制備5 種O/W的乳液。將得到的脂質(zhì)納米顆粒乳液在4 ℃固化以獲得SLN懸浮液。因?yàn)槊糠N乳液都包含不同量的固體脂質(zhì)，所以從液滴形成SLN所需的固化時(shí)間也不同。長(zhǎng)期的低溫固化過(guò)程將使顆粒趨于聚集并且粒徑略有增大。乳化劑的負(fù)電荷能夠抑制顆粒的聚集。F1、F2、F3、F4和F5所需的最佳固化時(shí)間分別為240、60、30、30 min和40 min。固化時(shí)間的選擇取決于在相同的顆粒制備過(guò)程中不同固化時(shí)間獲得的最小SLN粒徑。如圖3所示，F(xiàn)1中乳液固化后，SLN懸浮液的粒度分布大于乳液的液滴分布。相反，具有更高脂質(zhì)含量的F2和F3呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。隨著乳木果油含量的不斷增加，乳液的液滴分布與F4和F5中SLN懸浮液的粒徑分布趨于一致。

圖3 固化前乳液的液滴分布和固化后懸浮液的顆粒分布Fig.3 Droplet size distribution of emulsions before curing and particle size distribution of suspensions after solidification

從表3可以看出，SLN的平均粒徑隨乳木果油的含量增加而逐漸減小。其中，F(xiàn)5中的SLN具有最小的粒徑（30.43 nm），而F1中的SLN具有最大的粒徑（278.17 nm）。選擇合適的乳化劑會(huì)影響所形成的SLN粒徑大小。吐溫80的親水親油平衡值（hydrophile lipophile balance，HLB）為15.0，這低于吐溫20的HLB（16.7）。更低的HLB代表乳化劑有更強(qiáng)的油脂親和力。因此，吐溫80被加入到油相含量更高的乳液中[34-35]。所有制備得到的SLN都顯示出相似的PDI，這表明SLN的分散性良好。而且，SLN的Zeta電位顯示為負(fù)值，SLN的負(fù)Zeta電位有助于防止納米顆粒的聚集，從而通過(guò)靜電排斥增強(qiáng)了分散液的穩(wěn)定性。相對(duì)低的PDI也表明了這一點(diǎn)。F7中的SLN粒徑小于F3配方的顆粒粒徑，主要是由于脂溶性活性物質(zhì)α-生育酚裝載在SLN中，其可能與SLN中的脂質(zhì)發(fā)生協(xié)同效應(yīng)，這會(huì)進(jìn)一步降低顆粒的粒徑和提高顆粒的穩(wěn)定性[36]。另外，本研究中所制備的乳木果油SLN粒徑小于之前研究報(bào)道的SLN粒徑[22-23]。在Ali等[22]的研究中，SLN的粒徑范圍為141～152 nm。Hassan等[23]所制備的SLN粒徑范圍為84～1 624 nm。本研究中SLN的粒徑范圍為30.43～278.17 nm，可以通過(guò)調(diào)整制備條件獲得不同粒徑的SLN。

表3 SLNs和包埋α-生育酚SLNs的粒徑、PDI和Zeta電位Table 3 Particle sizes, PDI, and zeta potentials of SLNs and α-tocopherol-loaded SLNs

為了更清晰地了解SLN的形貌，使用透射電子顯微鏡分析乳木果油SLN的形態(tài)。如圖4所示，SLN近似球形并且形狀均勻。SLN的形狀與Penumarthi等[37]的研究中使用膽甾醇油酸酯、甘油三油酸酯和其他脂質(zhì)制備的SLN一致。SLN的粒徑隨油相比重的增加而不斷減?。ū?）。高含量的油相在油水界面與乳化劑相互作用，能夠穩(wěn)定更多的界面面積，從而降低界面張力和乳液液滴的粒徑[38]。另外，透射電子顯微鏡還顯示出SLN具有良好的分散性，這與表3中SLN的PDI（0.10～0.24）一致。

圖4 以不同油相比例制備的乳木果油SLNs的透射電子顯微鏡圖Fig.4 TEM images of shea butter SLNs prepared with oil phase fractions of 0.1 (A), 0.2 (B), 0.3 (C), 0.4 (D) and 0.5 (E)

2.3 SLN的熱特性

如表4所示，不同SLN的熱峰值溫度分別為24.43（F6）、19.05（F7）、19.23（F8）、28.96（F1）、27.08（F2）、22.5（F3）、22.42 ℃（F4）和22.75 ℃（F5），明顯低于乳木果油的熱峰值溫度（35.84 ℃）。天然乳木果油的差示量熱掃描儀結(jié)果與之前的實(shí)驗(yàn)報(bào)道一致[30]。而且，與乳木果油的Tc-To范圍（14.0 ℃）相比，所有的SLN樣品都明顯降低（4.23～7.79 ℃）。此外，所有SLN的ΔH值（-0.68～-9.71 J/g）顯著低于乳木果油（-36.58 J/g）。同時(shí)隨著油相比例的增加，熱焓值顯著降低，這可能是更多脂質(zhì)基質(zhì)延遲了在冷卻過(guò)程中的重結(jié)晶行為。從F1到F3，峰值溫度趨于更低的溫度，這可能是由于粒度效應(yīng)引起的。相關(guān)研究表明，隨著顆粒粒徑的減小，熔融轉(zhuǎn)變變寬并移向更低的溫度[38-39]。納米顆粒的熔融變化很大程度依賴于粒度的大小變化。顆粒的粒徑減小，熔點(diǎn)發(fā)生降低。另外，顆粒的比表面積越大，其熔融溫度峰值隨之降低[40]。圖5中吸熱峰能夠表明SLN的形成，說(shuō)明在低溫固化的過(guò)程中發(fā)生了相態(tài)轉(zhuǎn)變和結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化。熔點(diǎn)的略微下降表明脂質(zhì)基質(zhì)在形成SLN后無(wú)定形程度增加。

表4 乳木果油SLNs的熱特性Table 4 Thermal properties of shea butter SLNs

圖5 未包埋α-生育酚（F1～F5）及裝載α-生育酚（F8）的乳木果油SLNs的差示量熱掃描圖Fig.5 Differential scanning calorimetric thermograms of shea butter SLNs without (F1, F2, F3, F4 and F5) and with α-tocopherol (F8)

2.4 包埋率和載藥量結(jié)果

為了將α-生育酚完全裝載到SLN中，將占比10%的α-生育酚加入到脂質(zhì)相中，并按照之前步驟測(cè)量離心后上清液中的游離α-生育酚，根據(jù)方程（2）和（3）計(jì)算SLN中α-生育酚的包埋率和載藥量。如表5所示，在F8中的α-生育酚的包埋率和載藥量分別為95.11%和9.6%。F8的結(jié)果高于F6和F7，這表明活性物質(zhì)的包埋與裝載隨著乳木果油占比的增加而提高。相比較于之前的研究報(bào)道[41]，本實(shí)驗(yàn)中α-生育酚的包埋率和載藥量數(shù)值更高。從表6也能夠看出，相比之前不同組分的SLNs，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)于活性物質(zhì)的包埋率和載藥量數(shù)值更高。而且，α-生育酚在SLN中的包埋率為95.11%，高于文獻(xiàn)[40]結(jié)果。推測(cè)SLN中α-生育酚的高包埋率可能是由于SLN中的脂質(zhì)相與脂溶性活性物質(zhì)之間存在疏水相互作用。其中，脂質(zhì)成分、固體性質(zhì)以及納米顆粒等因素都會(huì)導(dǎo)致SLN中的α-生育酚包埋率較高。另外，乳木果油的脂質(zhì)基質(zhì)具有低結(jié)晶度，使部分無(wú)定形區(qū)域包埋脂溶性的物質(zhì)。在SLN中，脂溶性活性物質(zhì)α-生育酚包埋在油相中，油相由固態(tài)脂質(zhì)包圍，對(duì)活性物質(zhì)的泄露起到一定保護(hù)作用，從而提高了包埋率[36]。

表5 包埋率和載藥量Table 5 Encapsulation efficiency and loading content of α-tocopherol

表6 具備不同活性成分和脂質(zhì)組成的SLN包埋率和載藥量Table 6 Encapsulation efficiency and loading content of different bioactive components in SLNs with different lipid compositions

3 結(jié) 論

在本研究中，第一次通過(guò)高速均質(zhì)方法成功制備乳木果油SLN。油水比為5∶5的SLN粒徑和PDI分別為30.43 nm和0.21。從透射電子顯微鏡來(lái)看，SLN的形態(tài)呈現(xiàn)近似球形。差示量熱掃描的熱特性測(cè)定顯示出乳木果油SLN的形成，并且SLN的峰值溫度隨著粒徑減小而趨向更低的溫度。另外，脂溶性活性物質(zhì)α-生育酚成功裝載到SLN中，并且包埋率達(dá)到95.11%。這項(xiàng)研究將為乳木果油在食品、化妝品以及生物醫(yī)學(xué)行業(yè)中的更廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。乳木果油SLN不僅可以裝載脂溶性活性物質(zhì)或藥物，還能夠用作營(yíng)養(yǎng)輸送的有益載體。