冬小麥對過量鉬脅迫的代謝響應(yīng)與耐鉬機制

李啟彪，李路,2，胡承孝，譚啟玲，孫學(xué)成

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/微量元素研究中心,武漢 430070；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測研究所,拉薩 850032

鉬是對人類、動物和植物正常生長發(fā)育至關(guān)重要的一種營養(yǎng)元素，其參與合成的鉬輔因子在生物代謝活動中起著不可替代的作用，但生物對鉬的需求量很低，且從缺乏到適宜的濃度范圍非常小[1]。巖石圈中鉬的平均含量為2.3 mg/kg，但鉬礦的開采活動產(chǎn)生的尾礦與廢渣會增加鉬在環(huán)境中的濃度，并在礦區(qū)附近造成土壤、地下水和農(nóng)田污染[2-5]?，F(xiàn)普遍認(rèn)為當(dāng)土壤中鉬含量高于10 mg/kg即會造成污染，但在我國的葫蘆島市、赤峰市、閩東地區(qū)，美國的加利福尼亞州以及加拿大哥倫比亞省等地區(qū)的鉬礦區(qū)已發(fā)生的鉬污染都遠(yuǎn)超該限值，如我國葫蘆島礦區(qū)周邊果園土壤的平均鉬含量高達720.61 mg/kg[6-10]。

大量研究表明，過量的鉬會使植物受到氧化脅迫進而影響生長和產(chǎn)量[11-12]，會擾亂類囊體排列并抑制光合作用[13]，還會引起其他礦質(zhì)營養(yǎng)元素如Mn、Mg的缺乏等癥狀[11]。同時許多植物對高濃度的鉬有著較強的耐受能力，即使在受到鉬污染的環(huán)境下也沒有表現(xiàn)出毒性性狀。據(jù)報道，黑麥草、玉米即使在含有1 000 mg/kg鉬的土壤中也能正常生長[14]，白菜幼苗暴露在10 mmol/L的鉬酸鈉下時葉綠素含量也沒有明顯變化[15]，而小麥在土壤鉬含量高達1 000 mg/kg下長勢與產(chǎn)量也不受明顯影響，說明小麥也擁有較強的耐鉬能力[16-17]。

小麥作為世界產(chǎn)量最高、分布最廣的糧食作物，部分小麥產(chǎn)區(qū)已有土壤鉬污染的報道，如我國陜西省洛南縣黃龍浦鉬礦區(qū)的小麥農(nóng)田土壤鉬含量可達193 mg/kg[18]，但目前過量鉬脅迫對小麥生長的影響及其機制尚未明確。本研究以小麥作為試驗材料，研究過量鉬在小麥中的亞細(xì)胞分布并結(jié)合LC-MS代謝組學(xué)分析鉬脅迫下的差異代謝物，探明小麥對土壤鉬污染的代謝響應(yīng)和耐受機制，以期為植物耐受過量鉬脅迫的機制提供理論支持，并為植物修復(fù)土壤鉬污染提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微量元素研究中心自繁留種的冬小麥品種97014，在前期的土壤盆栽試驗中發(fā)現(xiàn)小麥在鉬含量0.15 mg/kg至1 000 mg/kg的高鉬環(huán)境下也能保持產(chǎn)量與長勢未顯著下降[16]，因此設(shè)置了正常鉬水平(1 μmol/L)和過量鉬水平(1 mmol/L)2個處理，以鉬酸銨 (NH4)6Mo7O24·4H2O為肥源，作4次重復(fù)。

采用營養(yǎng)液培養(yǎng)小麥，其中大量元素采用的Hogland營養(yǎng)液含有4 mmol/L Ca (NO3)2·4H2O、6 mmol/L KNO3、1 mmol/L NH4H2PO4、2 mmol/L MgSO4·7H2O；微量元素采用的無鉬Arnon營養(yǎng)液含有100 μmol/L EDTA-Fe、46.2 μmol/L H3BO3、9.1 μmol/L MnCl2·4H2O、0.8 μmol/L ZnSO4·7H2O和0.3 μmol/L CuSO4·5H2O，營養(yǎng)液均使用去離子水配制(電阻率>18.25 MΩ·cm,25 ℃)。

所用試劑均為分析純級別，試驗所有器皿均用2 mol/L HNO3浸泡48 h，再用去離子水沖洗干凈。質(zhì)譜級乙腈、色譜級甲醇均購于Merck (Dannstadt，Gemany)，甲酸購于CNW(Duesseldorf,Germany)，其余試劑均為分析純，過程所用水均為去離子水。

1.2 培養(yǎng)方案

小麥種子用0.5%次氯酸鈉溶液消毒30 min后用去離子水沖洗干凈，播于濕潤的醫(yī)用紗布上25 ℃恒溫催芽。待芽長約1 cm時，于2015年10月18日選擇大小相對一致的小麥幼苗25株，移植于盛有10 L營養(yǎng)液的方盒并放置在人工氣候室中，人工氣候室條件為20 ℃/18 ℃(16 h/8 h)，光照強度為100 μmol/(m2·s)。首先將小麥幼苗用1/2濃度營養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，再用全量濃度營養(yǎng)液培養(yǎng)，每5 d更換1次營養(yǎng)液。正常鉬水平(1 μmol/L)培養(yǎng)15 d后，設(shè)正常鉬水平(1 μmol/L)和過量鉬水平(1 mmol/L)2個處理，繼續(xù)培養(yǎng)10 d后收獲測定地上部、地下部及其亞細(xì)胞的鉬含量，并對葉片進行代謝組學(xué)分析。

1.3 鉬含量的測定方法

小麥亞細(xì)胞鉬含量的測定在Liu等[19]的方法基礎(chǔ)上進行修改，稱取0.5 g鮮樣于用液氮預(yù)冷的研缽中，用5 mL提取液將其研磨成勻漿，提取液使用1 mmol/L二硫赤蘚糖醇、50 mmol/L Tris-HCl、5.0 mmol/L抗壞血酸、250 mmol/L蔗糖和10 g/L聚乙烯吡絡(luò)烷酮(PVP)，并調(diào)節(jié)pH值至7.5。使用240 μm的尼龍網(wǎng)過濾所得殘渣為細(xì)胞壁部分，將上清液在4 448 r/min下離心20 min，所得殘渣為地上部的葉綠體或是地下部的原生質(zhì)體，將后續(xù)上清液在10 896 r/min下繼續(xù)離心35 min，所得殘渣為細(xì)胞膜以及細(xì)胞器組分，而最后的上清液為可溶性部分，該過程所有步驟均保持在4 ℃下進行。將各亞細(xì)胞組分與混酸(HNO3∶HClO4=4∶1,V/V)混合后在180～230 ℃下消化，用去離子水轉(zhuǎn)移定容并過濾后使用石墨爐(日立，Z-2000)進行鉬含量的測定。

1.4 代謝產(chǎn)物的測定方法

本試驗代謝產(chǎn)物的測定采用LC-MS(Ultimate 3000LC,Thermo)平臺，色譜柱為Hypergod C18 (100 mm×4.6 mm，3 μm)。色譜分離條件設(shè)置為：流速0.3 mL/min、柱溫40 ℃；流動相組成為A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；流動相的梯度洗脫程序見表1。進樣量為4 μL，自動進樣器的溫度為4 ℃。

表1 流動相梯度 Table 1 The gradient of mobile phase

質(zhì)譜參數(shù)：正模式，加熱器溫度300 ℃，輔助氣流速15 mL/min，掃描氣體流速1 mL/min，鞘氣流速45 mL/min，噴霧電壓3.0 kV，毛細(xì)管溫度 350 ℃，透鏡電壓水平30%；負(fù)模式，加熱器溫度300 ℃,輔助氣流速15 mL/min，掃描氣體流速1 mL/min，鞘氣(N2)流速45 mL/min，噴霧電壓3.2 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，透鏡電壓水平60%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理計算，Origin 2018繪圖，SPSS 20.0進行方差分析，各處理平均值的多重比較釆用獨立樣本t檢驗(P<0.05)。

LC-MS數(shù)據(jù)使用SIEVE軟件進行預(yù)處理后使用Microsoft Excel 2010 軟件進行歸一化處理和后期編輯，并將最終數(shù)據(jù)組織成二維數(shù)據(jù)矩陣，其中包含有變量(rt_mz)、相對分子質(zhì)量(Comp MW)、觀察量(樣本)和峰強。此項目樣本在正模式下共獲得2 146個特征峰，在負(fù)模式下共得到1 394個特征峰，將編輯完成的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P(13.0)軟件進行后續(xù)分析，將得到的差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst 3.0以獲得差異代謝物參與的代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉬污染對冬小麥亞細(xì)胞中鉬含量的影響

為了解正常與過量鉬水平下冬小麥各個亞細(xì)胞的鉬含量及分布，對根系及地上部樣品進行了亞細(xì)胞分級，結(jié)果表明，正常鉬水平(1 μmol/L)下小麥根系亞細(xì)胞鉬含量表現(xiàn)為可溶性部分>細(xì)胞膜+細(xì)胞器>原生質(zhì)體>細(xì)胞壁；過量鉬(1 mmol/L)水平下則表現(xiàn)為可溶性部分>細(xì)胞壁>原生質(zhì)體>細(xì)胞膜+細(xì)胞器。2個鉬水平下鉬在可溶性部分中的含量及分配比例均為最高(圖1)。

圖1 冬小麥亞細(xì)胞中鉬的分布Fig.1 Subcellular distribution of molybdenum in winter wheat

由表2可知，當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)中的鉬含量從1 μmol/L上升到1 mmol/L時，根部可溶性部分、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜+細(xì)胞器及原生質(zhì)體中的鉬含量分別上升了1 300、1 815、62、105倍，其中可溶性部分的鉬含量最高，達533.0 mg/kg；從鉬在各亞細(xì)胞組分所占比例來看，在鉬過量條件下，鉬在細(xì)胞壁和可溶性部分分配比例分別增加了13.3%和30.2%，總體占比可達22.8%和71.8%，可見過量鉬水平下小麥根系中絕大部分的鉬存儲在液泡和細(xì)胞壁中，而液泡則是最主要的儲存部位。

小麥地上部亞細(xì)胞鉬含量在正常鉬水平(1 μmol/L)下表現(xiàn)為：可溶性部分>細(xì)胞膜+細(xì)胞器>葉綠體>細(xì)胞壁；過量鉬水平(1 mmol/L)下表現(xiàn)為：可溶性部分>細(xì)胞壁>細(xì)胞膜+細(xì)胞器>葉綠體；2個鉬水平下鉬在可溶性部分中的含量均為最高。當(dāng)介質(zhì)(營養(yǎng)液)中的鉬含量從1 μmol/L上升到1 mmol/L時，可溶性部分、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜+細(xì)胞器及葉綠體中的鉬含量分別上升了19、35、5、12倍，也是可溶性部分中鉬含量最高，達13.76 mg/kg；從鉬在各亞細(xì)胞組分所占比例來看，在過量鉬水平下，鉬在可溶性部分的分配比例增加了8.0%，總體占比高達88.5%。由此可知，在2個鉬水平下鉬小麥地上部吸收的鉬均主要存儲在液泡中，其中過量鉬水平下在液泡中的分配比例要更高。

2.2 過量鉬對冬小麥葉片代謝物的影響

表2 冬小麥亞細(xì)胞中的鉬含量 Table 2 Subcellular Mo content in winter wheet mg/kg

A：正模式；B：負(fù)模式。A:Positive mode; B:Negative mode.圖2 正常鉬和過量鉬兩組處理的OPLS-DA得分圖Fig.2 Score plots of OPLS-DA of normal molybdenum and excess molybdenum treatment

表3 過量鉬下的冬小麥的差異代謝物 Table 3 Discriminatory metabolites of winter wheat under excess-Mo

續(xù)表3 Continued Table 3

正常鉬與過量鉬小麥葉片共鑒定出48個差異代謝物，其中有34個代謝物上調(diào)，14個代謝物下調(diào)。代謝物中大部分的氨基酸、有機酸、脂肪酸及其衍生物均有顯著上調(diào)，而磷脂和核苷酸類代謝物則是部分下調(diào)，在34種上調(diào)代謝物中包含6種氨基酸及其衍生物、5種有機酸。將得到的差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst 3.0軟件后得到這些差異代謝物所處的代謝通路(圖3)，可發(fā)現(xiàn)過量鉬促進了冬小麥葉片中氨基酸的合成與代謝過程，并促進了TCA循環(huán)中有機酸的合成過程。

圖3 過量鉬脅迫下的冬小麥葉片的代謝通路分析Fig.3 Discriminatory metabolites of winter wheat under excess-Mo

3 討 論

植物對鉬的耐性較強，如小麥、玉米在鉬含量1 000 mg/kg的土壤中生長，葉片中的鉬含量分別可達4 000 mg/kg和400 mg/kg，而作物生長也未表現(xiàn)出顯著抑制[15-17,20]。較早的研究發(fā)現(xiàn)，在鉬污染環(huán)境中，植物根系鉬含量通常遠(yuǎn)高于地上部，如在土壤鉬含量1 000 mg/kg時，小麥根部鉬含量是地上部的3倍，而在玉米、大豆、黑麥草等植物上也能觀察到相同的趨勢[14-16]。本試驗基于前期土壤盆栽試驗中發(fā)現(xiàn)小麥在鉬添加量高達1 000 mg/kg的環(huán)境下也能維持正常產(chǎn)量的結(jié)果[16]，設(shè)置了100 mg/L的過量鉬水培試驗以探究小麥的耐鉬機制，結(jié)果表明在過量鉬水平下，過量鉬處理大幅增加了小麥根系亞細(xì)胞組分鉬含量，細(xì)胞壁、可溶性部分、細(xì)胞器、原生質(zhì)體/葉綠體的鉬含量分別是地上部各亞細(xì)胞組分的219、38、25和62倍。前人在大豆、玉米、油菜等植物上的研究也表明，高鉬介質(zhì)中生長的作物根系鉬含量分別能達到地上部鉬含量的49、3和5倍[15,21-22]。這些結(jié)果說明小麥根部在過量鉬環(huán)境下能夠吸收并積累更多的鉬，這是阻止過量鉬向地上部遷移的第一道屏障。

將過量金屬進行亞細(xì)胞區(qū)隔化以降低游離過量金屬離子是植物重要的耐受機制之一，一些植物會將吸收的過量金屬區(qū)隔在細(xì)胞壁中，如茶樹能在過量鋁環(huán)境下將69.8%的鋁固定在細(xì)胞壁中，并將其與果膠和半纖維素結(jié)合[23]；而液泡則是植物區(qū)隔金屬離子的另一個重要部位，植物在吸收過量金屬離子后能將其與氨基酸、有機酸和植物螯合素結(jié)合后轉(zhuǎn)運儲存在細(xì)胞的液泡中[24]，如V?geli-Lange等[25]報道了暴露在高鎘環(huán)境下煙草細(xì)胞中的鎘能與植物螯合素絡(luò)合后轉(zhuǎn)運至液泡中。本研究發(fā)現(xiàn)，正常鉬水平下的鉬在冬小麥根系及地上部的可溶性部分中分配比例分別為41.6%和80.5%，當(dāng)鉬水平從正常(1 μmol/L)上升到過量(1 mmol/L)時，鉬在根系及地上部的可溶性部分分配比例分別上升了30.2和8.0個百分點，達到71.8%和88.5%，說明無論是在正常鉬水平還是過量鉬水平下，液泡都是冬小麥中鉬的主要儲存部位，且過量鉬水平下鉬在液泡中的儲存比例更大。Xu等[26]在大豆上的研究結(jié)果也顯示，當(dāng)營養(yǎng)液質(zhì)量濃度為1 mg/L時，鉬在根系及地上部可溶性部分中的分配比例為26.4%～46.3%，當(dāng)營養(yǎng)液鉬質(zhì)量濃度從1 mg/L上升到100 mg/L時，鉬在大豆根系及葉片可溶性部分中儲存比例達到66.3%～72.2%。Qin等[21]在油菜上的研究結(jié)果表明，當(dāng)營養(yǎng)液中鉬濃度從1 μmol/L上升到200 μmol/L時，鉬在根系液泡中的分配比例從47.3%上升到59.5%，在葉片液泡中的分配比例從41.2%上升到62.8%。綜上得出結(jié)論，小麥在面對過量鉬脅迫時能將吸收的過量鉬固定在根部以防止其向地上部運輸，并把大部分的鉬轉(zhuǎn)運儲存在根部的液泡中，相比于其他作物，小麥要更依賴于液泡對過量鉬的區(qū)隔作用。

液泡是細(xì)胞中各種有機酸、氨基酸及各種金屬離子的存儲中心，氨基酸、有機酸、植物螯合素等有機物通常會在液泡中與游離金屬離子發(fā)生螯合作用，這是植物耐受重金屬的另一個重要機制[27]。代謝組分析結(jié)果表明，在鉬脅迫下冬小麥中氨基酸的合成代謝和TCA循環(huán)過程被顯著促進，參與該過程的蘋果酸、延胡索酸含量分別上升了2.08倍和2.07倍，而許多有機酸如檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、草酸等能夠和Mo、Ni、Cd等金屬離子螯合[28-31]，另外本研究還發(fā)現(xiàn)過量鉬處理使小麥的β-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酰胺的含量分別上升了2.78、1.89、1.67和1.91倍，已有大量研究表明植物體內(nèi)的脯氨酸、谷氨酰胺等氨基酸能螯合Zn、Cd等金屬離子[27,32-33]；還有報道表明，鉬與L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸等氨基酸在體外反應(yīng)體系下能形成配合物[34]。因此，我們推測小麥在過量鉬環(huán)境下增加合成的延胡索酸、蘋果酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸和L-蘇氨酸能在液泡中與鉬酸根離子反應(yīng)形成絡(luò)合物，從而降低過量鉬對小麥細(xì)胞的毒害。

在過量鉬環(huán)境下，小麥亞細(xì)胞中的鉬主要分布于細(xì)胞壁和可溶性部分，且根部的液泡在過量鉬的固持過程中起主要作用，過量鉬促進了小麥氨基酸合成代謝與TCA循環(huán)過程，該路徑中多種氨基酸(β-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酰胺)和有機酸(蘋果酸、延胡索酸)的含量都顯著增加，推測這些氨基酸與有機酸能與鉬進行絡(luò)合并固定在液泡中，從而增強小麥對過量鉬的耐受能力。