酶聯(lián)免疫試劑盒復(fù)核驗(yàn)證分析

文│王遠(yuǎn)麗（新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心）

周俊晟［新疆維吾爾自治區(qū)吉木薩爾縣北庭鎮(zhèn)農(nóng)（牧）業(yè)發(fā)展服務(wù)中心］

筆者對北京勤邦生物技術(shù)有限公司（以下簡稱勤邦公司）和北京華安麥科生物技術(shù)有限公司（以下簡稱華安麥科）開發(fā)的氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒展開復(fù)核驗(yàn)證試驗(yàn)，主要復(fù)核指標(biāo)包括試劑盒的50%抑制濃度、樣本最低檢測限、準(zhǔn)確度和精密度。

一、材料和檢測方法

1.試劑。乙酸乙脂、正已烷、去離子水。

2.材料。勤邦公司氯霉素編號：KA00605H酶聯(lián)免疫試劑盒（批號為：C190503A10、C201103A10、C210103A10）；華安麥科氯霉素編號：HE09001酶聯(lián)免疫試劑盒（批號為：20200312、20201203、20210107）。

3.檢測儀器。微孔板酶標(biāo)儀450納米/630納米、氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、渦旋儀、離心機(jī)、刻度移液管、微量移液器（單道20～200微升、100～1000微升、多道300微升）等。

4.操作方法。根據(jù)勤邦公司和華安麥科所提供的試劑盒說明書，對生鮮乳樣本進(jìn)行試劑盒靈敏度、樣本最低檢測限、準(zhǔn)確度和精密度的復(fù)核實(shí)驗(yàn)。

5.試劑盒操作過程。

勤邦公司酶聯(lián)免疫試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分為0、0.025微克/毫升、0.075微克/毫升、0.3微克/毫升、1.2微克/毫升、4.8微克/毫升，樣品前處理過程中稀釋0.5倍；量取2毫升新鮮牛奶樣本至50毫升聚苯乙烯離心管中，分別加入50微升蛋白沉淀劑和8毫升乙酸乙脂，用渦旋儀渦動30秒混勻，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；吸取4毫升上層有機(jī)相至10毫升潔凈干燥玻璃管，于50～60℃（122～140℉）水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加?.5毫升正已烷，用渦旋儀渦動1分鐘，再加入0.5毫升復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動30秒，混勻；將所有液體轉(zhuǎn)移至2毫升聚苯乙烯離心管中，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；除去上層有機(jī)相，取下層水相50微升用于分析。

華安麥科酶聯(lián)免疫試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分為0、0.01微克/毫升、0.03微克/毫升、0.09微克/毫升、0.27微克/毫升、0.81微克/毫升，樣品前處理過程中稀釋4倍；將生鮮乳樣本于25℃放置1小時(shí)左右，待樣本回溫；室溫4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；移去上層脂肪，取500微升下層奶樣，加入1.5毫升生鮮乳樣本稀釋液，振蕩混勻后，取70微升用于分析。

二、復(fù)核驗(yàn)證結(jié)果

1.50%抑制濃度測定。測定標(biāo)準(zhǔn)曲線0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液50%抑制率處所對應(yīng)的藥物濃度IC50值，以此作為評價(jià)勤邦公司試劑盒靈敏度、標(biāo)準(zhǔn)曲線及穩(wěn)定性的性能指標(biāo)。

驗(yàn)證過程中，分別測定試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線6條，用分析軟件計(jì)算6條標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50值，及IC50波動范圍，結(jié)果見表1和表2。

表1 勤邦公司酶聯(lián)免疫試劑盒IC50值 微克/毫升

表2 華安公司酶聯(lián)免疫試劑盒IC50值 微克/毫升

從測定數(shù)據(jù)可知，勤邦公司酶聯(lián)免疫試劑盒IC50平均值為0.142微克/毫升，波動范圍在0.104～0.187微克/毫升。華安麥科酶聯(lián)免疫試劑盒IC50平均值為0.062微克/毫升，波動范圍在0.053～0.067微克/毫升。

2.樣本最低檢測限測定。測定生鮮乳空白樣品，計(jì)算最低檢測限。

檢測限計(jì)算公式為：LOD＝X＋3×SD。其中，X為重復(fù)測定空白樣品的平均值，SD為重復(fù)測定空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其中X為重復(fù)測定空白樣品的平均值，n為樣品數(shù)量，結(jié)果見表3和表4。

表3 勤邦公司酶聯(lián)免疫空白生鮮乳樣本最低檢測限 微克/毫升

表4 華安公司酶聯(lián)免疫空白生鮮乳樣本最低檢測限 納克/毫升

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，勤邦公司酶聯(lián)免疫試劑盒空白生鮮乳樣本最低檢測限為：14.2納克/毫升。華安麥科酶聯(lián)免疫試劑盒空白生鮮乳樣本最低檢測限為：82.1納克/毫升。

3.試劑盒準(zhǔn)確度和精密度測定。將氯霉素添加至生鮮乳樣本至終濃度分別為0.05微克/毫升、0.1微克/毫升、0.5微克/毫升，每個(gè)濃度測定5個(gè)重復(fù)，對測定結(jié)果計(jì)算回收率及變異系數(shù)，結(jié)果見表5和表6。

表5 勤邦公司酶聯(lián)免疫試劑盒回收率和變異系數(shù)情況 微克/毫升

表6 華安麥科酶聯(lián)免疫試劑盒回收率和變異系數(shù)情況 微克/毫升

結(jié)果表明，勤邦公司酶聯(lián)免疫試劑盒空白生鮮乳在三個(gè)添加水平的回收率范圍為88.2%～115.3%，批內(nèi)變異系數(shù)范圍為6.3%～9%，批間變異系數(shù)為7.7%～8.9%。華安麥科空白酶聯(lián)免疫試劑盒生鮮乳在三個(gè)添加水平的回收率范圍為78.2%～117%，批內(nèi)變異系數(shù)范圍為5.1%～9.7%，批間變異系數(shù)為6%～8%。

三、結(jié)果討論

通過對以上復(fù)核檢測結(jié)果得出：

1.勤邦公司酶聯(lián)免疫試劑盒IC50平均值為0.142微克/毫升，波動范圍在0.104～0.187微克/毫升之間。華安麥科酶聯(lián)免疫試劑盒IC50平均值為0.062微克/毫升，波動范圍在0.053～0.067微克/毫升。

2.勤邦公司生鮮乳最低檢測限為：14.2納克/毫升。華安麥科生鮮乳最低檢測限為：82.1納克/毫升。

3.勤邦公司酶聯(lián)免疫試劑盒空白生鮮乳在三個(gè)添加水平的回收率范圍為88.2%～115.3%，批內(nèi)變異系數(shù)范圍為6.3%～9%，批間變異系數(shù)為7.7%～8.9%。華安麥科酶聯(lián)免疫試劑盒空白生鮮乳在三個(gè)添加水平的回收率范圍為78.2%～117%，批內(nèi)變異系數(shù)范圍為5.1%～9.7%，批間變異系數(shù)為6%～8%。

4.勤邦公司、華安麥科生產(chǎn)的氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒均符合相關(guān)要求。