群體感應抑制劑調控食源性微生物生物膜形成的研究進展

莫禎妮，熊盈盈，邱樹毅，曾祥勇,*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省發(fā)酵與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

食品的腐敗變質是由于腐敗或致病微生物的生長和繁殖引起的，生產、加工、運輸、銷售和貯藏等過程都有可能引起腐敗或致病微生物的生長，形成相應的生物膜。生物膜是指細菌附著在固體表面上，產生細胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）基質，并將原核微生物和/或真核微生物嵌入其中，形成具有空間組織的群落[1]。生物膜的基本骨架是由多種EPS組成的三維結構，對細菌在固體表面黏附以及細胞內的聚集起關鍵作用[2]。生物膜可以保護內部病原菌細胞，有助于營養(yǎng)物質的補充，因此生物膜黏附在生物或非生物表面會導致食源性疾病的風險增加，且難以被清潔劑和消毒劑清除，從而影響食品安全[1]。據世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報道，每年由病原菌引起的食源性疾病占比高達30%，其中有65%都是因為病原菌形成生物膜造成的[3]。因此，在食品加工生產過程中控制生物膜形成已成為當今亟需解決的一個重要問題。

群體感應（quorum sensing，QS）是細胞-細胞的交流機制，是細菌進行種間或種內信息交流的一種信號轉導機制，當群體密度達到一定閾值時，能夠自發(fā)產生、釋放一些信號分子，細胞受體識別信號，可調控基因表達，并參與許多重要的生物學過程，如孢子形成、毒力和發(fā)病機制、食物腐敗和生物膜形成等[4]。細菌從游離狀態(tài)到形成成熟的生物膜的過程中，主要是通過QS系統和一系列的環(huán)境信號調節(jié)表達。QS現象與生物膜形成有著至關重要的關系，當環(huán)境條件不利于細菌生長時，細菌在QS系統的調控下聚集，形成生物膜，若缺失QS系統，形成的生物膜會變得稀薄。QS系統不僅可以影響細菌的聚集，還會影響細菌的黏附性、疏水性、EPS的含量等。同時，生物膜的形成也可以影響QS信號分子的擴散[5]。

生物膜是食品工業(yè)中最常見的污染形式，在食品加工中形成生物膜，會降低食品加工過程的有效性，影響食品品質和安全，從而導致細菌食源性疾病的風險增加。因此抑制生物膜的形成和去除生物膜具有重要意義。近年來研究發(fā)現大多數細菌生物膜的形成都依賴于QS系統的調控[6]，所以，通過抑制QS系統調節(jié)生物膜的形成已成為一項有效的控制策略[7]。

1 生物膜的形成

生物膜的形成是一個復雜的動態(tài)過程，該過程中涉及到細胞表面分子、毒力因子等多方面的變化，最終達到促進細菌在不利環(huán)境中生長的目的。食品中多種微生物（包括導致腐敗和致病的微生物）都可以形成生物膜，并在許多感染中發(fā)揮關鍵作用[8]。生物膜的形成一般分為5 個階段[8-9]（圖1）：1）可逆黏附階段。在環(huán)境中浮游的細菌會通過物理作用（如范德華力、靜電相互作用）或借助鞭毛、菌毛的運動黏附在物體表面，這一階段是形成生物膜的關鍵，附著的微生物起初只有少量EPS，不具有分化能力，可能會從表面脫落重新回到浮游狀態(tài)，因此這個階段是可逆的[10]。黏附物的表面性質如粗糙度、表面電荷、疏水性等在細菌黏附中起重要作用[11]。塑料、玻璃、金屬、木材和食品等疏水性表面更容易形成生物膜[12]。2）不可逆黏附階段。細菌在生物或非生物表面進行最初的可逆黏附后，附著的細胞開始分泌群體感應分子（quorum sensing molecules，QSMs）和EPS，從而提供較強的附著能力，導致不可逆黏附。此時生物膜變得難以去除，需要酶、表面活性劑、消毒劑和/或熱量對附著力進行強剪切或化學反應才能破壞。3）微菌落形成階段。當細菌附著在生物或非生物表面時，可以通過QS機制相互交流并分泌EPS，在EPS內繁殖形成微菌落，這有助于加強細菌與基質之間的聯系，并在環(huán)境中穩(wěn)定菌落，該過程需要如鞭毛、菌毛、QSMs和EPS的共同參與。4）成熟階段。此階段是最穩(wěn)定的，形成了成熟的生物膜，附著的菌群以單層或多層的聚集體存在，菌群具有不同的形狀，如蘑菇狀等，細胞外基質可以保護細胞免受外部損傷。在生物膜成熟階段中，QS系統會調節(jié)EPS中某些重要基因的表達，表明QSMs是參與生物膜形成的重要調控機制[13]。5）分散階段。此階段生物膜內的細菌開始凋亡，當受到外部因素如流體剪切力增加，內部因素如內源性酶降解、EPS或表面結合蛋白的釋放影響時，活的細菌又可以分散到周圍環(huán)境中，這些浮游態(tài)細菌再次附著在表面形成新生物膜，重復以上這些過程。

圖1 生物膜形成階段假想模型[8-9]Fig.1 Hypothetical model of biofilm formation stages[8-9]

2 QS調控生物膜形成

2.1 QS系統的分類

QS是基于細胞外化學信號分子的產生、釋放和控制來調整自身群體密度和行為的過程，細菌在生長和繁殖過程中向周圍環(huán)境分泌特定的信號分子，這種信號分子被稱為自誘導物（autoinducer，AI）[4]。QS信號分子可分為3大類：N-?；呓z氨酸內酯（N-acyl homoserine lactones，AHLs）、自誘導寡肽（autoinducing peptide，AIP）和自誘導子-2（autoinducer-2，AI-2）。當這些信號分子濃度達到一定閾值時，細菌群體會通過特異性靶基因的協同表達來響應[14-15]。

2.1.1 AHLs介導的革蘭氏陰性菌QS系統

大多數革蘭氏陰性菌（G-）的QS系統都是以AHLs信號分子介導的。AHLs是以N-酰基高絲氨酸內酯環(huán)為核心的，?；溚ǔ：?～18 個碳。高絲氨酸內酯環(huán)部分來源于S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），?；鶄孺湶糠謥碓从邗；d體蛋白或?；o酶A[16]。luxI/luxR系統是G-中典型的QS調控系統。LuxI同源蛋白合成酶產生的AHLs作為AI，然后分泌到細胞膜外，當達到閾值濃度時與LuxR家族的受體蛋白相互作用，導致靶基因的抑制或激活[17]。

2.1.2 AIP介導的革蘭氏陽性菌QS系統

在革蘭氏陽性菌（G+）中，AIP信號分子是一種特有的經過翻譯、修飾后形成的具有穩(wěn)定性的自誘導肽，AIPs必須通過ATP-結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉運系統或其他膜蛋白才能分泌到胞外。AIP與由膜結合的傳感器激酶受體和細胞質轉錄因子組成的雙組分系統來調節(jié)基因表達[16]。當AIP累積到一定濃度閾值時，雙組分系統的感應識別元件識別到AIP，AIP被磷酸激酶受體識別，激酶中的組氨酸殘基磷酸化，將磷酸化信號傳導到與之對應的轉錄調節(jié)蛋白的天冬氨酸殘基后，最終磷酸化的反應調節(jié)蛋白與DNA特定位點結合，進而調控QS相關基因的表達，形成動態(tài)的交流系統[4]。

2.1.3 AI-2介導的QS系統

AI-2信號系統是在G+和G-中共同存在的一種QS系統，既可用于細菌種內也可用于種間的通訊。AI-2與生物膜形成、細胞運動、結合和毒力因子產生等細菌表型有關[18]，是由LuxS酶在活化甲基循環(huán)中合成的4,5-二羥基-2,3-戊二酮衍生的一系列相互轉化化合物[19]。在該系統中，LuxS蛋白酶調控AI-2的合成，隨著細胞的分裂和增殖，轉運到胞外的AI-2濃度增加，達到某一閾值時會與LuxP受體蛋白結合，從而調節(jié)包括生物膜形成的QS基因表達[20]。

2.2 QS在生物膜形成中的調控作用

生物膜的形成通常通過細胞間的交流或QS來協調[1]。當細菌受到不利外界條件脅迫后，會激發(fā)細胞的環(huán)境信號應答系統，激活細胞內基因表達或改變調控元件轉錄，從而調節(jié)EPS（多糖基質、纖維蛋白等）的合成與釋放，細菌黏附性發(fā)生改變，進而影響生物膜成熟與結構。當黏附細胞達到一定數量時產生信號分子，信號分子濃度積累到閾值時，引起細胞內蛋白質的轉錄和表達，形成生物膜[21-22]。

Davies等[23]描述了lasQS系統在銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中形成生物膜的作用，首次研究了QS與生物膜的關系。P.aeruginosa的lasI缺陷型突變株形成未成熟的生物膜，在添加信號分子3OC12-HSL后，又能重新形成成熟的生物膜[23]。在P.aeruginosa中已知兩套QS調控系統——lasI/lasR、rhlI/rhlR，lasQS系統決定了細菌生物膜的差異性，LasI合酶催化產生的3-oxo-C12-HSL信號分子，可以調控細菌的黏附、游動和細菌生物膜的形成，激活lasI、lasB、lasA、toxA基因的表達；而rhl系統可以通過調節(jié)鼠李糖脂產量維持細菌生物膜的基本結構[24]。研究表明，AHLs介導的QS系統使P.aeruginosaPAO1菌株形成的生物膜釋放eDNA和PA14菌株產生EPS[25]。隨后，研究人員在P.aeruginosa中又發(fā)現了第3套QS調控系統——喹諾酮類假單胞菌信號（Pseudomonasquinolone signal，PQS）系統，該系統以2-烷基-4-喹諾酮（2-alkyl-4-quinolone，AQ）作為信號分子，主要包括2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮和2-庚基-4-羥基喹啉（2-heptyl-4-quinolone，HHQ），PQS的合成由pqsABCDE操縱子和兩個獨立轉錄單元pqsH和pqsL負責[26]。PQS突變菌株會抑制生物膜的形成，降低藻酸鹽、鼠李糖脂等的產量，使生物膜結構變得松散，外源添加信號分子后，可以正常形成生物膜，所以PQS系統對生物膜形成具有重要作用[27]。PQS系統還可以控制eDNA的釋放，可能是因為PQS系統正向調控綠膿菌素的產生，從而誘導H2O2介導的細胞裂解來促進P.aeruginosa中eDNA的釋放[28]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的食源性致病微生物，是G+的代表微生物，它會導致肺炎、心內膜炎、傷口感染和其他并發(fā)癥。S.aureus的QS系統是由信號分子AIP介導的附屬基因調節(jié)因子（accessory gene regulator，Agr）系統，生物膜的形成及毒力因子的產生受此調控。該系統中的agr基因由兩個轉錄單元RNA II和RNA III組成，分別從P2和P3啟動子上啟動轉錄。P2驅動的操縱子包含agrBDCA基因，前體肽agrD經調控蛋白agrB和蛋白酶加工合成AIP，agrC和agrA編碼的轉膜受體組氨酸激酶AgrC和細胞質調控子AgrA組成雙組分傳導系統，AIP與組氨酸激酶AgrC結合后使AgrA發(fā)生磷酸化，通過結合同源DNA序列來調控轉錄重組，導致基因表達的上調或抑制[29]。磷酸化的AgrA還能夠調節(jié)由P3啟動子驅動的RNA III的表達，RNA III是一種參與α-溶血素等外毒素上調的多效性效應因子，而RNA III轉錄是由P3啟動子驅動的，能使編碼生物被膜形成必需基因黏附素的表達下調，并誘導莢膜、毒素以及蛋白酶的產生[30]。RNA III進一步與其靶蛋白TRAP結合，促進S.aureus生物膜生成[31]。AIP和調節(jié)效應器RNA III生成能力缺失影響S.aureus的生物膜形成[32]。酚溶性調節(jié)蛋白（phenol-soluble modulin，PSM）是具有α-螺旋兩親性結構的葡萄球菌肽，具有表面活性劑的特性，是S.aureus形成生物膜的關鍵結構因子，AgrA反應調節(jié)蛋白控制著psm操縱子的轉錄，psm基因的表達促進生物膜的形成，陰礙生物膜分散和再生等過程[32]，而MgrA是psm的負調控因子，通過結合psm啟動子區(qū)域抑制psm在S.aureus生物膜中的轉錄，從而負向調節(jié)生物膜的形成和脫落[33]。

3 QS抑制劑的調節(jié)機制及分類

3.1 QS抑制劑的調節(jié)機制

生物膜的形成會給食品行業(yè)帶來巨大的挑戰(zhàn)。一旦形成生物膜就難以去除，在生物膜內部，細菌可以免受環(huán)境壓力的影響，如對抗生素、消毒劑和高溫等均有耐受性[34]。因此，研究控制生物膜的策略對于食品安全顯得極為重要。QS抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSIs）是一類以QS系統為靶標，干擾細菌生物被膜形成、毒力因子的產生或致病基因表達的物質，被認為是一種抑制生物膜形成的有效方法，通過抑制QS特定基因的表達陰止細胞間通訊，而不是像傳統的消毒劑那樣殺死細菌。因此，開發(fā)新型QSIs成為了當前研究的熱點。據目前報道，QSIs可以通過不同機制調控生物膜的形成，主要包括抑制信號分子合成、酶解信號分子和QS類似物競爭性結合受體蛋白3 種方式。

3.1.1 抑制信號分子合成

QS信號分子主要是底物經過酶的催化合成，因此為了陰斷信號分子的合成，可以通過抑制酶的活性或破壞底物。Chang等[35]測定了水楊酸、單寧酸、反式肉桂醛在0.3 mg/mL時對AHL信號分子產生的效果，結果表明水楊酸只能減少并不能完全抑制信號分子的產生，單寧酸和反式肉桂醛能夠抑制AHL合酶（RhlI）的產生，但不能抑制AHL合酶（LasI）的產生，兩者均對P.aeruginosa沒有抑菌作用，進一步對反式肉桂醛研究發(fā)現，其可以與LasI和RhlI的底物結合位點相互作用，抑制銅綠假單胞菌QS系統關鍵下游基因lasB、rhlA和pqsA的表達，從而影響生物膜形成。Li Tingting等[36]的研究發(fā)現0.5 μL/mL鄰氨基苯甲酸甲酯可以通過干擾AHL的生物合成以及與受體蛋白的競爭性結合來抑制溫和氣單胞菌（Aeromonas aeruginosa）的QS系統，顯著減少了生物膜的形成。Lou Zaixiang等[37]通過研究發(fā)現，2 mg/mL牛蒡葉提取物不僅能夠完全抑制生物膜的形成，還能抑制信號分子3-oxo-C12-HSL的產生，從而干擾了AHL的合成。有研究發(fā)現一種真菌的次級代謝產物——Ambuic Acid，能夠通過抑制AgrB合酶活性來干擾G+AIP的生物合成[38]。另外，蘆丁[39]、檸檬醛[40]等能夠減少AI-2的合成，從而抑制生物膜的形成。

3.1.2 酶解信號分子

在信號分子合成后，還可以使用降解酶水解信號分子，使其在細胞外無法達到臨界閾值濃度，QS系統無法感知信號分子，從而陰止QS系統調控細菌表型。能降解QS信號分子的酶稱為群體猝滅酶（quorum quenching，QQ）。目前研究較多的是AHL降解酶，AHL降解有4 種方式：AHL內酯酶和AHL酰基酶分別水解AHL的高絲氨酸內酯環(huán)和酰胺鍵，AHL氧化酶和AHL還原酶不會降解AHL分子，但會修飾AHL分子并改變其活性[41]。Vinoj等[42]發(fā)現由地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）DAHB1表達的AHL內酯酶（AiiA）具有廣譜AHL底物特異性。純化的重組AiiA能夠降解產生的C6-HSL，也能抑制弧菌屬（Vibriospp.）生物膜的發(fā)育，并顯著降低循環(huán)水產養(yǎng)殖系統中蝦的感染和死亡率。Zhang Bao等[43]發(fā)現芽孢桿菌（Bacillus）QSI-1中的AHL內酯酶基因aiiA，并將其在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中表達。研究發(fā)現，aiiAQSI-1基因能夠降解嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的C6-HSL信號分子，導致細菌游動能力下降，胞外蛋白酶和溶血素毒力因子含量減少，并抑制了A.hydrophilaYJ-1的生物膜形成。同時，Zhang Bao等[43]在飼料中添加AiiAQSI-1蛋白，喂養(yǎng)鯽魚96 h后發(fā)現沒有死亡現象，表明添加AiiAQSI-1蛋白對魚的生存不具有毒性，故可在飼料中添加該蛋白通過群體猝滅控制嗜水氣單胞菌病。

3.1.3 QS類似物競爭性結合受體蛋白

大多數的研究都集中于開發(fā)天然AHL信號分子的類似物，主要是修飾AHL的?；鶄孺溁騼弱ゲ糠?，只有少數研究關注中心酰胺部分的改變，Brackman等[44]合成了酰胺功能被三唑取代的AHL類似物，在此研究中所合成的所有化合物都能夠陰斷QS中的C6-HSL，主要是通過苯基化合物改變酰基側鏈，活性最強的QSI對P.aeruginosa生物膜表現出較強的抑制和清除活性。另外，研究人員對AIP類似物、4,5-二羥基-2,3-戊二酮類似物也有所研究[41]。這些類似物能夠競爭性地與特異性受體蛋白的活性位點進行結合，從而陰斷微生物的QS系統。Cheoljin等[45]合成了11 種QS拮抗劑，發(fā)現10 種新的AHLs類似物或N-磺酰高絲氨酸內酯衍生物被證明可以作為N-(3-氧辛烷?；?-L-高絲氨酸內酯的拮抗劑。通過分子模擬實驗后，發(fā)現疏水相互作用是一個重要的影響因素。Qin Xiaofei等[46]合成了4 種與高絲氨酸γ-內酯結構類似的化合物，并將其命名為TGK系列化合物。TGK系列化合物與TraR蛋白（LuxR的替代物）的結合能力比與天然底物N-(3-氧代辛烷酰基)-L-高絲氨酸內酯（OOHL）的結合能力更強，同時還發(fā)現其與TraR蛋白形成了比3o-C6-HSL更強的疏水相互作用，從而為合成的TGK系列化合物提高群體猝滅活性提供了理論依據。姜辣素是從生姜中提取出的辛辣油，是AHL的結構類似物，Parmar等[47]的研究表明姜辣素是通過氫鍵和疏水相互作用與LuxR發(fā)生拮抗作用，與LuxR的自發(fā)結合可能改變LuxR的構象，使其不能轉錄激活lux操縱子。

3.2 QSIs的分類

3.2.1 天然QSIs

近十幾年來，研究發(fā)現許多天然產品，如食用和藥用植物的精油、草藥、香料及其分離成分，在抑制生物膜的形成方面具有相當大的潛力，甚至能夠破壞食品工業(yè)中已經形成的生物膜，可作為QSIs調控生物膜的形成。

3.2.1.1 植物源QSIs

目前，植物源的QSIs研究最為廣泛，植物產生的次生代謝產物會抑制細菌產生致病性的毒素，抑制其生物膜的形成，具有干擾QS的作用，抗菌活性成分主要是酚類、黃酮、醌類、香豆素等。

精油是從植物的花、葉、莖、根或果實中，通過水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法或溶劑提取法提煉萃取的揮發(fā)性芳香物質。Myszka等[48]研究發(fā)現百里香精油在劑量為10 μL/mL時抑制了紫羅蘭素的產生，降低了熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物膜的黏附性，有效地抑制了P.fluorescens內AHLs的產生，并能顯著抑制細菌的運動，降低鞭毛基因的mRNA水平。Luciardi等[49]用氣相色譜-質譜分析發(fā)現葡萄柚精油中主要含有萜類物質，可以抑制P.aeruginosa中AHLs的產生，進而抑制生物膜的形成，且高質量濃度（4 mg/mL）的葡萄柚精油比低質量濃度（0.1 mg/mL）精油能夠更好地抑制生物膜的形成。L-香芹酮是留蘭香精油的主要成分，Li Tingting等[50]的研究揭示了L-香芹酮在0.5 μL/mL時對生物膜的形成有最好的抑制效果，抑制率達到了52.41%，通過氣相色譜-質譜分析，L-香芹酮能夠顯著抑制哈維氏弧菌（Vibrio Harvei）AHL（C6-HSL和C8-HSL）的產生。此外，在對AHL合酶HalI和QS轉錄調節(jié)因子HalR的計算機分析和實時熒光定量聚合酶鏈式反應的研究中發(fā)現L-香芹酮是通過氫鍵與AHL合酶HalI結合，導致AHL生物合成的中斷。

在香料中也發(fā)現了能夠有效抑制生物膜的天然物質，如肉桂醛、姜黃素等。Nakagawa等[51]研究發(fā)現迷迭香葉中的肉桂酸和肉桂醇是金黃色葡萄球菌agr表達的一種特異性抑制劑，能夠有效抑制S.aureus中的RNA III和psma基因表達。Li Tingting等[52]研究發(fā)現肉桂醛在0.025 μg/mL時就能夠抑制P.fluorescens生物膜的形成。具體來說，肉桂醛通過氫鍵作用與P.fluorescens的LuxR型蛋白競爭性結合，進一步研究發(fā)現其是通過陰止AHLs與其受體蛋白結合，而不是通過抑制AHLs的產生來調節(jié)或抑制QS，可能是通過氫鍵作用與P.fluorescens的LuxR型蛋白結合，起到競爭作用，使導致P.fluorescens的QS系統受到抑制。由于肉桂醛具有良好的安全性，所以它是一種具有發(fā)展前景的QSIs，在水產品保鮮方面的應用具有很大的潛力，以保證食品安全。Srinivasan等[53]研究發(fā)現胡椒乙酸乙酯提取物中主要存在的十六烷酸，可以有效地抑制V.harvei的黏附和微菌落的形成，進而陰礙生物膜的形成，十六烷酸對V.harvei的最小抑菌質量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為1 600 μg/mL，在亞抑菌質量濃度為400 μg/mL時，對QS介導的生物發(fā)光生成和生物膜形成的抑制率分別高達98%和74%。在Shukla等[54]的研究中，姜黃素質量濃度在3 μg/mL時，P.aeruginosa形成的生物膜顯著減少，姜黃素與AHL受體的自發(fā)結合可能改變其構象，使其不能轉錄激活一系列基因，因此，姜黃素是一類有效的QSIs。

在一些蔬菜、谷物中，研究人員發(fā)現大麥芽堿、玉米黃質等物質能抑制生物膜形成。G?kals?n等[55]的研究表明玉米黃質在12 μmol/L濃度下即能抑制P.aeruginosaQS系統，是比地衣次生代謝物Everonic Acid更好的抑制劑，對las和rhlQS系統均表現出顯著的QS抑制作用。Zhou Jinwei等[56]首次發(fā)現發(fā)芽大麥中的大麥芽堿能夠抑制P.aeruginosa的QS，在0.5～1.0 mg/mL質量濃度范圍內，顯著抑制AHL的合成，QS相關基因lasI、lasR、rhlI和rhlR的表達被顯著抑制。Ouyang等[57]研究發(fā)現16 mg/mL的槲皮素就能顯著抑制P.aeruginosa中l(wèi)asI、lasR、rhlI和rhlR的基因表達。QS在調節(jié)生物膜形成和毒力因子產生起著重要作用，因此，槲皮素抑制生物膜形成和毒力因子的產生是通過對QS的影響實現的。

不僅是陸生植物，在海洋植物中也發(fā)現了如呋喃酮類等化合物可以抑制生物膜的形成。Koh等[58]研究了從澳大利亞海藻Delisea pulchra中分離到的呋喃酮類物質，能有效抑制AHL信號分子產生的化合物。呋喃酮類化合物與LuxR型蛋白競爭性結合，從而陰止QS系統的形成，導致無法形成生物膜。Karnjana等[59-60]曾發(fā)現紅藻中的乙醇提取物能夠抑制V.harvei生物膜的形成，進一步分離乙醇提取物得到兩種名為N-芐基肉桂酰胺和α-間苯二甲酸的化合物，體外活性測定表明兩種化合物均能抑制生物膜的形成，且N-芐基肉桂酰胺比α-間苯二甲酸更為有效。

3.2.1.2 動物源QSIs

不僅在植物中具有抑制QS的抗菌活性成分，在一些動物體內也發(fā)現了QS猝滅酶，這可能是動物體對抗其寄生性致病菌的一種防御機制。Dong Yihu等[61]的實驗證明豬腎臟?；D移酶I能夠滅活QS信號分子C6-HSL和3o-C12-HSL，但是不能滅活C4-HSL信號分子。Pejin等[62-63]首次在體外研究了兩種淡水苔蘚蟲——斑點透明蟲Hyalinella punctata和金絲桃蟲Pectinatella magnifica對P.aeruginosaPAO1的抗QS活性，發(fā)現生物乙醇提取液對生物膜的形成有顯著影響；在用0.015 mg/mL和0.03 mg/mL乙醇溶液提取時，生物膜形成量分別減少了59.14%和54.82%。Vadassery等[64]從尼羅河羅非魚胃腸道中分離出AHL降解菌——糞腸球菌（Enterococcus faecalis）QQ12，其在體外能快速降解合成的C6-HSL，對A.hydrophila產生的AHL具有良好的降解能力，能夠很好地抑制A.hydrophila毒力因子。孫夢桐等[65]篩選了來源于魚類腸道中的乳酸菌，研究其對V.harveiQS系統及生物膜形成的抑制作用，其中抑制效果最好的是來自鯉魚腸道的菌株LY3-1，當乳酸菌菌液粗提物質量濃度為16 mg/mL時，可完全降解AHLs信號分子，生物膜抑制率達90.6%。Meto等[66]的研究發(fā)現蜂交也具有干擾QS系統的活性，分別用乙醇、丙二醇、聚乙二醇400對蜂交進行提取，并用高效液相色譜-電噴霧質譜聯用對所提取的多酚類化合物進行了鑒定。乙醇提取物在抑制微生物生長和生物膜形成方面最有效，其次是丙二醇和聚乙二醇400蜂交提取物。蜂交中的多酚類乙醇提取物中會導致P.aeruginosa中eDNA的釋放和吩嗪的生成減少。

3.2.1.3 微生物源QSIs

微生物來源的QSIs主要是在細菌、真菌中，其中來源于放線菌的較少。微生物的培養(yǎng)具有高效性，對QSIs的開發(fā)具有重要意義。微生物在自然環(huán)境中長期進化，與其他生物存在競爭關系，為了生存可能會產生QSIs抑制其他競爭性細菌的QS系統。

Rasmussen等[67]在33 種青霉菌屬Penicillium中發(fā)現了QSIs——棒曲霉素或青霉酸，其可干擾P.aeruginosa的RhlR和LasR受體蛋白。Li Rui等[68]研究發(fā)現類桿菌素作為一種天然抗菌肽，在亞抑菌質量濃度1.7 mg/mL下顯著降低了單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）prfA和flgE的表達，通過抑制生物膜相關基因（prfA、agrA、flaA、fliG和flgE）的表達來抑制生物膜的形成。Parasuraman等[69]發(fā)現淡紫擬青霉海洋真菌（Pestalotiopsis sydowiana）提取物具有有效的抑菌性，該提取物在亞抑菌質量濃度250 μg/mL和500 μg/mL下，能使P.aeruginosaPAO1受QS調控的毒力表型如綠膿桿菌素、幾丁質酶、蛋白酶等的產量有所減少。此外，還能降低胞外多糖、鼠李糖脂和海藻酸鹽的產量，抑制細菌生物膜的形成。

內生真菌普遍存在于各種植物中，Prateeksha等[70]從地衣中分離得到內生真菌（endolichenic fungus，ELF），經過丙醇提取后在4 mg/mL質量濃度下對P.aeruginosaPAO1具有明顯的抗QS活性，但不影響其細胞活力。ELF的代謝提取物中存在的棕櫚酸和亞油酸可能對P.aeruginosaPAO1的毒力因子有抑制作用，對其生物膜形成也有一定的抑制作用。Mishra等[71]從番木瓜中分離到的內生真菌（Alternaria alternata），因其含有一種復合亞硫酸2-丙基十三酯，能對P.aeruginosaPAO1表現出QSI和生物膜結構的改變。還可以通過抑制褐藻酸鹽、EPS的產生和eDNA的分泌，抑制了綠膿桿菌色素、彈性蛋白酶、蛋白酶、幾丁質酶等多種致病性狀，并減少了生物膜的形成。隨后，Meena等[72]又研究了從番木瓜中分離的內生真菌Phomopsis Tersa對QS介導的P.aeruginosaPAO1致病性的抑制作用。結果表明，在亞MIC為900 μg/mL時，Phomopsis Tersa粗提物可使P.aeruginosaPAO1氧化還原活性色素綠青素和吡哆醇的生成量分別減少92.46%和71.55%。此外，粗提物還能抑制與生物膜形成有關的毒力因子胞外多糖和海藻酸鹽的表達。

另外，Wang Mengjia等[73]從一株具有抗QS活性的海洋真菌Cladosporiumsp.Z148中分離到一種新型的QSIs Cladodionen，其可下調QS相關基因的mRNA表達，包括受體蛋白（lasR、rhlR和pqsR）、自身誘導合成酶（lasI、rhlI和pqsA）以及毒力因子（lasB和rhlA）的mRNA表達，抑制生物膜的形成。Younis等[74]從海洋沉積物和土壤樣品中分離的嗜鹽菌——海洋鏈霉菌，該海洋鏈霉菌的次生代謝產物可抑制奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）QS的產生。

3.2.2 人工合成的QSIs

近年來，人工合成的QSIs變得更加廣泛，主要是對信號分子進行修飾、人工合成信號分子類似物、或者是對受體蛋白進行修飾，使信號分子不能與受體蛋白進行結合，從而不能形成QS。

呋喃酮是最常見的QSIs，人工合成的呋喃酮QSIs的研究最為廣泛。邢家溧等[75]研究3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮對P.fluorescens的作用，在質量濃度為1 MIC（12.5 μg/mL）和5 MIC（800 μg/mL）時，對生物膜的抑制率分別為20.59%和99.54%，72 h的生物膜抑制率均高于24 h的抑制率，這就表明通過干擾其QS系統而影響細菌生物膜的形成，能夠抑制P.fluorescens的群集運動能力，干擾其QS系統從而影響其總蛋白合成及多糖的含量，可為在食品中預防或抑制生物膜的形成提供參考。另一項研究發(fā)現，添加了呋喃酮C-30后，可以抑制變形鏈球菌（Streptococcus mutans）生物被膜的形成，使生物膜變薄甚至解體，這與C-30降低了QS調控基因的表達活性有關[76]。Yang Sijie等[77]設計了一個新的溴化呋喃酮類化合物（brominated furanones，BBFs），具有溴代基團的雙環(huán)結構。所有的BBFs均能抑制P.aeruginosa毒力因子LasR的產生，其中6-BBF和7-BBF對lasIQS中的LasR蛋白酶有拮抗作用，而5-BBF對rhlIQS有促進作用，故BBFs的結構變化可以作為控制生物被膜形成的靶向功能。本研究還證明了與其他已知的溴化呋喃酮相比，BBFs對人體細胞的毒性更低，為探索低毒且高效抑制生物膜的化合物奠定了基礎。

Kalaiarasan等[78]研究發(fā)現，N-[4-(4-氟苯胺)丁?；鵠-L-高絲氨酸內酯和N-[4-(4-氯苯胺]丁?；鵠-L-高絲氨酸內酯，可以下調QS基因的表達水平，與LasR以氫鍵結合，使lasQS系統表達顯著降低，影響了生物膜形成。Sully等[79]通過高通量篩選，在多種化合物中發(fā)現一種能夠抑制S.aureus產生毒力因子的QSIs——Savarin，陰礙了該菌的Agr QS系統，從而抑制其形成生物膜，減輕由S.aureus引起的感染。D’Almeida等[80]在合成香豆素及其羥基化衍生物抑制P.aeruginosa和紫色素桿菌（Chromobacterium violaceum）QS產生的研究中發(fā)現，芳香環(huán)上帶有羥基官能團的香豆素比C3、C4上有取代基或者在吡喃酮環(huán)C3、C4上沒有雙鍵的香豆素能更好地抑制P.aeruginosa生物膜形成，吡喃酮環(huán)C3上的羥基在抑制紫色桿菌的群體感應和銅綠假單胞菌的彈性蛋白水解酶活性方面非常重要。Valliammai等[81]證實了5-十二烷醇（5-dodecanolide，DD）對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）的非抗菌生物膜抑制作用。DD處理顯著降低了eDNA的合成、自聚集體、葡萄黃質的生物合成和環(huán)狀生物膜的形成。DD處理可以誘導agrA和agrC的表達，調節(jié)參與生物膜形成的相關基因，有學者利用感染MRSA的線蟲評估了對DD在體內條件下作為一種有效的抗生物膜制劑的潛力，結果表明DD能有效地降低MRSA細胞對線蟲腸道的黏附，證明DD在體內的抗生物被膜潛力。Jiang Kai等[82]合成了一系列以QS轉錄調控蛋白CviR為靶點的惡唑烷酮類化合物ZS-12，對C.violaceumCV026QS具有良好的活性。再以ZS-12為先導化合物，設計合成了18 種3-氨基-2-惡唑烷酮類化合物，初步評價了新型惡唑烷酮化合物對QS的抑制活性。結果表明，其中13 種化合物都對P.aeruginosaPAO1的生物膜形成和毒力因子有抑制作用，其中化合物YXL-13的效果最好。

部分天然QSIs和部分合成QSIs匯總如表1、2所示。

表1 部分天然QSIsTable 1 Some natural QSIs

續(xù)表1

表2 部分合成QSIsTable 2 Some synthetic QSIs

4 結 語

在食品加工生產過程中，由于生產周期長、加工設備復雜，一旦形成了生物膜便難以去除，對食品生產造成了巨大損失。目前研究僅局限于部分細菌QS系統調控生物膜形成的分子機制，但對其復雜多層次的調控網絡還未能完全了解，不同調控系統間的相互影響還需要進一步探究。另外，雖然目前已將QSIs作為新型的控制生物膜的方法，并在一定程度上避免細菌耐藥性的產生，但隨著對食品安全的要求越來越高，仍需要對其安全性及作用機制有更深入的研究，闡明常見食源性微生物QSMs參與生物膜形成的調控機制；同時，尋找來源更廣泛的天然QSIs，實現對生物膜形成的靶向控制，從而保證食品安全。