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    加味六安煎對咳嗽變異性哮喘模型豚鼠白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-13水平及氣道重塑相關(guān)基因表達(dá)的影響

    2021-09-26 08:05:52張寧寧吳力群陳海鵬霍婧偉徐方蔚廖欣婷李盼盼路晨陳宇航
    環(huán)球中醫(yī)藥 2021年9期
    關(guān)鍵詞:六安豚鼠特鈉

    張寧寧 吳力群 陳海鵬 霍婧偉 徐方蔚 廖欣婷 李盼盼 路晨 陳宇航

    咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma,CVA)是一種以咳嗽為主要或唯一臨床表現(xiàn)的特殊類型的哮喘,是中國兒童慢性咳嗽的主要原因[1]。本病兒童雖無明顯喘息、氣促等表現(xiàn),常因遇冷空氣或者運動后加劇,反復(fù)發(fā)作,若不及時治療易發(fā)展為哮喘,嚴(yán)重影響患兒的學(xué)習(xí)生活和身心健康。加味六安煎是臨床治療兒童咳嗽的有效方劑[2],課題組前期通過大鼠實驗研究發(fā)現(xiàn),本方可通過調(diào)整CVA大鼠模型體內(nèi)的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)及白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-5水平從而減輕炎性細(xì)胞浸潤及水腫程度,減輕咳嗽次數(shù)[3]。同時通過調(diào)整基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9)與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1, TIMP-1) MMP-9/TIMP-1的平衡從而有效減輕氣道重塑[4]。本實驗擬通過加味六安煎對CVA豚鼠模型血清及支氣管肺泡灌洗液(brocho-alveolar larage fluid, BALF)中IL-4、IL-13水平及氣道重塑相關(guān)基因轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討其治療CVA的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    選用健康4周齡純系雄性豚鼠30只,清潔級,體質(zhì)量250~300 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。許可證號:SCXK(京2016-0011)。

    1.2 實驗藥品

    加味六安煎藥物組成:法半夏6 g、橘紅6 g、茯苓6 g、杏仁6 g、白芥子6 g、甘草3 g、海浮石20 g、葶藶子6 g、瓜蔞10 g、膽南星4 g、炒萊菔子10 g,低、中、高劑量組分別配制成濃度為0.74 g/mL、1.48 g/mL、2.22 g/mL的溶液。藥物由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室制備;孟魯司特鈉(杭州默沙東制藥有限公司產(chǎn)品,規(guī)格:4 mg/片),用生理鹽水制成混懸液,于4℃冰箱保存。藥品由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房及康仁堂藥業(yè)提供;卵蛋白(ovalbumin,OVA)(批號: 421C033, Solarbio公司);氫氧化鋁(批號: 20131125,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);辣椒素(純度>95%,批號: P12D9S77366, 源葉生物有限公司)。

    1.3 造模與分組

    將30只健康豚鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組,每組5只。正常對照組、CVA模型組、孟魯司特鈉組、加味六安煎低劑量組、加味六安煎中劑量組、加味六安煎高劑量組。采用OVA和氫氧化鋁激發(fā)致敏并用OVA激發(fā)的方法復(fù)制CVA模型豚鼠。正常飼養(yǎng)3天后開始實驗,除正常對照組外,其余各組均在第1、8天每只豚鼠腹腔注射10%OVA和氫氧化鋁混合溶液1 mL致敏。從第15天起,模型組及各給藥組豚鼠置于密閉有機(jī)玻璃罩內(nèi),給予含1%OVA 溶液的生理鹽水超聲霧化激發(fā)2分鐘,每天一次,共10天。激發(fā)時觀察豚鼠反應(yīng), 如出現(xiàn)咳嗽、豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔、腹肌抽動、極度煩躁等現(xiàn)象中兩種或兩種以上者,或抽搐、虛脫現(xiàn)象之一者,判定為造模成功。

    1.4 給藥方法與劑量

    各組給藥劑量按人與豚鼠體表面積換算公式計算。激發(fā)之日起,即從實驗的第15天開始,用霧化器激發(fā)前30分鐘,各組分別灌胃給藥干預(yù),共治療10天。正常對照組:不作處理。CVA模型組:灌服生理鹽水1.7 mL·100 g-1·d-1,每日1次。孟魯司特鈉組:灌服孟魯司特鈉混懸液1.2 mg/kg,每日1次。加味六安煎低劑量組:灌服低濃度加味六安煎溶液,1.7 mL·100 g-1·d-1,每日1次。加味六安煎中劑量組:灌服中濃度加味六安煎溶液,1.7 mL·100 g-1·d-1,每日1次。加味六安煎高劑量組:灌服高濃度加味六安煎溶液,1.7 mL·100 g-1·d-1,每日1次。加味六安煎低、中、高劑量組分別配制成濃度為低濃度(0.74 g/mL)、中濃度(1.48 g/mL)、高濃度(2.22 g/mL)的溶液,分別相當(dāng)于體重70 kg成人用量的5倍、10倍、15倍。連續(xù)灌胃10天。第26天,取左側(cè)肺上葉組織做病理和免疫組化檢測。

    1.5 一般狀態(tài)觀察

    觀察各組豚鼠的飲食、飲水、睡眠、毛發(fā)及活動等,測量豚鼠的體質(zhì)量、飲食等,觀察豚鼠的死亡只數(shù)及死亡時間。在造模藥物干預(yù)的過程中,模型組一只豚鼠在霧化過程中發(fā)生喘息及痙攣一次,予硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑干預(yù)后好轉(zhuǎn)。各組豚鼠的飲食及飲水狀況良好,毛發(fā)顏色光亮,正常對照組精神狀態(tài)最佳。模型組及各治療組因均予藥物致敏及霧化吸入干預(yù),霧化過程中可聞及不同程度的咳嗽,其中以模型組咳嗽次數(shù)最多且咳聲響亮。各組豚鼠體質(zhì)量較均勻。

    1.6 標(biāo)本采集

    豚鼠予10 mg/kg水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉,腹主動脈取血,將豚鼠處死,夾板固定后打開胸腔,行氣管插管術(shù)后結(jié)扎右肺,使用PBS溶液分3次行支氣管肺泡灌洗,每次2 mL PBS溶液,并回收BALF,隨即快速結(jié)扎左側(cè)肺門,取左側(cè)肺上葉組織立刻置于凍存管內(nèi),迅速移入-80℃液氮凍存。

    1.7 ELISA法檢測血清及BALF中IL-4及IL-13水平

    股動脈取血5 mL,以3000 r/分鐘,離心10分鐘,分離血清;以3000 r/分鐘,離心后留取上清液置-20℃凍存。按照相關(guān)試劑盒提供方法操作。

    1.8 Real time-PCR法檢測肺組織及BALF中TGF-β mRNA及MMP-9 mRNA的表達(dá)。

    將樣本分別用液氮研磨粉碎,加入1 mL Trizol(invitrogen),吸取到1.5 mL EP管中,加入500 μL酚氯仿,振蕩混勻,靜止5分鐘,置于離心機(jī)中于4℃離心十分鐘,小心吸取上層上清于一新的離心管中,加入700 μL異丙醇,混勻,于4℃12000 rpm離心10分鐘,小心去上清,用75%乙醇洗滌一次,晾干,溶于50 μL DEPC處理水中,電泳檢測提取總RNA。使用核酸濃度測定儀測定RNA濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄使用invitrogen的反轉(zhuǎn)錄試劑盒superscript III。Real time PCR反應(yīng)體系建立后,將其混勻,瞬離,置于熒光定量PCR儀上,進(jìn)行反應(yīng)及循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線,每個樣本分別用待檢測基因和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增,每個反應(yīng)重復(fù)3次。引物信息:actin:上游引物5’-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3’,下游引物 5’-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3’;TGF-β:上游引物5’-GTCCTTGCCCTCTACAACCAAC-3’,下游引物5’-CTGCTCCACCTTGGGCTTG-3’;MMP-9:上游引物5’-GTAACCCTGGTCACCGGACT-3’,下游引物5’-GTAACCCTGGTCACCGGACT-3’。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計算。

    1.9 膠原面積及膠原沉積率檢測

    處死豚鼠后取出肺組織放入10%甲醛中固定,石蠟包埋,切片,Masson染色。

    肺組織常規(guī)Masson染色后,采用Image J圖像處理軟件分子各組肺組織膠原纖維表達(dá),并計算膠原面積、組織總面積及膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF),CVF=膠原面積/組織總面積×100%。

    1.10統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 加味六安煎對CVA模型豚鼠血清及BALF中IL-4水平的影響

    血清:與正常對照組相比,模型組IL-4水平降低(P<0.05);與模型組相比,孟魯司特鈉組IL-4呈升高趨勢,但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),加味六安煎各劑量組IL-4水平升高(P<0.05);各治療組間無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

    BALF:與正常對照組相比,模型組IL-4水平降低(P<0.05);與模型組相比,孟魯司特鈉組IL-4呈升高趨勢,加味六安煎各劑量組呈降低趨勢,但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);各治療組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

    2.2 加味六安煎對CVA模型豚鼠血清及BALF中IL-13水平的影響

    血清:與正常對照組相比,模型組IL-13水平升高(P<0.05);與模型組相比,孟魯司特鈉組呈降低趨勢,但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),加味六安煎各治療組IL-13水平均降低(P<0.05);與孟魯司特鈉組相比,加味六安煎各劑量組IL-13水平降低(P<0.05);加味六安煎各劑量組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

    BALF:與正常對照組相比,模型組IL-13水平升高(P<0.05);與模型組相比,孟魯司特鈉組IL-13呈降低趨勢,但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),加味六安煎各治療組IL-13水平均降低(P<0.05);與孟魯司特鈉組相比,加味六安煎各劑量組IL-13水平降低(P<0.05);加味六安煎各劑量組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

    表1 各組CVA模型豚鼠血清及BALF中IL-4、IL-13水平比較

    2.3 加味六安煎對CVA模型豚鼠肺組織及BALF中TGF-β及MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

    2.3.1 TGF-β mRNA的表達(dá) 肺組織:與正常對照組相比,模型組中的TGF-β mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組相比,孟魯司特鈉組呈降低趨勢,但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),加味六安煎各治療組TGF-β mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05);與孟魯司特鈉組相比,加味六安煎各劑量組TGF-β mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);加味六安煎各劑量組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。BALF:與正常對照組相比,模型組中的TGF-β mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組相比,各治療組TGF-β mRNA表達(dá)水平均減低(P<0.05),各治療組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

    2.3.2 MMP-9 mRNA的表達(dá) 肺組織:與正常對照組相比,模型組中的MMP-9 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);各治療組MMP-9 mRNA表達(dá)水平均減低(P<0.05),各治療組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。BALF:與正常對照組相比,模型組中的MMP-9 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組相比,孟魯司特鈉組呈降低趨勢,但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),加味六安煎各治療組MMP-9 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05);與孟魯司特鈉組相比,加味六安煎各劑量組MMP-9 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);加味六安煎各劑量組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

    表2 各組CVA模型豚鼠血清及BALF中TGF-β mRNA及MMP-9 mRNA表達(dá)的比較

    2.4 加味六安煎對CVA模型豚鼠氣道重塑程度的影響

    2.4.1 膠原面積 經(jīng)單因素方差分析,F(xiàn)=15.826,P<0.01(P=0.000),可以認(rèn)為6組豚鼠膠原面積不完全相同。與正常對照組相比,模型組膠原面積明顯增加(P<0.05);與模型組相比,孟魯司特鈉組及加味六安煎各劑量組膠原面積減小,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與孟魯司特鈉組相比,加味六安煎各劑量組膠原面積均有不同程度的減小,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),加味六安煎各劑量組組間相比無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

    2.4.2 組織總面積 經(jīng)單因素方差分析,F(xiàn)=1.343,P=0.280(P>0.05),6組豚鼠組織總面積無顯著性差異。見表3。

    2.4.3 膠原容積分?jǐn)?shù) 經(jīng)單因素方差分析,F(xiàn)=21.699,P<0.01(P=0.000),可以認(rèn)為6組豚鼠CVF不完全相同。與正常對照組相比,模型組CVF明顯升高,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,孟魯司特鈉組及加味六安煎各劑量組CVF均有不同程度降低(P<0.05);與孟魯司特鈉組相比,加味六安煎各劑量組CVF均有不同程度降低(P<0.05);加味六安煎各劑量組之間無顯著性差異(P>0.05)。見表3及圖1。

    表3 各組CVA模型豚鼠膠原面積、組織總面積及CVF比較

    3 討論

    在中醫(yī)學(xué)中,CVA多被歸為“風(fēng)咳”“哮咳”范疇,病位在肺,病因多責(zé)之于風(fēng)、痰、虛、瘀,中醫(yī)藥治療本病具有較好的優(yōu)勢[5]?;谛悍纹⒉蛔愕纳硖攸c,課題組認(rèn)為肺脾氣虛、痰飲伏肺為本病的基本病機(jī)。小兒肺常不足,衛(wèi)外不固,腠理疏松,易為外邪侵襲,故而往往內(nèi)外相合而為病。加味六安煎全方由法半夏、橘紅、茯苓、杏仁、白芥子、甘草、海浮石、葶藶子、瓜蔞、膽南星、炒萊菔子組成,清熱瀉肺,健脾化痰。本病往往反復(fù)發(fā)作,遷延不愈,所謂“久病入絡(luò),痼病必瘀”,正如唐容川在 《血證論》中提出 “一切不治之癥,終以不善祛瘀之故……瘀血內(nèi)蓄可使久病纏綿不愈”,故而加桃仁、地龍、丹參等活血通絡(luò)之品,臨證辨治顯效。有研究表明,活血化瘀法可以通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)從而調(diào)節(jié)新生血管的生成[6]。同時有臨床研究表明,CVA患兒的VEGF表達(dá)水平明顯升高,增加了血管的通透性,影響著細(xì)胞外基質(zhì)的改變,進(jìn)而影響CVA患兒的氣道重塑[7]。故而CVA氣道重塑與“瘀”密切相關(guān),在治療本病時,活血化瘀通絡(luò)法當(dāng)?shù)玫街匾暋?/p>

    注:A 正常對照組;B 模型組;C 孟魯司特鈉組;D 加味六安煎低劑量組;E 加味六安煎中劑量組;F 加味六安煎高劑量組。

    雖然本病的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確,但與哮喘有共同的病理基礎(chǔ),其中氣道炎癥和氣道重塑是兩個重要方面。IL-4及IL-13是導(dǎo)致本病氣道炎癥的重要因子。IL-4由T淋巴細(xì)胞亞群Th2及嗜酸性粒細(xì)胞分泌,位于易引起哮喘發(fā)生的核酸區(qū)段(5q31-5q33和5q23-5q31)[8],可以通過轉(zhuǎn)錄Fc RII mRNA,從而表達(dá)Fc RII,進(jìn)而合成IgE,可以介導(dǎo)肥大細(xì)胞、B細(xì)胞增殖,促進(jìn)IgM向IgE轉(zhuǎn)換,聯(lián)合集落刺激因子表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子,從而促進(jìn)氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥浸潤和損傷[9],是導(dǎo)致本病慢性炎癥的重要細(xì)胞因子之一,對于調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫應(yīng)答具有重要的作用[10]。本次研究發(fā)現(xiàn)CVA模型組豚鼠的血清及BALF中IL-4水平低于正常對照組,加味六安煎低、高劑量組血清IL-4水平有所升高。似乎與既往多數(shù)研究矛盾,這可能與多種因素相關(guān)。第一,CVA相當(dāng)于哮喘的隱匿期,從激發(fā)造模即日至給藥治療干預(yù),CVA豚鼠可能處于“平穩(wěn)期”,此時期的IL水平紊亂程度較輕,可能與正常對照組相當(dāng)。豚鼠對于致敏原的敏感性較高,在以后的實驗研究中,考慮以給藥為時間節(jié)點,對CVA豚鼠的急性激發(fā)狀態(tài)和“平穩(wěn)期”的IL-4水平進(jìn)行比較。第二,可能與樣本采集有關(guān),本次研究發(fā)現(xiàn)CVA模型組BALF中的IL-4水平較血清中的水平高,在激發(fā)狀態(tài)下,炎癥因子聚集于肺組織局部,氣道白介素水平可能異常,而外周血中特異性炎癥細(xì)胞水平下降。從而血清中IL-4水平下降。隨著時間的推移,炎癥因子逐漸擴(kuò)散到外周血液循環(huán)中,故可能會有所升高。與CVA模型組相比,加味六安煎各劑量組BALF中的IL-4水平雖無統(tǒng)計學(xué)差異,但均呈降低趨勢,由此可見IL-4在CVA模型豚鼠局部肺組織的含量與外周血中的含量存在明顯的差異,且經(jīng)治療后BALF中的IL-4水平降低程度比血清更明顯。此外,培養(yǎng)條件、時間等多種條件也可能是影響IL檢測的因素。IL-13是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生,是參與氣道炎癥反應(yīng)的中藥細(xì)胞因子[11]。同時,既往有研究[12-13]表明,IL-13是重要的誘導(dǎo)黏液分泌的上游細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等趨化,促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE,從而刺激氣道上皮杯狀細(xì)胞分泌黏液,并可以誘導(dǎo)支氣管平滑肌細(xì)胞分泌VEGF[14],在氣道重塑的過程中也發(fā)揮著重要的作用。在本研究中,CVA模型組的IL-13的水平較正常對照組明顯升高,與既往研究具有一致性,由此可見IL-13對CVA氣道黏液分泌程度及氣道重塑程度有重要的影響。經(jīng)過給藥治療后,孟魯司特鈉組IL-13水平與模型組無顯著性差異,加味六安煎各劑量組IL-13水平較模型組及孟魯司特鈉組降低,由此可見加味六安煎對IL-13水平的降低程度較孟魯司特鈉組明顯,其中以加味六安煎中劑量組降低最明顯。

    氣道重塑在慢性氣道炎癥的基礎(chǔ)上,隨著炎癥的遷延和反復(fù)加重,在多種炎癥細(xì)胞及其釋放出的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的作用下,氣道上皮發(fā)生基底膜增厚、腺體肥大增生、平滑肌增生肥厚和新血管形成等病理改變。TGF-β、MMP-9是氣道重塑重要生物標(biāo)志物[15]。MMP-9屬于細(xì)胞外蛋白酶家族,可以降解細(xì)胞外基質(zhì),同時又可以促進(jìn)氣道平滑肌的增殖,并促進(jìn)上皮細(xì)胞分泌TGF-β。TGF-β是一種促纖維細(xì)胞生長因子,可引起氣道上皮纖維化,平滑肌增生,微血管改變,黏液分泌增加。本次研究發(fā)現(xiàn)模型組肺組織及BALF中TGF-β mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平升高,加味六安煎可以降低二者的表達(dá),基本與既往研究相符。

    膠原沉積增加是氣道重塑的重要病理表現(xiàn)[16]。在本次研究中,CVA模型組的膠原面積和CVF較正常對照組增加,各治療組的膠原面積及CVF均有降低,且加味六安煎各劑量組的膠原面積及CVF均較孟魯司特鈉組有不同程度的降低,提示加味六安煎對于CVA豚鼠氣道重塑的改善程度優(yōu)于孟魯司特鈉組?;A(chǔ)數(shù)據(jù)比較,加味六安煎中劑量組對膠原面積及CVF的減低程度最明顯。既往本課題組對CVA模型Wistar大鼠進(jìn)行了初步研究[17],發(fā)現(xiàn)各治療組間對于膠原沉積程度的改善程度無統(tǒng)計學(xué)差異,加味六安煎各劑量組組間比較,高劑量組對于膠原沉積的改善情況最明顯,這可能與Wistar大鼠與豚鼠對治療藥物的敏感性差異有關(guān),由此可見CVA模型豚鼠比CVA模型Wistar大鼠對治療藥物更敏感。

    綜上,加味六安煎治療CVA可能通過調(diào)節(jié)IL-4和IL-13水平,進(jìn)而調(diào)整Th1/Th2的平衡狀態(tài),減輕氣道炎癥程度;并通過調(diào)節(jié)TGF-β mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá),減輕氣道膠原沉積狀態(tài),進(jìn)而改善氣道重塑。

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