不同氮效率油菜種質(zhì)苗期氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)與利用差異研究

秦 璐王建強(qiáng)，2韓配配,3 李銀水 顧熾明 胡小加 謝立華 廖 星

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，430062，湖北武漢；2青島清原化合物有限公司，266000，山東青島；3江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，224002，江蘇鹽城）

油菜是我國(guó)重要的油料作物之一，菜籽油占國(guó)產(chǎn)油料作物產(chǎn)油量的57%以上，是第一大食用植物油[1]。油菜的高產(chǎn)依賴于氮肥的大量施用，但隨著施氮量的增加油菜產(chǎn)量并不會(huì)持續(xù)同步增長(zhǎng)。目前，我國(guó)油菜生產(chǎn)的氮肥施用量高達(dá)200～330kg/hm2，是一般禾本科作物的3倍[2]，但其表觀利用率僅為34.0%[3]。這表示每生產(chǎn)100kg油菜籽，需要吸收純氮9～12kg[4]，氮肥利用率低已成為限制我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素。在油菜化肥減施增效的大環(huán)境下，通過(guò)生物學(xué)手段挖掘油菜種質(zhì)資源氮高效潛力是提升氮效率的有效方法之一。前人已經(jīng)對(duì)多種作物氮高效種質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)與篩選[5-8]，開(kāi)展了關(guān)于玉米[9]、小麥[10]和水稻[11]氮高效機(jī)理的研究，為油菜氮高效機(jī)理研究提供了很好的借鑒。但是氮高效機(jī)理涉及的途徑復(fù)雜多樣，前人研究結(jié)果也有差異。鐘思榮等[12]研究了不同基因型煙草氮吸收效率與利用效率的差異，結(jié)果表明氮吸收效率對(duì)氮效率的直接作用均大于氮利用效率，氮高效型煙草氮吸收效率顯著高于氮低效型煙草，而氮利用效率無(wú)顯著差異。陳穎等[13]從氮高效吸收和利用角度對(duì)氮高效機(jī)理進(jìn)行了闡述，著重強(qiáng)調(diào)了根系對(duì)水稻氮高效吸收的重要意義。熊淑萍等[14]對(duì)不同氮效率小麥品種苗期氮吸收同化能力差異的研究表明，氮高效型小麥品種對(duì)NO3－和NH4+的吸收和同化能力均顯著高于氮低效型小麥品種。田飛[15]從氮代謝的角度研究了氮效率差異與油菜種質(zhì)氮同化差異，發(fā)現(xiàn)氮高效油菜種質(zhì)葉片具有較強(qiáng)的硝酸鹽同化能力。

氮高效是作物自身遺傳特性與復(fù)雜環(huán)境共同作用的結(jié)果。Moll等[16]將氮效率分為吸收效率和利用效率，氮吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、同化、利用與再利用等因素均會(huì)影響氮效率的最終表現(xiàn)。目前，對(duì)不同氮效率油菜氮吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用等還缺乏系統(tǒng)的研究。本研究以不同氮效率油菜為試驗(yàn)材料，在不同氮濃度處理下，系統(tǒng)地研究不同氮效率油菜種質(zhì)苗期氮吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用效率的差異，以期為油菜氮高效機(jī)理的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)計(jì)

1.1.1 供試材料 材料為2個(gè)低氮脅迫處理下氮效率差異的甘藍(lán)型油菜種質(zhì)：氮高效種質(zhì)6號(hào)（H6）和氮低效種質(zhì)18號(hào)（L18），以油菜植株生物量、養(yǎng)分累積量和籽粒產(chǎn)量為篩選標(biāo)準(zhǔn)，2個(gè)種質(zhì)是經(jīng)過(guò)2次水培和2次大田試驗(yàn)從350份甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源中篩選獲得[17]。前期研究結(jié)果表明，在低氮脅迫處理下2個(gè)油菜種質(zhì)氮效率存在明顯差異，主要體現(xiàn)在氮利用效率。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以改良后的1/2濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配方為基礎(chǔ)[18]，通過(guò)水培營(yíng)養(yǎng)液設(shè)置正常氮（CK）和低氮（LN）2個(gè)氮濃度處理。CK的氮濃度為9500μmol/L（pH 5.8～6.0），LN氮濃度為CK濃度的1/50，即為190μmol/L。其他養(yǎng)分濃度相同，即LN處理時(shí)去掉的KNO3和Ca(NO3)2里的鉀和鈣，分別用相應(yīng)濃度的K2SO4和CaCl2補(bǔ)充，具體配方見(jiàn)表1。

表1 供試營(yíng)養(yǎng)液配方Table 1 The formula of nutrient solution

水培容器為32cm×24cm×12cm規(guī)格的藍(lán)色聚乙烯塑料面包箱。試驗(yàn)在植物生長(zhǎng)間進(jìn)行，光照時(shí)長(zhǎng)為12h/12h（白天/黑夜），溫度24℃。油菜種子消毒后，用改良的1/4濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液催芽，每個(gè)處理4次重復(fù)。

具體操作如下：催芽前將育苗杯和水培用的周轉(zhuǎn)箱和定植板用0.037%稀鹽酸浸泡，防止青苔生長(zhǎng)，浸泡24h后用清水清洗多遍，防止鹽酸殘留。選取飽滿一致的油菜種子，用蒸餾水浸泡30min后，用5%的NaClO溶液消毒20min，并且將種子用純水沖洗多次后，均勻播于盛有1/4濃度完全營(yíng)養(yǎng)液的育苗杯上育苗，遮光催芽2d后，見(jiàn)光生長(zhǎng)5～7d。待幼苗適宜移栽時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽到盛有不同氮濃度營(yíng)養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱上進(jìn)行培養(yǎng)。每周更換1次營(yíng)養(yǎng)液，換營(yíng)養(yǎng)液時(shí)適當(dāng)分根，防止根系纏繞在一起，同時(shí)保證不能傷根。處理14d后，植株出現(xiàn)明顯缺氮癥狀時(shí)，選取生長(zhǎng)較為一致的幼苗，觀察植株表型，測(cè)定植株生物量以及氮相關(guān)指標(biāo)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 根系表面積 利用掃描儀（EPSON J221A）獲取油菜根系二維圖片，用WinRHIZO根系分析軟件（Pro 2012b）計(jì)算根系表面積。

1.2.2 氮含量 從不同處理中各選取4株生長(zhǎng)較為一致的植株，將根系和地上部分別裝于牛皮紙袋并編號(hào)；在105℃下殺青35min后在75℃下烘干至恒重，并稱重。烘干的植株樣品研磨后，稱取0.1500g置于消化管中，加入少量蒸餾水潤(rùn)濕樣品，加入5mL濃硫酸搖勻后放置過(guò)夜。次日加入3mL（30%）雙氧水，180℃消煮30min左右；待溫度達(dá)270℃時(shí)，重復(fù)上步操作；待溫度達(dá)到360℃時(shí)，再次加入3mL（30%）雙氧水，繼續(xù)消煮直至消化管中液體變透明；冷卻后，過(guò)濾定容至50mL，參照李朝英等[19]的方法用凱氏定氮儀（KDY-9820）測(cè)定氮含量。

依據(jù)Moll等[16]、徐子先[17]和周健民等[20]的方法測(cè)定油菜苗期氮營(yíng)養(yǎng)效率指標(biāo)，按以下公式計(jì)算：

氮累積量=地上部氮含量×地上部干重+根系氮含量×根系干重；氮生理利用效率=生物量/氮累積量；氮效率系數(shù)=LN生物量/CK生物量；轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=地上部氮含量/根系氮含量；根系干物質(zhì)利用效率（單位干物質(zhì)形成的根系表面積）=根系表面積/根系干重；根系氮利用效率（單位氮形成的根系表面積）=根系表面積/根系氮累積量。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；用IBM SPSS Statistics 20.0（LSD法）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)的生物量比較

通過(guò)二因素方差分析（LSD法）對(duì)不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)生物量進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，不同氮濃度處理對(duì)不同氮效率油菜種質(zhì)苗期生物量的影響大于基因型的影響。氮高效種質(zhì)H6和氮低效種質(zhì)L18在CK處理培養(yǎng)14d時(shí)，植株干物質(zhì)累積量無(wú)顯著差異，但是在LN處理下H6生物量顯著大于L18（P＜0.05），為L(zhǎng)18的2.07倍；其中H6地上部干重和根干重分別為L(zhǎng)18的2.28和1.73倍。此外，H6氮效率系數(shù)（LN/CK）為0.42，而L18僅為0.21，表明H6在LN處理下的整體生長(zhǎng)優(yōu)于L18，對(duì)低氮脅迫的耐受性強(qiáng)，表現(xiàn)出低氮脅迫下氮高效的特征。另一方面，二者在CK處理下根冠比無(wú)顯著差異，而在LN處理下根冠比均顯著增加，這表明LN處理下植株把更多的干物質(zhì)分配至根系，供其生長(zhǎng)所需；然而LN處理下L18根冠比增加顯著大于H6（P＜0.05），為H6的1.27倍，而地上部干重僅為H6的43.75%，這表明LN處理下，氮低效種質(zhì)分配到根系的干物質(zhì)增加，相對(duì)增加了根系的生長(zhǎng)，導(dǎo)致分配到地上部的干物質(zhì)減少；相比之下，氮高效種質(zhì)地上部和根系的干物質(zhì)分配更為合理，不僅促進(jìn)了根系生長(zhǎng)，而且相對(duì)維持了地上部的生長(zhǎng)。

表2 不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)生物量及根冠比比較Table 2 Comparison of biomass and root-shoot ratio in rapeseed germplasms with contrasting N efficiency at different N levels

2.2 不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)氮吸收累積量比較

氮效率包括氮的吸收效率和利用效率，眾多研究表明，氮吸收效率在氮高效中扮演著重要的角色。基于培養(yǎng)介質(zhì)供氮量一致，氮吸收效率表征植物對(duì)氮吸收和累積的能力大小，因此，用植株氮累積量來(lái)衡量不同油菜種質(zhì)的氮吸收效率。結(jié)果（圖1）表明，不同氮濃度處理對(duì)不同氮效率油菜種質(zhì)苗期氮累積量的影響大于基因型。在CK處理下，培養(yǎng)14d時(shí)，H6植株整株氮累積量比L18高8.13%，且LN處理加大了二者氮累積量的差異。與L18相比，H6植株總氮累積量顯著增加42.11%。由此可見(jiàn)，氮高效油菜種質(zhì)在低氮脅迫下對(duì)氮的吸收累積能力表現(xiàn)更加突出。從根系氮累積量（圖1）可以看出，在CK處理下，H6根系的氮累積量顯著高于L18，但是地上部無(wú)顯著差異；而在LN處理下，油菜種質(zhì)之間根系氮累積量無(wú)顯著差異。同時(shí)，LN處理下H6地上部氮累積量為L(zhǎng)18的1.88倍，因此，H6分配或轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部的氮相比L18增加更為明顯。綜上所述，H6在正常氮處理和低氮脅迫下均表現(xiàn)出相對(duì)較高的氮吸收累積能力，尤其是LN處理下，顯著高于L18，同時(shí)結(jié)果顯示，氮充足時(shí)，H6根系吸收能力較高，而氮缺乏時(shí)，H6地上部積累的氮更多，說(shuō)明除了吸收能力外，氮高效種質(zhì)對(duì)氮的轉(zhuǎn)運(yùn)效率可能相對(duì)更高。

圖1 不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)氮吸收累積量比較Fig.1 Comparison of N accumulation in rapeseed germplasms with contrasting N efficiency at different N levels

2.3 不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)比較

植物吸收的氮主要由葉片同化，進(jìn)而被植株利用，所以氮的高效轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于氮效率提升具有重要意義。從表3可以看出，在CK處理下培養(yǎng)14d，H6植株氮含量高于L18（P＜0.05），整株氮含量相比L18增加8.38%。而LN處理14d時(shí)，H6植株氮含量顯著小于L18，整株氮含量為L(zhǎng)18的68.74%，其地上部和根系氮含量均顯著小于L18，分別是L18的84.57%和62.08%，但是，H6的氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為L(zhǎng)18的1.37倍，說(shuō)明H6雖然單位干物質(zhì)氮含量低，但是氮從根系向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)能力更強(qiáng)。

表3 不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)氮含量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)比較Table 3 Comparison of N content and transport coefficient in rapeseed germplasms with contrasting N efficiency at different N levels

2.4 不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)氮生理利用效率比較

氮生理利用效率表示植物單位吸氮量所產(chǎn)生的干物質(zhì)或產(chǎn)量，可以直接反映植株對(duì)所吸收氮的利用能力。從圖2看出，在CK條件下，不同氮效率油菜種質(zhì)氮生理利用效率無(wú)顯著差異；在LN處理下，不同氮效率油菜種質(zhì)氮生理利用率均顯著提高，平均提高61.1%；相比而言，H6提高的幅度更為突出，提高了2.02倍；但是L18根系氮生理利用率顯著降低，單位氮形成的根系干物質(zhì)量相對(duì)較低，僅為CK的63.98%。進(jìn)一步分析2個(gè)油菜種質(zhì)地上部和根系氮生理利用率發(fā)現(xiàn)，LN處理下H6地上部和根系的氮生理利用效率均顯著大于CK處理，分別為CK處理的2.46倍和1.76倍；并且H6地上部和根系的氮生理利用效率也顯著大于L18，分別是其1.19倍和1.61倍。綜上所述，與CK處理相比，LN處理氮效率差異種質(zhì)H6和L18地上部氮生理利用率均顯著提高，且H6根系氮生理利用率也顯著提高，而L18根系氮生理利用率顯著降低。因此，氮高效油菜種質(zhì)根系氮的高效利用可能是其氮高效的原因之一。

圖2 不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)氮生理利用效率比較Fig.2 Comparison of nitrogen utilization efficiency in rapeseed germplasms with contrasting N efficiency at different N levels

對(duì)油菜種質(zhì)根系干物質(zhì)利用率和氮利用率分析（表4）可以看出，CK處理下，氮效率差異種質(zhì)H6和L18根系干物質(zhì)利用率無(wú)顯著差異，而LN處理下H6根系干物質(zhì)利用率顯著大于L18（P＜0.05），為L(zhǎng)18的1.22倍；CK處理下，H6和L18根系氮利用率存在顯著差異（P＜0.05），這可能與種質(zhì)自身遺傳特性有關(guān)。在LN處理下，H6根系氮利用率顯著大于CK處理，為CK處理的2.24倍，而L18根系氮利用率僅為CK處理的63.57%。綜上所述，H6 LN處理下單位干物質(zhì)和單位氮可形成較大的根系吸收面積，使根系具有較高的養(yǎng)分吸收能力。因此，LN處理下氮高效種質(zhì)一方面可通過(guò)提高根系碳氮利用能力，形成發(fā)達(dá)的根系；另一方面以有限的碳氮養(yǎng)分形成較大的根系吸收表面積來(lái)提升根系養(yǎng)分吸收能力，這可能是油菜實(shí)現(xiàn)氮高效的關(guān)鍵原因之一。

表4 不同氮濃度處理下氮效率差異油菜種質(zhì)根系干物質(zhì)利用效率和氮利用效率比較Table 4 Comparison of dry weight utilization and N utilization in roots of rapeseed germplasms with contrasting N efficiency at different N levels

3 討論

植物氮效率是一個(gè)非常復(fù)雜的性狀，涉及植物對(duì)氮的吸收、同化、運(yùn)輸、利用和再利用等方面，是自身遺傳和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果[21]。陳二影等[22]研究了不同基因型谷子氮吸收利用基因型差異，發(fā)現(xiàn)不同生態(tài)類型谷子品種的氮吸收和利用效率差異顯著，華北夏谷類型品種之間的氮利用效率差異最大?？锼嚨萚23]研究結(jié)果表明，在低氮和正常供氮條件下，小黑麥的氮利用效率都有較大的基因型差異。不同氮效率小麥品種的研究進(jìn)一步表明氮高效型小麥品種根系對(duì)NO3－和NH4+的吸收和同化能力均顯著高于氮低效型小麥品種[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在正常氮濃度培養(yǎng)條件下，氮效率差異油菜根系氮吸收累積量和根系氮生理利用率同樣存在一定差異，這可能與種質(zhì)自身遺傳特性有關(guān)，前人研究[16]也表明，在氮充足的情況下，植物氮效率的差異主要表現(xiàn)在吸收效率，而根系對(duì)氮的吸收有著重要作用，而氮缺乏時(shí)，氮效率的差異主要在利用效率。本研究同樣表明，低氮脅迫加大了二者氮效率的差異，尤其是對(duì)油菜氮的轉(zhuǎn)運(yùn)與利用產(chǎn)生了更為顯著的影響。

根系是植物吸收養(yǎng)分和水分的主要器官，也是最先感知根際環(huán)境條件變化的器官，為了適應(yīng)外界環(huán)境變化根系會(huì)表現(xiàn)出極強(qiáng)的可塑性[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，氮效率差異種質(zhì)根系生物量表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，氮高效種質(zhì)根系生物量在正常氮和低氮處理間無(wú)顯著差異，而氮低效種質(zhì)根系生物量在低氮脅迫處理下顯著降低。熊淑萍等[14]對(duì)小麥根系吸收特性與氮利用差異的分析研究表明，較高的根系生物量和根系總吸收面積能促進(jìn)根系對(duì)氮的吸收，是氮高效的基礎(chǔ)，合理的根冠比能促進(jìn)作物對(duì)氮的高效利用，是氮高效的關(guān)鍵，這與本研究結(jié)果類似。王艷等[26]研究表明，玉米苗期根系形態(tài)直接與氮吸收效率相關(guān)，根系形態(tài)對(duì)氮的高效吸收具有重要作用，尤其是氮脅迫條件下。崔文芳等[27]對(duì)雜交玉米氮高效的研究中進(jìn)行了氮吸收效率和利用效率對(duì)氮效率貢獻(xiàn)的通徑分析，結(jié)果表明氮吸收效率對(duì)氮效率的貢獻(xiàn)大于氮利用效率，更加突出了氮吸收效率的重要性。在本研究中氮效率差異油菜種質(zhì)在低氮脅迫處理下根冠比均顯著增加，同樣說(shuō)明油菜低氮脅迫下優(yōu)先促進(jìn)根系生長(zhǎng)，增強(qiáng)養(yǎng)分吸收能力，這與前人的研究結(jié)果較為一致。

此外，從本研究結(jié)果可以看出，與正常氮濃度相比，不同氮效率油菜在低氮脅迫處理下植株氮含量均不同程度地降低，但是氮高效種質(zhì)氮轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著增加，而氮低效種質(zhì)顯著減小，這表明低氮脅迫下，氮高效種質(zhì)氮由根系轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部的能力提高，而氮低效種質(zhì)氮轉(zhuǎn)運(yùn)能力相對(duì)較差。韓永亮[28]對(duì)不同氮效率油菜硝態(tài)氮長(zhǎng)距離運(yùn)輸和短途分配差異研究表明，正常供氮水平下，氮高效型油菜有更多的硝態(tài)氮被運(yùn)輸?shù)街参锏牡厣喜糠謪⑴c同化。同時(shí)Hajari等[29]對(duì)甘蔗氮高效研究同樣發(fā)現(xiàn)，氮高效型甘蔗中的硝態(tài)氮從根部到地上部的轉(zhuǎn)移率較高。因此，高效的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)能力可能是低氮脅迫下油菜氮高效的一個(gè)重要原因。

本研究結(jié)果顯示，與CK相比，LN處理下氮高效油菜種質(zhì)根系干物質(zhì)利用率、根系氮利用率和氮生理利用率均顯著提高，而氮低效油菜種質(zhì)根系氮生理利用率顯著降低，說(shuō)明氮高效油菜種質(zhì)對(duì)吸收的氮具有高效的同化、分配和利用能力。前人研究[30-31]也發(fā)現(xiàn)氮高效作物葉片谷氨酰胺合成酶具有較高的活性，有利于氨基酸和蛋白質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)化。Hirel等[32]研究表明，超表達(dá)谷氨酰胺合成酶基因（GS）可以提高小麥的籽粒產(chǎn)量。這也說(shuō)明氮高效作物在氮的利用方面具有一定優(yōu)勢(shì)。因此，低氮脅迫下高效的氮同化和利用對(duì)于油菜氮高效同樣起著較為重要的作用。目前，對(duì)油菜氮高效機(jī)理研究而言，氮吸收效率和氮利用效率對(duì)氮效率的決定作用尚無(wú)統(tǒng)一的結(jié)論，需要進(jìn)行更加細(xì)致深入的研究。

4 結(jié)論

油菜氮高效是自身遺傳潛力與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，在正常氮濃度條件下供試油菜種質(zhì)苗期氮效率存在一定的差異，表現(xiàn)為氮高效油菜種質(zhì)根系氮吸收累積量大于氮低效種質(zhì)，而低氮脅迫加大了不同氮效率油菜種質(zhì)在氮吸收累積、轉(zhuǎn)運(yùn)及利用方面的差異。二因素方差分析（LSD法）表明，不同氮濃度處理對(duì)苗期油菜氮效率的影響大于基因型本身，低氮脅迫下除去種質(zhì)自身遺傳因素的影響，氮效率差異種質(zhì)氮吸收能力均降低，而氮轉(zhuǎn)運(yùn)和利用能力提高。但是，低氮脅迫下氮高效油菜種質(zhì)的氮吸收累積量、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)和利用效率均顯著大于氮低效種質(zhì)。綜上所述，低氮脅迫下，氮高效種質(zhì)在苗期可通過(guò)提升氮的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用效率綜合來(lái)實(shí)現(xiàn)油菜氮高效。