溫度對(duì)克氏原螯蝦胚胎和幼體發(fā)育的影響

劉永鑫，張殿福，陶忠虎，付峰，顧澤茂

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)雙水雙綠研究院/湖北省水生動(dòng)物病害防控工程技術(shù)研究中心/教育部長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展工程研究中心，武漢 430070； 2.湖北省潛江市農(nóng)業(yè)事業(yè)發(fā)展中心，潛江 433100； 3.湖北省潛江市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，潛江 433100

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，是一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類，具有掘洞、爬行等生物學(xué)習(xí)性，能有效利用稻田空間、稻稈和水資源進(jìn)行繁育與生長(zhǎng)，與水稻構(gòu)成了和諧的生態(tài)系統(tǒng)，形成“雙水雙綠”種養(yǎng)體系[1]。因此，興起于21世紀(jì)初的“蝦稻共作”模式，近年來(lái)在我國(guó)發(fā)展迅速，2019年全國(guó)克氏原螯蝦稻田種養(yǎng)面積達(dá)110.59萬(wàn) hm2，產(chǎn)量177.25萬(wàn) t[2]。然而，克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)在快速發(fā)展的過(guò)程中，苗種供應(yīng)成為最大難題。早期克氏原螯蝦的苗種主要為捕撈湖泊和溝渠的野生苗，后期主要通過(guò)稻田投放種蝦或留種育苗，這種稻田育苗方式難以滿足大面積擴(kuò)張過(guò)程中的苗種需求，很多地方出現(xiàn)了“一苗難求”的現(xiàn)象[3]。

溫度是影響蝦類生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子之一，確定克氏原螯蝦苗種孵化的適宜溫度，是人工繁育所必需掌握的生物學(xué)基礎(chǔ)。關(guān)于溫度對(duì)克氏原螯蝦繁殖與發(fā)育的影響，已有一些報(bào)道[4-7]，但對(duì)胚胎和幼體發(fā)育的適宜溫度范圍研究結(jié)果不一致，同時(shí)，缺乏不同溫度下的成活率數(shù)據(jù)。筆者比較了不同溫度下克氏原螯蝦胚胎和幼體的發(fā)育速率和成活率，系統(tǒng)觀察了克氏原螯蝦胚胎和幼體發(fā)育時(shí)期的形態(tài)變化，以期補(bǔ)充克氏原螯蝦的發(fā)育生物學(xué)數(shù)據(jù)，為稻田繁育蝦苗提供技術(shù)支撐，并在實(shí)踐操作中指導(dǎo)養(yǎng)殖戶通過(guò)調(diào)節(jié)水溫提早繁育蝦苗。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用克氏原螯蝦親蝦采自監(jiān)利縣雙水雙綠示范基地，體質(zhì)量(25.02±1.05) g。在室內(nèi)進(jìn)行人工交配，每天觀察親蝦繁殖情況，發(fā)現(xiàn)抱卵蝦及時(shí)取出。試驗(yàn)用水為曝氣24 h的自來(lái)水，溶氧量保持在(8.0±0.5) mg/L，氨氮水平(0.02±0.01) mg/L，pH 8.0～8.5。試驗(yàn)容器為60 cm×40 cm×20 cm的塑料水槽，加熱棒控制水溫。

設(shè)置19、22、25、28 ℃ 4個(gè)溫度處理組，溫差不超過(guò)±0.5 ℃。每個(gè)溫度梯度放12尾抱卵蝦，其中6尾用于胚胎和幼體發(fā)育成活率的計(jì)算，6尾用于發(fā)育過(guò)程的跟蹤觀察[8]。水槽中始終保持20 L試驗(yàn)用水。增氧泵持續(xù)向水槽充氣，每2 d換1次水，每次換水體的1/2，換同等水溫的曝氣水。

1.2 樣本采集與觀察

采集抱卵蝦的受精卵，根據(jù)胚胎發(fā)育情況，抱卵初期每2 h取樣觀察1次；胚胎發(fā)育到囊胚期之后每4 h取樣觀察1次；胚胎進(jìn)入原腸胚和器官發(fā)生期后，每12 h取樣觀察1次。每次取表層卵5～8粒，在體視顯微鏡(Leica M205 FA)下觀察拍照，記錄各期發(fā)育特征。每天早、晚各檢查1次，清除死卵。幼體全部孵出后，統(tǒng)計(jì)胚胎的孵化時(shí)間和孵化率，孵化時(shí)間為半數(shù)幼體出膜的時(shí)間。

幼蝦出膜后每12 h觀察1次，直至卵黃囊消失。每次每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取樣3～5尾，在體視顯微鏡(Olympus SZX16)下觀察拍照，記錄幼體形態(tài)特征。每天早、晚各檢查1次，清除死蝦，幼蝦死亡以心臟停止跳動(dòng)為準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)幼體階段的發(fā)育時(shí)間和成活率，發(fā)育時(shí)間為半數(shù)幼體到達(dá)該期的時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與計(jì)算

胚胎孵化率(RH,%)、幼體從孵化到Ⅳ期的成活率(RⅣ,%)、生物學(xué)零度(C, ℃)及有效積溫(K,℃·h)采用以下公式計(jì)算：

RH=(NM/NE) ×100%

RⅣ=(NⅣ/N0) ×100%

K=t(T-C)

式中，NE為親本懷卵量；NM為幼體孵化總量；NⅣ為Ⅳ期幼體數(shù)量；N0為試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)幼體總數(shù)；t為發(fā)育時(shí)間；v為發(fā)育速率(1/N)；T為平均水溫，℃；C為發(fā)育的生物學(xué)零度，℃[9]。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，利用SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，以P<0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)之間的關(guān)系采用統(tǒng)計(jì)作圖軟件GraphPad 8.0進(jìn)行曲線擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)胚胎發(fā)育的影響

1)胚胎發(fā)育分期。參照堵南山[10]對(duì)螯蝦類胚胎發(fā)育的分期，將克氏原螯蝦胚胎發(fā)育過(guò)程分為Ⅰ～Ⅵ期6個(gè)階段(圖1)。各期主要特征如下：Ⅰ期(受精卵期)：胚胎呈球形，不透明，質(zhì)膜緊貼，卵質(zhì)表面沒(méi)有隆起(圖1-1)；Ⅱ期(卵裂期)：質(zhì)膜分離，顏色略有加深(圖1-2)；Ⅲ期(囊胚期)：卵黃表面分裂，形成放射狀排列的初級(jí)卵黃錐體，卵中央部分不分裂，即為中央質(zhì)(圖1-3、1-4)；Ⅳ期(原腸胚和器官發(fā)生期)：細(xì)胞開(kāi)始凹陷，胚孔形成，2對(duì)視葉原基出現(xiàn)(圖1-5、1-6、1-7)；Ⅴ期(卵內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期)：2對(duì)觸角原基與3對(duì)顎足原基相繼形成，開(kāi)始出現(xiàn)淡黃色的囊狀心臟(圖1-8、1-9)；Ⅵ期(卵內(nèi)蚤狀幼體期)：胸肢和腹肢原基陸續(xù)出現(xiàn)，復(fù)眼形成，心跳頻率增加且節(jié)律趨于穩(wěn)定(圖1-10、1-11、1-12)。

2)溫度對(duì)胚胎孵化率的影響。在試驗(yàn)溫度(19～28 ℃)范圍內(nèi)，克氏原螯蝦胚胎均能正常孵化。溫度對(duì)孵化率有顯著影響(P<0.05，表1)，隨著溫度的升高，孵化率呈現(xiàn)“先升后降”的趨勢(shì)，水溫22 ℃時(shí)孵化率最高，為91.03%±2.97%；水溫28 ℃時(shí)孵化率最低，為40.53%±4.97%，且顯著低于其他3組(P<0.05)。溫度(T)與孵化率(RH)的關(guān)系可以用二項(xiàng)方程式較好地?cái)M合：RH=-1.515T2+ 66.83T- 641.5，R2=0.935 0(P<0.01，圖2)，根據(jù)曲線擬合方程計(jì)算得出22.06 ℃時(shí)孵化率最高。

3)溫度對(duì)胚胎發(fā)育持續(xù)時(shí)間的影響。由表2可知，溫度對(duì)克氏原螯蝦胚胎各階段發(fā)育時(shí)間均有顯著影響(P<0.05)，同一溫度不同胚胎階段歷時(shí)也不相同。其中，原腸胚和器官發(fā)生期歷時(shí)最長(zhǎng)，為(111.33±3.01)～(205.33±3.27) h，占32.20%～33.01%；卵內(nèi)蚤狀幼體期是耗時(shí)第二長(zhǎng)的階段，占29.13%～29.27%；卵內(nèi)無(wú)節(jié)幼體時(shí)期耗時(shí)略低于前兩者，占22.70%～25.24%，其他幾個(gè)階段耗時(shí)都比較少，總和不超過(guò)胚胎發(fā)育總時(shí)間的15%。整體來(lái)看，在19～28 ℃內(nèi)，胚胎發(fā)育速率隨溫度的升高而加快，水溫19 ℃時(shí)的孵化時(shí)間最長(zhǎng)，為(622.67±6.02) h；水溫28 ℃時(shí)，孵化時(shí)間最短，為(349.67±4.63) h。溫度(T)與孵化時(shí)間(D)的關(guān)系可以用二項(xiàng)方程式較好地?cái)M合：D=0.1709T2-9.254T+139.9，R2=0.984 9(P<0.01，圖3)，根據(jù)曲線擬合方程計(jì)算得出，27.07 ℃時(shí)胚胎孵化速度最快。

1.受精卵； 2. 卵裂期； 3～4.囊胚期； 5～7. 原腸胚和器官發(fā)生期； 8～9. 卵內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期； 10～12. 卵內(nèi)蚤狀幼體期。 CM：中央質(zhì)； OLP：視葉原基； D：胚孔；AP：觸角原基； H：心臟； OL：視葉； CE：復(fù)眼。 標(biāo)尺：1 mm。1. Zygote; 2. Cleavage stage; 3-4. Blastula stage; 5-7. Gastrula and organogenesis stage; 8-9. Nauplius stage; 10-12. Zoea stage. CM:Central mass; OLP:Optic-lobe primordium; D:Gastrula with dent; AP:Antenna-primordium; H:Heart; OL:Optic lobe; CE:Compound eyes. Scalebars are 1 mm.

表1 不同溫度下克氏原螯蝦孵化率和幼體成活率 Table 1 Hatching rate and larval survival rate of Procambarus clarkii at different temperature

圖2 克氏原螯蝦孵化率和水溫的關(guān)系Fig.2 The relationship between hatching rate and water temperature

圖3 克氏原螯蝦孵化時(shí)間和水溫的關(guān)系Fig.3 The relationship between hatchingtime and water temperature

4)胚胎發(fā)育的生物學(xué)零度及溫度與有效積溫的關(guān)系。采用Sanderson-Pearis公式，計(jì)算得出克氏原螯蝦胚胎發(fā)育的生物學(xué)零度為7.32 ℃，即水溫低于7.32 ℃，胚胎停止發(fā)育。將C=7.32代入公式K=t(T-C)中，計(jì)算不同溫度下胚胎發(fā)育的有效積溫，由表2可知，溫度對(duì)其有顯著影響(P<0.05)，在試驗(yàn)溫度(19～28 ℃)范圍內(nèi)，隨溫度的升高，胚胎發(fā)育的有效積溫“先降后升”，水溫22 ℃時(shí)所需要的有效積溫最低，為(6 494.58±150.21) ℃·h。

表2 不同溫度下克氏原螯蝦胚胎各階段的發(fā)育時(shí)間 Table 2 Development time of embryo stages of Procambarus clarkii at different temperatures

2.2 溫度對(duì)幼體發(fā)育的影響

1)幼體發(fā)育分期。根據(jù)其外部形態(tài)特征，將克氏原螯蝦幼體發(fā)育階段分為4個(gè)時(shí)期(圖4)。各期主要特征如下：Ⅰ期幼體，即剛破膜的幼體，頭胸部充滿卵黃，無(wú)眼柄；胸肢5對(duì)，不具攝食能力；腹肢4對(duì)，較成體少1對(duì)；尾部不能打開(kāi)；附肢均無(wú)剛毛(圖4A)。Ⅰ期幼體經(jīng)1次蛻殼后為Ⅱ期幼體，該時(shí)期眼柄出現(xiàn)，頭胸部卵黃囊呈“U”型，隨發(fā)育進(jìn)程會(huì)逐漸縮小呈“V”型；胸肢開(kāi)始具備攝食能力；附肢邊緣開(kāi)始長(zhǎng)出剛毛(圖4B)。幼體第2次蛻殼后進(jìn)入Ⅲ期幼體發(fā)育階段，頭胸部卵黃囊呈“V”型，隨發(fā)育進(jìn)程會(huì)逐漸消失；第一胸足螯鉗能自由張合，可有效捕食和抵御小型生物；第1、2觸角環(huán)節(jié)數(shù)增加，尾部可自由張合(圖4C)。幼體第3次蛻殼后進(jìn)入Ⅳ期幼體發(fā)育階段，該時(shí)期眼柄發(fā)育已基本成形，頭胸部卵黃囊消失；第一腹肢出現(xiàn)，腹肢變?yōu)?對(duì)，布滿剛毛；頭胸甲殼顏色變深，肉眼已看不到腹內(nèi)消化道(圖4D)。此時(shí)幼體已基本完成了外部結(jié)構(gòu)的發(fā)育，之后便開(kāi)始進(jìn)入仔蝦發(fā)育階段。

A.Ⅰ期幼體； B.Ⅱ期幼體； C.Ⅲ期幼體； D.Ⅳ期幼體. 標(biāo)尺：1 mm。 A.Larval stageⅠ; B.Larval stage Ⅱ; C.Larval stage Ⅲ; D.Larval stage Ⅳ. Scalebars are 1 mm.

2)溫度對(duì)幼體成活率的影響。在試驗(yàn)溫度(19～28 ℃)范圍內(nèi)，克氏原螯蝦幼體成活率均可達(dá)80%以上。由圖5可知，幼體成活率隨溫度的升高呈現(xiàn)“先升后降”的趨勢(shì)。水溫22 ℃時(shí)，幼體成活率最高，為94.37%±1.60%；水溫28 ℃時(shí)，幼體成活率最低，為82.67%±1.51%，且各溫度組幼體成活率差異顯著(P<0.05，表1)。溫度(T)與幼體成活率(RⅣ)的關(guān)系可以用二項(xiàng)方程式較好地?cái)M合：RⅣ=-0.4111T2+ 18.73T-119.9，R2=0.838 4(P<0.01，圖5)，根據(jù)曲線擬合方程計(jì)算得出22.78 ℃時(shí)幼體成活率最高。

圖5 克氏原螯蝦幼體成活率和水溫的關(guān)系Fig.5 The relationship between larval survivalrate and water temperature

3)溫度對(duì)幼體發(fā)育持續(xù)時(shí)間的影響。由表3可知，溫度對(duì)克氏原螯蝦幼體各階段發(fā)育時(shí)間均有顯著影響(P<0.05)，同一溫度不同幼體階段歷時(shí)也不相同。其中，Ⅲ期幼體發(fā)育持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，為(76.00±6.20)～(120.00±6.20) h，占38.68%～39.84%；Ⅱ期幼體發(fā)育次之，占31.96%～33.02%；Ⅰ期幼體發(fā)育持續(xù)時(shí)間最短，占27.63%～29.25%。整體來(lái)看，在試驗(yàn)溫度(19～28 ℃)范圍內(nèi)，溫度對(duì)幼體發(fā)育速度有顯著影響(P<0.05)。水溫19 ℃時(shí)，幼體發(fā)育時(shí)間最長(zhǎng)，為(304.00±10.73) h；水溫28 ℃時(shí)，幼體發(fā)育時(shí)間最短，為(194.00±9.03) h。溫度(T)與發(fā)育時(shí)間(D)的關(guān)系可以用二項(xiàng)方程式較好地?cái)M合：D=0.03472T2- 2.151T+ 41.05，R2=0.966 2(P<0.01，圖6)，根據(jù)曲線擬合方程計(jì)算得出，30.98 ℃時(shí)幼體發(fā)育最快。

4)幼體發(fā)育的生物學(xué)零度及溫度與有效積溫的關(guān)系。采用Sanderson-Pearis公式，計(jì)算得出克氏原螯蝦幼體發(fā)育的生物學(xué)零度為3.29 ℃，即水溫低于3.29 ℃，幼體停止發(fā)育。將C=3.29代入公式K=t(T-C)中，計(jì)算不同溫度對(duì)應(yīng)的幼體發(fā)育有效積溫，由表3可知，在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，溫度對(duì)幼體發(fā)育有效積溫?zé)o顯著影響(P>0.05)。

表3 不同溫度下克氏原螯蝦幼體各階段的發(fā)育時(shí)間 Table 3 Development time of larvae stages of Procambarus clarkii at different temperatures

圖6 克氏原螯蝦幼體發(fā)育時(shí)間和水溫的關(guān)系Fig.6 The relationship between larval developmenttime and water temperature

3 討 論

3.1 溫度對(duì)克氏原螯蝦胚胎發(fā)育的影響

在胚胎發(fā)育過(guò)程中，卵黃物質(zhì)為主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，升溫可增強(qiáng)卵黃蛋白降解酶的活性，繼而促進(jìn)相關(guān)代謝活動(dòng)，加快胚胎發(fā)育速度[11-12]。韓曉磊等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，30 ℃時(shí)克氏原螯蝦胚胎(抱卵)發(fā)育僅需15 d；在Jin等[7]的溫度梯度試驗(yàn)中，克氏原螯蝦胚胎(抱卵)孵化用時(shí)隨溫度升高逐漸縮短，水溫25 ℃下僅需21 d；而呂佳等[4]的研究表明，在12～39 ℃條件下，孵化時(shí)間隨溫度升高“先減小后增加”，33 ℃時(shí)用時(shí)最短，為29 d。本研究中，在19～28 ℃溫度范圍內(nèi)，孵化時(shí)間隨溫度的升高而縮短，水溫19 ℃時(shí)的孵化時(shí)間最長(zhǎng)，水溫28 ℃時(shí)孵化時(shí)間最短。這與韓曉磊等[6]和Jin等[7]的研究結(jié)果較一致；但與呂佳等[4]的研究結(jié)果相比，本研究中相同溫度下的孵化速度較快。分析其原因可能與抱卵的方式有很大關(guān)系，即抱卵蝦胚胎的孵化速度和孵化率遠(yuǎn)高于非抱卵胚胎[13]。

不同蝦類種群對(duì)溫度的耐受也不同，當(dāng)水溫超過(guò)溫度耐受范圍時(shí)，胚胎發(fā)育異常甚至死亡[14-15]。日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)胚胎在36 ℃以上溫度條件下不能正常孵化[16]；脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)胚胎在溫度超過(guò)30 ℃時(shí)不能正常發(fā)育[8]；紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)受精卵在水溫低于22 ℃或超過(guò)35 ℃時(shí)，均不能正常孵化[17]。本研究中，在試驗(yàn)溫度(19～ 28 ℃)范圍內(nèi)，克氏原螯蝦胚胎均能正常孵化，孵化率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在水溫22 ℃時(shí)達(dá)到最高，但在28 ℃時(shí)胚胎孵化率僅為40.53%，顯著低于其他溫度組。這可能是因?yàn)榕咛?nèi)某些卵黃降解酶的活性在高溫時(shí)受到抑制，從而導(dǎo)致了胚胎出現(xiàn)畸形，甚至死亡[18-19]，也可能是由于高溫使克氏原螯蝦抱卵剛毛黏附性降低，卵散落于水體底部后因缺氧而死亡，具體原因仍需進(jìn)一步深入研究。

3.2 溫度對(duì)克氏原螯蝦幼體發(fā)育的影響

溫度對(duì)克氏原螯蝦幼體的生長(zhǎng)和存活有明顯的影響[5-6]。本試驗(yàn)在水溫19～28 ℃條件下，幼體發(fā)育速度隨溫度升高而加快，這與李銘等[5]在一定溫度范圍內(nèi)高溫可明顯促進(jìn)克氏原螯蝦幼體發(fā)育的結(jié)論一致，也與研究脊尾白蝦[20]、中國(guó)對(duì)蝦(Penaeuschinensis)[21]以及凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[22]等的結(jié)果一致。但當(dāng)環(huán)境溫度超過(guò)了動(dòng)物自身的調(diào)節(jié)能力時(shí)，會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)受限，死亡率升高[23-24]。脊尾白蝦在36 ℃高溫時(shí)幼體無(wú)法正常變態(tài)為仔蝦[20]；日本沼蝦在31 ℃高溫時(shí)幼體死亡率高達(dá)88%[25]；墨吉明對(duì)蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)幼蝦在溫度低于14 ℃的水中，停止攝食，24 h后全部死亡[26]。李銘等[5]的研究中克氏原螯蝦在31 ℃條件下，死亡率很高，3～4周后全部死亡。本研究中，在19～28 ℃溫度范圍內(nèi)，克氏原螯蝦幼體均可正常發(fā)育，成活率隨溫度升高“先上升后下降”，水溫22 ℃時(shí)成活率最高。與馬盛群等[25]、李銘等[5]的研究結(jié)果相比，幼體成活率相對(duì)較高，分析其原因可能與蝦自身的體質(zhì)和母體“熱史”有關(guān)。在本研究中，高溫(28 ℃)條件下，幼體成活率顯著降低，這可能是因?yàn)楦邷丶涌炝诵玛惔x速率，自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累難以滿足代謝消耗，從而導(dǎo)致幼體無(wú)法完成生長(zhǎng)蛻殼，最后死亡[27]。

本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，同一溫度胚胎和幼體時(shí)期成活率明顯不同，幼體對(duì)溫度的耐受范圍要高于胚胎。這可能與機(jī)體自身營(yíng)養(yǎng)供給有很大關(guān)系，Ⅱ～Ⅲ期幼體可開(kāi)口攝食水體中小型浮游生物，從而為高溫條件下機(jī)體較快的新陳代謝提供能量，而胚胎時(shí)期的能量消耗只能靠自身卵黃物質(zhì)提供。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，我們建議克氏原螯蝦人工繁育過(guò)程中胚胎和幼體發(fā)育的溫度范圍設(shè)為22～25 ℃。